Методическая статья

Количественное определение пигментации брюшной полости в Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55732

⸱

1 июня 2017 г.

 , 
1Department of Biology, Lake Forest College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе представлен метод быстрого и точного количественного определения абдоминальной пигментации Drosophila melanogaster с использованием цифрового анализа изображений . Этот метод упрощает процедуры регистрации фенотипов и анализа данных и включает в себя установку образца, сбор изображений, извлечение значений пикселей и измерение признаков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пигментация - это морфологически простая, но очень переменная черта, которая часто имеет адаптивное значение. Он широко использовался как модель для понимания развития и эволюции морфологических фенотипов. Пигментация брюшной полости у Drosophila melanogaster особенно полезна, что позволяет исследователям идентифицировать локусы, лежащие в основе межвидовых и внутривидовых изменений морфологии. До сих пор, однако, брюшная пигментация D. melanogaster в значительной степени анализировалась качественно, за счет скоринга, а не количественно, что ограничивает формы статистического анализа, которые могут быть применены к данным пигментации. Эта работа описывает новую методологию, которая позволяет количественно оценить различные аспекты картины брюшной пигментации у взрослого D. melanogaster . Протокол включает в себя монтаж образцов, захват изображений, извлечение данных и анализ. Все программное обеспечение, используемое для макросъемки и анализа изображенийНаписанный для анализа изображений с открытым исходным кодом. Преимуществом этого подхода является способность точно измерять пигментные черты с использованием методики, которая очень воспроизводима в разных системах визуализации. Хотя эта методика использовалась для измерения вариаций в моделях пигментации трогала у взрослого D. melanogaster , эта методология является гибкой и широко применимой к образцам пигментации в множестве различных организмов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пигментация показывает огромные фенотипические различия между видами, популяциями и индивидуумами и даже внутри индивидуумов во время онтогенеза 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Несмотря на многочисленные исследования пигментации у самых разных животных, пигментация, пожалуй, лучше всего изучалась у Drosophila melanogaster , где полная сила молекулярной генетики использовалась для выяснения механизмов развития и физиологии, которые регулируют пигментацию и как эти механизмы развиваются 1 , 6 . Многое известно о генах, которые регулируют биохимический синтез пигментов в D. melanogaster 7 , 8 и генах, которые контролируют временную и пространственную диСтроение этого биосинтеза 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Кроме того, генетическое картирование выявило генетические локусы, лежащие в основе внутри- и межвидовых различий в пигментации у D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Также были изучены взаимосвязи между пигментацией и плейотропными чертами, такими как поведение 18 , 19 и иммунитет 19 , 20 , а также адаптивное значение рисунков пигментации 15 , 21 , 22 . Таким образом, пигментация в D. melanogaster появилась как мощный, но простой mДля разработки и эволюции сложных фенотипов.

Пигментация у взрослых D. melanogaster характеризуется различными формами меланизации по всему телу, особенно на крыльях, спинной грудной клетке и животе. Это пигментация каждой кутикулярной пластины (тергита) на дорзальном животе, однако, которая получила наибольшее внимание для исследования. Значительные различия в этой пигментации ( рис. 1А- Ф) обусловлены как генетическими 17 , 23, так и экологическими 24 , 25 факторами. Кутикула брюшного тергита состоит из передних и задних отделов развития ( рис. 1G ), каждая из которых может быть дополнительно разделена в зависимости от пигментации и орнамента 26 . Передний отдел включает шесть кутикулы(A1-a6), а задний отсек включает три (p1-p3) ( рисунок 1G ). Из них кутикула p1, p2 и a1 обычно складывают под тергитом в невытянутых брюшных полотнах, так что они скрыты. Надежная видимая кутикула характеризуется полосой тяжелой пигментации, здесь называемой «пигментной лентой», состоящей из типов кутикулы a4 (волосатая с умеренными щетинками) и a5 (волосатая с большими щетинками), с задним краем полосы Более интенсивно пигментированный, чем передний край ( рис. 1G ). Перед этой полосой находится область слегка пигментированной волосатой кутикулы, которая имеет щетину назад (а3), но не вперед (а2). Изменение пигментации между мухами наблюдается как в интенсивности пигментации, так и в ширине пигментной полосы. В целом, самые большие изменения в большинстве задних сегментов (брюшные сегменты 5, 6 и 7) и ниже в более передних сегментах (брюшное сечениеПункты 3 и 4) 24 . Кроме того, в пигментации D. melanogaster существует половой диморфизм, причем самцы обычно имеют полностью пигментированные пятый и шестой брюшные тергиты ( рис. 4C ).

