Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55708

⸱

18 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Seoul National University, 2College of Pharmacy and Institute of Pharmaceutical Science and Technology, Hanyang University

В этой статье

Краткое содержание

Конкурентные тесты пептидов широко используются в различных молекулярных и иммунологических экспериментах. В этом документе описывается подробный метод анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ и соответствующие процедуры валидации, которые могут быть полезны для поиска специфических сайтов фосфорилирования.

Аннотация

Фосфорилирование белков в определенных местах определяет его конформацию и взаимодействие с другими молекулами. Таким образом, фосфорилирование белка влияет на биологические функции и характеристики клетки. В настоящее время наиболее распространенным методом обнаружения сайтов фосфорилирования является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС), быстрый и чувствительный метод. Однако относительно лабильные фосфатные фрагменты часто высвобождаются из фосфопептидов во время стадии фрагментации, что часто приводит к ложноотрицательным сигналам. В таких случаях традиционный анализ киназы in vitro с использованием сайт-направленных мутантов был бы более точным, но этот метод является трудоемким и трудоемким. Поэтому альтернативный способ с использованием пептидной конкуренции может быть предпочтительным. Установлен мотив консенсусного распознавания 5'-аденозинмонофосфат-активированной протеинкиназы (AMPK) 1 и он был подтвержден с помощью библиотеки позиционного сканирующего пептида assAy 2 . Таким образом, сайты фосфорилирования AMPK для нового субстрата могут быть предсказаны и подтверждены с помощью конкурентного анализа пептидов. В этом отчете мы описываем подробные этапы и процедуры анализа in vitro- олигопептид-конкурирующих киназ, иллюстрируя AMPK-опосредованное фосфорилирование эритроидного фактора 2 (Nrf2), связанного с эритроидным фактором фактора II. Для аутентификации сайта фосфорилирования мы проводили последовательный анализ киназы in vitro с использованием сайт-специфического мутанта. В целом, конкурентный анализ пептидов дает способ скрининга нескольких потенциальных сайтов фосфорилирования и идентификации сайтов для валидации с помощью мутантов сайта фосфорилирования.

Введение

Фосфорилирование белка у конкретного остатка играет значительную роль в широком диапазоне клеточных процессов. Таким образом, понимание сигнальных сетей требует идентификации конкретных сайтов фосфорилирования. Кроме того, сайт фосфорилирования определяет влияние на функцию белка, поскольку отдельные домены в пределах белка обладают различными структурами и функциями. Активность фактора фактора 2 эритроидного фактора 2 (Nrf2) ядерного фактора, ключевого антиоксидантного транскрипционного фактора, регулируется двунаправленным образом посредством фосфорилирования в разных местах. Наши исследования были сосредоточены на киназах, которые катализируют фосфорилирование Nrf2. Реакция стресса Nrf2 против окислительного заражения происходит быстро, главным образом за счет фосфорилирования на серине 40 и опосредованного протеинкиназой C (PKC) -δ, которая активирует Nrf2 3,4 . Напротив, Fyn катализирует тормозное фосфорилирование Nrf2 при тирозине 568 для строгого контроля за деятельностью 5 .

Наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения сайтов фосфорилирования, является анализ методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии (ЖХ / МС). Быстрые и высокочувствительные данные картирования сайта фосфорилирования могут быть получены таким образом; Однако он имеет несколько технических ограничений, часто генерирующих ложноотрицательные сигналы. Плохое покрытие последовательностей часто происходит при анализе ЖХ / МС. Для идентификации сайтов фосфорилирования требуется информация о максимальном покрытии белками аминокислот 6 . Протеолиз белка, представляющего интерес, с несколькими протеазами во время стадии пищеварения может помочь в улучшении охвата последовательностей. Другим препятствием для идентификации остатков фосфорилирования является легкая потеря фосфорной кислоты, которая часто наблюдается для сериновых и треонинфосфорилированных пептидов 6 , 7 . Лабильные фосфатные группы частоВысвобождается из фосфопептидов в процессе фрагментации 7 . Второй вариант при поиске сайтов фосфорилирования заключается в использовании пептидного микроматричного метода. Возможно проводить скрининг на целевые сайты киназ с использованием чипа микрочипов, содержащего пептидные фрагменты, полученные из представляющего интерес белка. Однако из-за требований к оборудованию для производства и обнаружения микрочипов, метод пептидных микроматриц считается отнимающим много времени и дорогостоящим.