В большинстве исследований пигментации брюшной полости у D. melanogaster пигментация рассматривалась как категориальный или ординальный признак, при этом образец качественно измерялся 27 , 28 , 29 или полуколичественно по шкале 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Эти методы неизбежно страдают от недостатка точности, и поскольку они полагаются на субъективную оценку пигментации, трудно сравнивать данные по исследованиям. Несколько авторов определили пространственные размеры пигментации 38 , 39 , интенсивность пигментации определенного типа кутикулы 23 , 25 , 39 , 40 или среднюю интенсивность пигментации по всему тергиту брюшной полости в целом 41 , 42 , 43 . Тем не менее, эти методы количественной оценки не измеряют как интенсивность, так и пространственное распределение брюшной пигментации одновременно и, следовательно, не фиксируют нюансов о том, как пигментация изменяется в зависимости от abdОминальный тергит. Кроме того, некоторые из этих способов 38 , 41 , 42 , 43 количественного определения требуют вскрытия и монтажа брюшной кутикулы. Это требует много времени и разрушает образец, что делает его недоступным для дополнительного морфологического анализа. По мере углубления понимания развития и развития абдоминальной пигментации потребуются более сложные инструменты для быстрого и точного измерения как пространственного распределения, так и интенсивности пигментации.

Общая цель этого метода заключается в использовании цифрового анализа изображений для получения реплицируемой и более точной меры брюшной пигментации в D. melanogaster . Методология включает три этапа. Во-первых, взрослая муха неразрушающе монтируется и берется цифровое изображение дорзального живота. Во-вторых, используя макрос ImageJ, пользовательОпределяет переднюю заднюю полосу пикселей, которая простирается от передней части кутикулы a2 до задней части кукурузы a5 (зеленая коробка, рисунок 1G ) как на третьем, так и на четвертом брюшных сегментах. Среднее значение пикселя по ширине этой полосы затем извлекается вдоль ее длинной оси, создавая профиль, который фиксирует пространственное распределение и интенсивность пигментации, когда он изменяется от передней к задней части тергита. В-третьих, сценарий R используется для описания профиля пигментации математически с использованием кубического сплайна. Сценарий R затем использует сплайн и его первую и вторую производные для извлечения ширины кутикулы a2-a5, ширины полосы пигмента и максимального и минимального уровней пигментации. Таким образом, этот метод количественно определяет как пространственные характеристики, так и глубину пигментации брюшной полости.

Эта методика количественно определяет пигментацию третьего и четвертого тергитов брюшной полости,Которые были в центре внимания многочисленных предыдущих исследований 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , либо исключительно, либо в сочетании с более поздними тергитами. Хотя и менее переменный, чем пятый и шестой тергиты брюшной полости, третий и четвертый тергиты не полностью пигментированы у самцов, поэтому этот протокол может применяться как для мужчин, так и для женщин. Тем не менее, как показано здесь, протокол может использоваться для измерения пигментации в пятом и шестом брюшных тергитах у женщин. Кроме того, незначительные модификации сценариев, используемых для извлечения характеристик профиля пигментации, должны позволять использовать этот метод для количественной оценки изменения пигментации в широком спектре другихорганизмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Монтаж образцов

ПРИМЕЧАНИЕ. Хранить мертвые мухи в 70% этаноле в воде до получения изображений.

  1. Залить 10 мл 1,25% агара, растворенного в кипящей воде в чашке Петри 60 мм х 15 мм, и дать ему установить.
  2. Под рассекающим микроскопом используйте пару тонкопленочных щипцов, чтобы на поверхности геля нанести углубление шириной ~ 20 мм, шириной 2 мм и глубиной 1 мм. Используя тонкие щипцы, вставьте вентральную сторону взрослой мухи в канавке, с дорсальной стороной мушки, выступающей над гелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Слабость геля позволяет легко перемещать, не повреждая образец. Такая же канавка может использоваться для нескольких образцов, хотя она станет грязной, разрушенной и непригодной для использования со временем. Затем пользователь может сделать еще одну канавку в том же геле. Каждая пластина может использоваться для изображения ~ 200 мух.
  3. Полностью покрыть образец в 70% этаноле в воде, чтобы уменьшить любые отражения света от восковой кутикулы и предотвратить повреждение крыла durМанипуляции с образцом.

2. Настройка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения приобретаются с использованием области рассечения, передаваемой световой базы, цифровой камеры и источника холодного света в виде гусиной шеи, прикрепленной к компьютеру, управляющему программным обеспечением для получения изображений. Программные инструкции относятся к Micro-Manager v1.4.20 44 , который представляет собой программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое включает ImageJ 45 .

  1. Включите микроскоп, цифровую камеру, источник холодного света с двойной головкой и компьютер.
  2. Запустите программу захвата изображений, чтобы открыть окно Micro-Manager и окно ImageJ. В окне ImageJ нажмите «Изображение»> «Тип»> «8-бит», чтобы установить все изображения как 8-битные. Нажмите «жить» в окне Micro-Manager, чтобы открыть окно «Snap / Live», показывающее предварительный просмотр в реальном времени с камеры.
    1. Увеличьте размер окна «Snap / Live», если necessary. Выберите «Оттенки серого» в раскрывающемся меню «Режим отображения» на вкладке «Контраст» окна «Микро-менеджер».
  3. Включите источник холодного света до максимальной интенсивности и расположите концы каждой гусиной шейки примерно на 120 мм от сцены, один слева и один справа.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пользователи также могут использовать кольцевой иллюминатор, хотя это может вызвать кольцо отраженного света вокруг живота с мухой.
  4. Вручную установите увеличение микроскопа на 60X, чтобы поле зрения захватывало площадь около 3 мм в диаметре на сцене.
  5. Поместите микрометр ступени 2 мм на сцену (при необходимости переведите фон на белый). При просмотре предварительного просмотра, сосредоточьтесь на микрометре сцены и отрегулируйте экспозицию в окне Micro-Manager, введя время экспозиции в мс в поле «Экспозиция».
  6. Для пространственной калибровки камеры выберите инструмент «прямая линия» в tОн ImageJ и нарисуйте линию длиной микрометра сцены. В окне ImageJ нажмите «Analyze»> «Set Scale», чтобы открыть окно «Set Scale», введите длину микрометра в мкм в поле «Известное расстояние» и введите «μm» в «Единице длины», коробка.
    1. Посмотрите, что окно «Установить масштаб» отображает масштаб в «пикселях / мкм». Запишите масштаб и нажмите «ОК».
  7. В окне «Snap / Live» нажмите «Остановить», а затем «Привязать», чтобы захватить изображение микрометра сцены.
  8. Сохраните изображение как 8-битный TIFF в оттенках серого, чтобы обеспечить возможность пространственной калибровки изображений, если это необходимо. В окне ImageJ нажмите «Файл»> «Сохранить как»> «Tiff ...» Укажите, где сохранить файл в браузере файлов, назовите файл и нажмите «Сохранить».
  9. Переключите сцену на черный и установитеЧашку Петри с мухой, установленной на агаре (этапы 1.1-1.2) на сцене.
  10. Посмотрите на микроскоп и поместите муху, чтобы убедиться, что спинная средняя линия прямо вверх, чтобы лучше всего просмотреть рисунок пигментации. Переместите все крылья и придатки, чтобы обеспечить беспрепятственный просмотр живота. Если пигментированная кутикула (a2-a5) не видна, сжимайте живот в поперечном направлении до тех пор, пока он не будет (хотя живот мух, который хранится в 70% этаноле в воде, растягивается, так что это обычно не требуется).
    ПРИМЕЧАНИЕ. При позиционировании мухи пользователю может потребоваться меньшее увеличение (20X). Увеличение должно быть возвращено до 60X перед продолжением.
  11. Вручную сосредоточьтесь на дорзальном животе мухи. Вручную отрегулируйте кончики источника света, чтобы свести к минимуму тени и отражение на дорзальном животе.
  12. При просмотре предварительного просмотра на экране компьютера и использовании гистограммы значений пикселей на вкладке «Контраст» окна «Микро-менеджер»,Отрегулируйте экспозицию, как описано в шаге 2.4, чтобы максимизировать диапазон значений пикселей изображения предварительного просмотра.
  13. Снимите муху и чашку Петри и замените их светодиодом (спектральный выход 430-660 нм), подключенным к измерителю напряжения, с центром в поле зрения в том же положении, что и муха. Используйте светодиод и измеритель напряжения в качестве индикатора 46 света и записывайте напряжение, генерируемое светом, поражающим светодиод (~ 125 мВ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Светодиод и измеритель напряжения используются для обеспечения постоянного уровня освещенности на нескольких сеансах визуализации в течение одного эксперимента.
  14. В течение всего эксперимента не изменяйте положение или интенсивность источника света, увеличение микроскопа или экспозицию камеры.