Для преодоления этих трудностей для протеинкиназы с известными мотивами распознавания может быть использован анализ in vitro -конкурирующих киназ in vitro . Если устанавливается мотив консенсусного распознавания киназы, предполагаемые сайты фосфорилирования субстрата-кандидата могут быть предсказаны, и аутентичность сайтов может быть подтверждена. Наиболее убедительным методом для этой процедуры является показать отмену фосфорилирования в мутантном белке, в котором предикатD остаток замещен нефосфорилируемой аминокислотой ( т.е. серин или треонин-аланин, тирозин-фенилаланин). Однако производство и выделение мутантных белков требует много времени. В качестве альтернативы на начальном этапе исследования конкурентный тест пептид-киназы является простым и удобным. Здесь мы опишем протокол для конкурентного анализа пептида in vitro и для проверки сайта фосфорилирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Безопасность

ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует [γ- 32 P] -ATP для оценки активности AMPK. Фосфор-32 является радиоактивным изотопом, в значительной степени испускающим бета-излучение. Поскольку размер бета-частицы чрезвычайно мал, он может легко проникать сквозь одежду и кожу. Как внешнее, так и внутреннее воздействие бета-излучения может нанести вред здоровью человека, в том числе вызвать ожоги кожи и повреждение тканей.

  1. Выполните все шаги, которые требуют использования [γ- 32 P] -ATP, используя надлежащую защиту, такую ​​как акриловое экранирование.
  2. Убедитесь, что весь персонал оснащен электронными персональными дозиметрами (EPD) для контроля степени воздействия вредного излучения во время всех процедур.
  3. Обрабатывать излучение с открытым источником только после соответствующей подготовки и одобрения регулирующих органов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь все эксперименты проводились после завершения обучения по использованию излучения с открытым источником в Сеульском национальном университетеИ одобрение правительства Кореи (nssc.go.kr/nssc/en).
  4. Утилизировать радиоактивные отходы согласно местным правилам.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь были использованы директивы Института охраны окружающей среды и безопасности Сеульского национального университета. Ниже приводится список регулирующих органов в Соединенных Штатах и ​​европейских странах: Соединенные Штаты Америки, Комиссия по ядерному регулированию США (http://www.nrc.gov/); Соединенное Королевство, Исполнительный директор по вопросам здравоохранения и безопасности (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Франция, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); И Германии, Федеральное министерство окружающей среды, охраны природы, строительства и ядерной безопасности (BMU) (http://www.bmu.de).