3. Образцы изображений

  1. Поместите чашку Петри с мухой, установленной на агаре (шаги 1.1-1.3) на стадии черного микроскопа. Отрегулируйте положение мухи так, чтобы третья и четвертаяH брюшные сегменты видны, а спинная средняя линия прямо вверх, как описано на шаге 2.9. Перед продолжением убедитесь, что увеличение составляет 60 раз.
  2. Вручную фокусируйте микроскоп таким образом, чтобы третья и четвертая дорзальные брюшные тергиты находились в фокусе. Используйте программное обеспечение для захвата изображения, чтобы получить изображение в виде 8-битного TIFF в оттенках серого, как описано в шаге 2.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Изображение можно записать в цвет и затем преобразовать в оттенки серого для анализа.
  3. Сохраните изображение как «SESH000_sampleID.tiff», как описано в шаге 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь [SESH] является константой, [000] является номером сеанса и является переменной, но должен иметь длину три цифры, а [sampleID] - то, что пожелает пользователь, хотя он не должен содержать никаких дополнительных символов подчеркивания (_) и Должна быть постоянной длины. [SampleID] должен содержать сведения о факторах, используемых при анализе данных пигментации ( например, температуры или линии), разделенных отличительным не-алфавитомCal, например, дефис (-). Это позволяет легко анализировать эти факторы из [sampleID] с использованием стандартного статистического программного обеспечения.
  4. Удалите чашку Петри со сцены и замените муху следующим образцом. Повторяйте шаги 3.1-3.3 до тех пор, пока все образцы не будут отображены, без дополнительной регулировки уровней освещения, увеличения или экспозиции.

4. Обработка изображений на нескольких сеансах

  1. Если изображения нужно снимать в течение нескольких сеансов, поддерживайте интенсивность света, экспозицию и увеличение в течение сеансов. В начале каждого сеанса проверьте пространственную калибровку камеры (шаг 2.4) и интенсивность света на каскаде (как измерено светодиодом / индикатором напряжения, шаг 2.12).
  2. Захватите и сохраните изображение микрометра сцены (шаги 2.5-2.7), чтобы обеспечить возможность пространственной калибровки изображений, если это необходимо.
  3. Используйте по крайней мере 15 контрольных образцов и произвольно перерисуйте их в каждой сессии для alloW для обнаружения и устранения эффектов сеанса. Убедитесь, что дублирующие контрольные образцы между сеансами имеют одинаковые [sampleID], но разные [SESH000].
    ПРИМЕЧАНИЕ. Контрольные образцы представляют собой мухи, собранные, хранящиеся и смонтированные идентично экспериментальным образцам, но повторно отображаемые на всех сеансах. Точное количество контрольных образцов будет зависеть от экспериментальной установки пользователя. См. Обсуждение для более подробной информации.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ изображения выполняется в ImageJ 45 и использует макрос «Измерение пигментации.ijm», предоставленный в качестве дополнительного файла.