2. Анализ конкурентных киназ in vitro

  1. Конструирование конкурирующих пептидов
    1. Определите консенсусный мотив, фосфорилированный AMPK.
      ПРИМЕЧАНИЕ. AMPK распознает мотив консенсуса, & amp;# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. В консенсусной последовательности Φ представляет гидрофобные аминокислоты ( т.е. валин [V], лейцин [L], метионин [M] и изолейцин [I]) и β представляет собой основные аминокислоты ( т.е. лизин [K], аргинин [ R] и гистидин [H]) 1 .
    2. Выбирают остатки серина или треонина из последовательностей-мишеней в соответствии с вышеприведенным консенсусным мотивом. Используйте три предполагаемых участка Nrf2 человека (№ 1, 148-157, содержащий Ser153, №2, 330-339, содержащий Ser335, и №3, 553-562, содержащий Ser558) 8 .
    3. Коммерчески синтезируют 10-остаточные пептиды, которые имитируют предполагаемые сайты. Получают синтезированный продукт в виде лиофилизированного порошка с чистотой более 98% для каждого пептида.
    4. Растворяют пептиды, используя киназный буфер, чтобы достичь концентрации 71,667 г / л. Если пептид не растворим в киназном буфере, растворите его в 20% ДМСО. Если он остается нерастворимым, пептид, имитирующий путСайт может быть расширен для повышения растворимости.
  1. Анализ in vitro конкурентной AMPK киназы
    1. Готовят 5 × киназный буфер следующим образом: 100 мМ HEPES, pH 7,4; 25 мМ MgCl 2 ; 5 мМ EGTA; 5 мМ DTT; 125 мМ β-глицерофосфат (ингибитор серин / треониновая фосфатаза); 5 мМ Na 3 VO 4 (ингибитор тирозинфосфатазы); 0,5% (об. / Об.) Коктейль-набор ингибиторов протеазы III, 1 мМ холодного АТФ; И 500 мкМ АМФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. AMP является важным компонентом киназного буфера для тестирования активности AMPK. Буфер можно использовать для измерения активности как серин / треонинкиназ, так и тирозинкиназ.
    2. Оттепель следующие рекомбинантного белка и синтетических пептидов на льду: AMPK; Nrf2; И олигопептиды # 1, # 2 и # 3.
    3. Готовят реакционный буфер на льду: 0,15 мкг AMPK, 0,4 мкг Nrf2 (~ 4 пмоль), 0,43 мг олигопептида (~ 300 нмоль) и 6 мкл 5 × киназного буфера.Доводят конечный объем до 30 мкл стерильной дистиллированной водой (DW).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Добавление [γ- 32 P] -ATP после приготовления реакционного буфера может привести к уменьшению радиоактивного сигнала вследствие аутофосфорилирования киназы.
  2. Запуск реактивов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все нижеописанные процессы должны выполняться под защитой с помощью акрилового экрана, стойки или блока, а также соответствующих средств индивидуальной защиты.
    1. Перед началом эксперимента установите нагревательные блоки на 30 ° C.
    2. Добавить 1 мкл [γ- 32 P] -ATP (1 мкКи) в реакционные пробирки на льду. Смешайте реакционный буфер, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: радиоактивность 32 P имеет короткий период полураспада приблизительно 14 дней 9 . Отрегулируйте объем, рассмотрев период полураспада ( например, через месяц после производства [γ- 32 P] -ATP, добавьте 4 мкл [γ- 32 P]-ATP, чтобы получить 1 мкКи).
    3. Инкубируйте образец в нагревательном блоке при 30 ° С в течение 15-30 мин. Во время этой стадии готовят 7,5% геля для электрофореза в геле додецилсульфат-полиакриламид натрия (SDS-PAGE). Отрегулируйте процент геля в соответствии с размером целевого белка.
    4. Остановите реакцию киназы, добавив 3 мкл 10 × SDS образца буфера (10% (об. / Об.) Глицерина, 20% (мас. / Об.) SDS, 15,42% (мас. / Об.) Дитиотреитола, 90% (об. / Об.) 0,5 M трис-HCl (pH 6,8) и 0,02% (мас. / Об.) Бромфенолового синего). Смешайте реакционный буфер, пипетируя вверх и вниз несколько раз.
    5. Прогоните образцы в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и непрерывно при 140 В в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Синяя линия бромфенола на конце геля содержит чрезвычайно высокие радиоактивные сигналы. Рекомендуется удалить гель ниже синей линии, прежде чем перейти к следующему этапу для уменьшения фоновых сигналов.
    6. После SDS-PAGE аккуратно удалите гель из литейщика. Поместите гель в стакан tUbe для следующего шага.
    7. Закрепите гель с помощью фиксирующего буфера в течение 20 мин (50% метанола и 10% ледяной уксусной кислоты).
    8. Аккуратно переместите гель на фильтровальную бумагу и накройте его прозрачной оберткой. Обратите внимание, что гель можно легко разорвать на этом этапе. Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 часа.
  3. Визуализация
    1. Выставляют гель либо на фосфорном экране, либо на рентгеновской пленке в течение ночи (обычно в течение примерно 16 часов).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Фосфорный экран можно использовать повторно после воздействия яркого света. Когда используется рентгеновская пленка, разоблачите гель в течение двух дней. Рентгеновские пленки обладают меньшей чувствительностью, чем люминофорные экраны.
    2. Сканируйте люминофор с помощью люминофора. Экспортируйте изображение в формате TIFF или растровом файле с высоким разрешением.
    3. После визуализации переместите гель в стеклянный или пластиковый контейнер для окраски Кумасси бриллиантово-синим (CBB).
    4. Промойте гель DW. Отбросьте DW и окрасьтеГ с окрашивающим реагентом в течение 1 часа.
    5. Отменить реагент и гель с DW в течение 1 часа или на ночь. Поместите гель между прозрачными пластиковыми пленками (или аналогичными) для сканирования с помощью офисного сканера.

3. Анализ in vitro киназы с использованием мутанта, специфичного для участка

  1. Сайт-направленный мутагенез pGEX-Nrf2
    1. Мутагенная грунтовка
      ПРИМЕЧАНИЕ. Разработка правильных мутагенных праймеров имеет решающее значение для успешного результата мутагенеза. Ниже приведены некоторые соображения для проектирования мутагенных праймеров. Создайте праймер, состоящий из 25-45 оснований, с желаемой мутацией в середине праймера. Праймер должен иметь 40-60% GC содержания и заканчиваться одним или несколькими основаниями G или C. Убедитесь, что T m праймера равен 78 ° C или выше в соответствии с формулой [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / длина оснований) - несоответствие%].
      ПРИМЕЧАНИЕ. ОчиститеПотому что его чистота важна для эффективности мутаций. Существует несколько сайтов для проектирования мутагенных праймеров.
      1. Откройте программу проектирования грунтовки для «конструирования праймеров для сайт-направленного мутагенеза» (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. Вставьте последовательность ДНК человека Nrf2 (№ доступа NM_006164.4) и нажмите кнопку «загрузить переведенный».
      3. Выберите остаток серина 558 из переведенной аминокислотной последовательности, который следует заменить на аланин. Используя мутагенный праймер, замените кодон серина от agc до gcc, для аланина.
      4. Рассмотрим длину праймера, T m и содержание GC.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Мутагенный праймер окончательно сконструирован как 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
    2. Реакция для синтеза мутантных стренг с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)
      1. Готовят реакционную смесь ПЦР на льду: 10 × реакционный буфер, 50 нгPGEX-GST-Nrf2, 125 нг прямого праймера, 125 нг обратного праймера, 1 мкл смеси dNTP (10 мМ каждая), 2,5 U ДНК-полимеразы Pfu и стерильная DW до 50 мкл.
      2. Проведите ПЦР для синтеза pGEX-GST-Nrf2-мутантной цепи со следующей программой циклирования: 1 цикл при 95 ° C в течение 30 секунд; 18 циклов при 95 ° С в течение 30 с, при 55 ° С в течение 1 мин и при 68 ° С в течение 90 с; И 1 цикл при 68 ° С в течение 5 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от длины плазмиды параметры цикла могут быть изменены.
      3. Поместите его на лед в течение 2 минут, чтобы охладить реагенты для следующего шага. Альтернативно, храните их при 4 ° C в течение ночи.
    3. Расщепление Dpn I и выбор мутантной плазмиды
      1. Добавьте 1 мкл рестриктазы Dpn I (10 Ед / мкл) в каждый из реагентов после охлаждения. Тщательно и осторожно перемешать пипеткой и центрифугой в течение 1 мин.
      2. Инкубируйте при 37 ° C в течение 2 часов, чтобы переварить родительский pGEX-GST-Nrf2,Многоцепочечная ДНК.
      3. Аккуратно оттаивайте DH5 α суперкомпетентные клетки на льду.
      4. Добавить 50 мкл реагента в 150 мкл предварительно охлажденных DH5 α суперкомпетентных клеток и инкубировать на льду в течение по меньшей мере 30 мин.
      5. Перенесите пробирки в нагревательный блок, предварительно нагретый до 42 ° C, и оставьте их на 90 секунд. Поместите их на лед на 2 мин.
      6. Добавить предварительно разогретый бульон лизогении (LB) в трансформированные клетки DH5α и инкубировать при 37 ° C в течение 1 часа при встряхивании со скоростью 180 об / мин.
      7. Распространить трансформированные клетки на чашки с агаром LB-ампициллина и инкубировать в течение ночи при 37 ° C.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Ампициллин используют для селекции, поскольку плазмида GEX-GST-Nrf2 имеет маркер устойчивости к ампициллину. Используйте соответствующие антибиотики, в зависимости от маркера устойчивости мутагенной плазмиды.
      8. Выбирают одну колонию из пластинки, переносят ее в 5 мл LB-ампициллина и инкубируют в течение ночи при 37 ° С при встряхивании со скоростью 180 об / мин.Для проверки мутагенной последовательности оценивайте по крайней мере три колонии.
      9. Извлечение ДНК с использованием набора Miniprep DNA для анализа последовательности ДНК; Следуйте протоколу изготовителя.
      10. Проверьте мутагенные последовательности ДНК с использованием автоматического анализатора последовательности ДНК в соответствии с протоколом производителя. Используйте по крайней мере 200 нг ДНК-конструкции для проверки мутантных последовательностей.
  2. Очистка рекомбинантного белка GST-Nrf2
    1. Экспрессия мутагенного слитого белка GST- Nrf2 в Escherichia coli
      1. Трансформируют мутагенную плазмиду pGEX-GST-Nrf2 в клетки BL21 . Прививают одну колонию в 25 мл бульона LB, содержащего ампициллин (100 мкг / мл), и инкубируют при 37 ° С на ротаторе в течение ночи.
      2. Прививают культивируемые клетки в 100 мл LB-бульона, содержащего ампициллин (100 мкг / мл), при отношении разведения 1: 100.
      3. Инкубировать при 37 ° С на вращающемсяИли до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 0,4-0,8 (приблизительно 4 ч).
      4. Добавить 100 мкл 1 М IPTG в 100 мл культивируемых клеток для получения конечной концентрации 1 мМ IPTG.
      5. Инкубируйте клетки при 30 ° С на ротаторе в течение 6 ч или в течение ночи для экспрессии белка.
      6. Центрифуга клеток в 5000 мкг в течение 20 мин и ресуспендирования клеточных гранул с 1 мл бактериального лизиса буфера (25 мМ HEPES, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT, 0,1% CHAPS, 1 мкг / мл пепстатина, 0,5 мкг / мл лейпептина, И 1 мМ PMSF) на льду.
      7. Лизят гранулы клеток, используя ультразвуковой гомогенизатор с 2-секундными интервалами в течение 2 мин при 50% максимальной выходной мощности.
      8. Центрифугируют клетки при 12000 g в течение 15 мин при 4 o C и собирают супернатант.
    2. Очистка рекомбинантного белка GST-Nrf2
      1. Подготавливают 200 мкл 50% (об. / Об.) Глутатион-агарозных шариков и промывают 1 мл PBS (pH 7,3, 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4 и 1,8 мМ KH 2 PO 4 ). Соберите шарики центрифугированием при 500 × g в течение 1 мин. Повторите промывку три раза.
      2. Клеточный лизат добавляют к подготовленным 200 мкл 50% (об. / Об.) Глутатион-агарозных шариков и инкубируют при 4 ° С на вращающемся концевом ротаторе в течение 2 часов.
      3. Соберите шарики глутатион-агарозы в сочетании с белком GST-Nrf2 центрифугированием при 500 xg в течение 1 мин. Удалите супернатант, используя 1 мл шприц с иглой 31 G.
      4. Промывают шарики 1 мл PBS (pH 7,3), как на стадии 1.
      5. Добавить 500 мкл буфера для элюции (50 мМ Трис-HCl и 10 мМ восстановленного глутатиона, рН 8,0) в гранулы глутатион-агарозы в сочетании с GST-Nrf2. Инкубируйте при температуре 4 ° C на вращающемся концевом ротаторе в течение 30 мин.
      6. Центрифуга на 500 xg в течение 1 мин и собирать супернатант.
      7. Снова добавьте 300 мкл буфера для элюции в шарики и повторите шаги 3.2.2.5-3.2.2.6 два раза.
    3. Подтверждение очищенного белка GST-Nrf2
      1. Подготовьте 5 мкл образца для визуализации количества белка с 0,5 мкг стандартного белка BSA.
      2. Прогоните образцы в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и затем при 140 В в течение 60 мин.
      3. Окрашивают гель 0,1% CBB-окрашивающим раствором (0,1 г CBB R250, 40 мл 99% метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл перегонки H 2 O) в течение 2 ч и направляют (30 мл метанола, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 60 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока полосы не будут четко показаны.
      4. Поместите десертный гель на фильтровальную бумагу и накройте прозрачной оберткой. Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 часа.
      5. Определите количество мутантного белка GST-Nrf2 с денситометрией для анализа киназы in vitro AMPK.
  3. Анализ активности АМФК in vitro с использованием мутанта, специфичного для участка
    НЕE: Анализ киназы in vitro AMPK осуществляют в соответствии с этапами 2.2-2.4 с использованием 0,4 мкг очищенного GST-Nrf2 дикого типа или мутанта GST-Nrf2-S558A без ингибиторов пептида. Следуйте всем рекомендациям по радиационной безопасности, описанным в шаге 1.
    1. Готовят реакционный буфер на льду с 0,15 мкг AMPK, 0,4 мкг мутантного или дикого типа GST-Nrf2 и 6 мкл 5 киназного буфера. Заполните до 30 мкл стерильной ДГ.
    2. Добавить 1 мкл [γ- 32 P] -ATP (1 мкКи / мкл) в реакционные пробирки на льду. Смешайте реакционный буфер путем пипетирования вверх и вниз несколько раз и центрифуги.
    3. Инкубируйте образцы в нагревательном блоке при 30 ° С в течение 30 мин.
    4. Остановите реакцию киназы, добавив 3 мкл 10 × SDS образца буфера.
    5. Прогонят в 7,5% SDS-PAGE геле при 70 В в течение 20 мин и затем при 140 В в течение 1 часа.
    6. Закрепите гель с помощью фиксационного буфера в течение 20 минут, переместите его на фильтровальную бумагу и накройте гелем прозрачнымEnt wrapper.
    7. Сушат гель с помощью вакуумной гелевой сушилки при 80 ° С в течение 1 ч, а затем подвергают ее воздействию на ночь либо на люминофорном экране, либо на рентгеновской пленке.