  1. Поместите все изображения для анализа в одну и ту же папку.
  2. Запустите ImageJ и запустите макрос «Измерение пигментации.ijm», нажав «Плагины»> «Макро»> «Выполнить», выбрав «Измерение пигментации.ijm» в браузере файлов и нажав «открытый."
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все последующие шаги находятся внутри макроса. Каждый шаг - это отдельная макрокоманда.
  3. Обратите внимание, что открывается диалоговое окно «Action Required», в котором указано «Выберите папку, в которой хранятся изображения». Нажмите «ОК» и используйте браузер файлов, чтобы выбрать папку, содержащую изображения, и нажмите «выбрать».
  4. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно «Action Required», в котором указано «Выберите папку, в которой вы хотите сохранить данные». Нажмите «ОК» и используйте браузер файлов, чтобы выбрать нужную папку для сохранения профилей пигментации. Нажмите «выбрать».
  5. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с запросом «Сколько символов в вашем идентификаторе образца?» В поле ввода данных введите количество символов в [SampleID], как указано в шаге 3.3, и нажмите «ОК».
  6. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с вопросом: «Насколько широка ваша рентабельность?» В поле ввода данных введите ширину пикселя передней панели,Заднюю полосу, вдоль которой должен считываться профиль пигментации (зеленый прямоугольник, рисунок 1G , рисунок 2A и 2A '). Нажмите «ОК»; По умолчанию 20 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Профиль пигментации считывается через полоску кутикулы, а не линию, чтобы уменьшить шум из-за волос и щетины. Ширина этой полосы будет зависеть от разрешения изображения, но она должна быть ~ 1/20 -й ширины живота в пикселях.
  7. Обратите внимание, что макрос откроет изображение первой мухи, и диалоговое окно спросит, следует ли измерять текущую муху (нажмите «Да»), чтобы перейти к следующей мухе (щелкните «Нет») или для выхода из Макрос (нажмите «Отмена»).
  8. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с надписью «Определить среднюю линию дорзального живота от ANTERIOR до POSTERIOR». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от переднего к заднемуДля определения средней линии спинного живота. Нажмите «ОК»; См . Рис. 2A и 2A ', желтая линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это используется для переориентации изображения так, что спинная средняя линия лежит горизонтально по экрану, а передняя часть - слева, что облегчает последующие шаги.
  9. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с надписью «Определить границу POSTERIOR Tergite 4 прямо за пигментной лентой». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от заднего края средней линии до правого бокового края так, чтобы центр линии (обозначенный белым квадратом) сидел только сзади от заднего края пигментной полосы (кутикула a5). Нажмите «ОК». См . Рис. 2A и 2A ', пурпурная линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сценарий R автоматически обнаружит задний край пигментной полосы из профиля пигментации.
  10. Обратите внимание, что диалогОткроется коробка с надписью «Определите передний край Тергита 4 на переднем краю пигментированной кутикулы (a2)». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от переднего края средней линии до правого бокового края так, чтобы центр линии (обозначенный белым квадратом) сидел у переднего края пигментированной кутикулы (кутикула a2). Нажмите «ОК». См . Рис. 2A и 2A ' , голубая линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сценарий R определит эту точку как передний край пигментированной кутикулы тергита. На изображении макрос покажет интересующую область (ROI), по которой считывается профиль пигментации (зеленый прямоугольник, рисунок 2A и 2A ', увеличенный на рис. 2B и 2B '). Макрос также откроет второе окно, показывающее профиль пигментации для ROI ( Figur E 2C и 2C '), где ось x представляет собой положение, выраженное как число пикселей от заднего края профиля, а ось y - среднее значение пикселя в каждой позиции.
  11. Просмотрите графики профиля пигментации, которые откроется макросом. При необходимости нажмите «Живой» в окне профиля, чтобы отрегулировать положение ROI, чтобы он не включал никаких структур ( например, щетинок), которые влияли бы на профиль пигментации. Как только профиль будет удовлетворительным, нажмите «ОК».
  12. Повторите шаги 5.8-5.11 для Тергита 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Затем макрос экспортирует профили пигментации в виде двух файлов CSV, каждый из которых называется «SESH000_samplename_TX_profile.csv», где [SESH000_samplename] - это имя изображения, а [TX] - T3 или T4 для третьего и четвертого тергитов соответственно.
  13. Обратите внимание, что макрос открывает следующее изображение. Повторяйте шаги 5.7-5.13 до тех пор, пока все изображения не будут проанализированы.
Jove_title "> 6. Предварительная обработка данных, анализ и коррекция сеанса

ПРИМЕЧАНИЕ. Весь анализ данных проводится в R 47 и используется сценарий «Анализ пигментации.R». Ниже «L ...» указывает, какие строки сценария запускаются для каждой части анализа. Дополнительную информацию о том, как проводится анализ, см. В дополнительной информации.