    8. Сканируйте люминофор с помощью люминофора и переместите гель в стеклянную трубку для окрашивания CBB после визуализации в соответствии с шагом 2.4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 и Рисунок 2 демонстрируют результаты повторных экспериментов в ранее опубликованной статье 8 . Три различных олигопептида с 10 остатками, имитирующие предполагаемые сайты-мишени AMPK (№ 1, 148-157, включающие Ser153, №2, 330-339, содержащие Ser335, и №3, 553-562, содержащие Ser558), были синтезированы и использованы в качестве конкурентов в Vitro киназы. Фосфорилирование Nrf2 с помощью ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В качестве простого и удобного способа оценки достоверности предсказанных сайтов фосфорилирования, опосредованных AMPK, здесь мы описываем киназный анализ in vitro , который может быть использован для обнаружения конкретного участка фосфорилирования с использованием конкурентных пептидов и для его проверки с использованием сайт-специфического мутанта , Репрезентативные данные, полученные в конкурентном анализе активности AMPK in vitro, соответствовали результатам анализа с использованием сайта...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи, финансируемым правительством Кореи (MSIP) (№ 2015R1A2A1A10052663 и № 2014M1A3A3A02034698).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
HEPESThermo Fisher Scientific, Waltham, MA15630
MgCl2Sigma-Aldrich, СентЛуис, Миссури208337
EGTASigma-Aldrich, Сент-Луис, MOE3889
DTTSigma-Aldrich, Сент-Луис, MOD9779
&бета;-глицерофосфатSigma-Aldrich, Сент-Луис, MOG9422
Na3VO4Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури450243
Коктейль ингибиторов протеазыCalbiochem, Ноттингем, Великобритания539134
ATPSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриA2383
AMPSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриA1752
AMPKUpstate Biotechnology, Лейк Пласид, Нью-Йорк14-840
Nrf2 (WT)Abnova, Тайбэй, ТайваньH00004780-P01
[γ-32P]-ATPPerkinElmer Life and Analytical Sciences, Уолтем, МассачусетсNEG502A
окрашивающий реагент EZblueSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриG1041
Pfu турбо ДНК-полимеразаAgilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния600250
dNTP mix AgilentTechnologies, Санта-Клара, CA200415-51Избегайте многократного цикла размораживания и замораживания
DpnINew England Biolabs, Ipswich, MAR0176S
LB бульонDuchefa Biochemie BV, Харлем, НидерландыL1704
Ампициллинаффиметрический, Санта-Клара, CA11259
Agarose LEiNtRON Biotechnology, Суннам, Южная Корея32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini KitReal Biotech Corporation, Тайбэй, ТайваньQDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния161-0400
Бычья сыворотка АльбуминBovogen Biologicals, Виктория, АвстралияBSA100
Глутатиона сефароза 4BGE Здравоохранение, Мальборо, Массачусетс17-0756-01
Уксусная кислота ледниковыйДуксан чистые химикаты, Ансан, Южная Корея
Метиловый спирт
 
 		Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Южная Корея5558-4410
[header]
Typhoon FLA 7000GE Healthcare, Мальборо, Массачусетс28-9558-09
SDS-PAGE kitBio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния1658001FC
Вакуумный насосBio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния165-178
Гелевая сушилкаBio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния165-1746
Танцующий шейкерFINEPCR, Сеул, КореяCR300Машина необходима для мойки ступенчатой
ПЦР-машиныBio-Rad Laboratories, Hercules, CAT100
Инкубатор/шейкерыN-BIOTEK, GyeongGi-Do, КореяNB-205L
МикроцентрифугиLABOGENE, Сеул, Корея1730R
Хроматографические колонкиБио-Рад Лаборатории, Геркулес, Калифорния732-1010

Ссылки

  1. Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
  2. Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
  3. Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
  4. Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
  5. Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
  6. Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
  7. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
  8. Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
  9. Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365(1951).
  10. Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
  11. Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitroAMPKNrf2ATP gamma 32 text P
Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.