  1. Отредактируйте сценарий R , чтобы установить рабочий каталог (L6) и определить путь к файлу в папке, содержащей профили the.csv (L11).
  2. Запустите L13-15, чтобы создать список профилей пигментации, хранящихся в папке профиля.
  3. Загрузите и запустите функции «reader» и «addPrimaryKey» (L17-41), чтобы прочитать профили в один кадр данных.
  4. Измените сценарий на L43, чтобы указать пространственную калибровку изображений в мкм / пикселях, как определено на шаге 2.5.
  5. Загрузите и запустите «adjus»Tments "(L46-58), чтобы преобразовать положение профиля (ось x, рисунок 2C и 2C ') от пикселов от заднего края к ROI до μm-from-front-edge-of-ROI и (Ось y, рисунок 2C и 2C ') от значения пикселя (0 = черный, 255 = белый) до значения пигментации (0 = пигмент, 255 = максимальный пигмент).
  6. Загрузите и запустите функцию «spline.der.er» (L60-71) для генерации кубического сплайна профилей пигментации и его первой и второй производных ( рис. 2D -2F и 2D '- 2F ').
  7. Загрузите и запустите функции «coord» и «assmbly.coord» (L74-163), сначала извлеките положение задних (T 3 ) и передних (T 2 ) краев пигментной полосы ( рис. 2D и 2D );) И задний край кутикулы a2 (T 1 , рисунок 2D и 2D ), а затем для извлечения максимальных (P max ) и минимальных (P min ) пигментационных значений, взятых при T 3 и T 1 соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Передний край кутикулы a2 уже определен на шаге 5.9.
  8. Необязательно: загрузите и запустите функцию «chek» (L165-175), чтобы проверить, правильно ли функция «координирования» идентифицирует позиции T 1-3 для случайно выбранного профиля пигментации.
  9. Загрузите и запустите функции индексов и показателей (L178-193) для создания таблицы данных с заголовками «Сессия», «Образец», «Тергит», «Идентификатор» (конкатенация образца и тергита), «P max », «P min », «W band » (ширина полосы пигмента, = T3 - T 2 ) и «W тергит » (ширина пигментированного cUticles a2-a5, = T 3 ).
  10. Загрузите и запустите функцию коррекции (L196-234), чтобы создать таблицу данных, которая корректирует P max и P min для любых факторов неудобства, возникающих из-за эффектов сеанса. Используйте среднее увеличение (или уменьшение) в P max или P min из контрольных образцов, повторно отображаемых во временных смежных сеансах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол использовался для изучения влияния температуры выращивания на брюшную пигментацию. Предыдущие исследования показали, что увеличение температуры развития приводит к уменьшению распространения брюшной пигментации у нескольких видов дрозофилы , включая D. melanogaster 30 , 32 . В частности, в брюшных тергитах 3 и 4 степень пигментации (ширина пигментной полосы) уменьшается от 17 ° С до 25 ° С и остается не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта методика позволяет получить точное, быстрое и повторяемое получение данных о пигментации в количественной форме, подходящей для нескольких последующих анализов. Этот метод был использован для получения данных о влиянии температуры на брюшную пигментацию в изогенной линии мух. Однако методология может быть использована в исследованиях прямой генетики для выявления генов, которые лежат в основе различий пигментации между индивидуумами, популяциями или видами, или реверс-генетических исследований для изучения эффектов ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Национальным научным фондом и предоставила IOS-1256565 и IOS-1557638 AWS. Мы благодарим Патрицию Виткопп и трех анонимных рецензентов за их полезные комментарии к более ранней версии этого документа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Dumont #5 Биологические щипцыFST11252-30
АгарСигма-Олдрич5040
Препарирующий эндоскопLeicaMZ16FA
БазаLeicaMDG41
КамераLeicaDFC280
Гусиная шея Источник холодного светаSchottACE 1
Изображение Программное обеспечение для управления сбором данныхMicro-Manager v1.3.20https://micro-manager.org/
Программное обеспечение для анализа изображенийImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
Программное обеспечение для анализа данныхR 3.3.2https://www.r-project.org/
СветодиодThor LabsLEDWE-15
Мультиметр Fluke75 Series II
Чашка Петри 60 мм x 15 ммCelltreat Scientific Products229663
микрометр StageKlarman Rulings, Inc.КР-867

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526(2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163(2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63(2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30(2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181(1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179(2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи