Методическая статья

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

DOI:

10.3791/55812

⸱

14 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCLA AIDS Institute, University of California at Los Angeles (UCLA), 2Department of Microbiology, Immunology, & Molecular Genetics, University of California at Los Angeles (UCLA), 3Departments of Biomathematics and Mathematics, University of California at Los Angeles (UCLA), 4Personalized Genomic Medicine Research Center, Division of Strategic Research Groups, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 5Department of Medicine, University of California at Los Angeles (UCLA), 6Department of Veterinary Biosciences, College of Veterinary Medicine, The Ohio State University (OSU)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается экспериментальная процедура и программный анализ для анализа двунаправленного интеграционного сайта, который может одновременно анализировать ДНК-перекрестный узел вверх и вниз по течению. Двунаправленные продукты ПЦР могут использоваться для любой последующей секвенирующей платформы. Полученные данные полезны для высокопроизводительного количественного сравнения интегрированных целей ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализы интеграции (IS) являются критическим компонентом исследования сайтов ретровирусной интеграции и их биологического значения. В недавних исследованиях ретровирусной генной терапии ИСС-анализы в сочетании со последовательностью следующего поколения использовались в качестве инструмента отслеживания клеток для характеристики популяций клоновых стволовых клеток, имеющих один и тот же ИБ. Для точного сравнения репопулирующих клонов стволовых клеток внутри и между разными образцами чувствительность обнаружения, воспроизводимость данных и высокая пропускная способность анализа являются одними из самых важных характеристик анализа. Эта работа обеспечивает подробный рабочий процесс анализа протоколов и данных для двунаправленного анализа ИС. Двунаправленный анализ может одновременно кодировать как переходы, так и нижестоящие узлы-хозяины. По сравнению с обычными однонаправленными подходами секвенирования ИС двунаправленный подход значительно улучшает скорость обнаружения ИБ и характеристику событий интеграции на обоих концах tОн нацеливается на ДНК. Конвейер анализа данных, описанный здесь, точно идентифицирует и перечисляет идентичные последовательности IS посредством нескольких этапов сравнения, которые отображают последовательности IS на эталонный геном и определяют ошибки последовательности. Используя оптимизированную процедуру анализа, мы недавно опубликовали подробные образцы репопуляции тысяч клонов Hematopoietic Stem Cell (HSC) после трансплантации в макаках резуса, впервые демонстрируя точную временную точку репопуляции HSC и функциональную гетерогенность HSCs в Система приматов. В следующем протоколе описывается пошаговая экспериментальная процедура и рабочий процесс анализа данных, который точно идентифицирует и количественно идентифицирует идентичные последовательности IS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ретровирусы вставляют свою геномную ДНК в геном хозяина в разных местах. Это уникальное свойство, которое может способствовать развитию рака и других форм вирусного патогенеза, имеет ироничную выгоду от того, чтобы эти вирусы были сильно поддаются клеточной инженерии для генной терапии и фундаментальных исследований в области биологии. Вирусный сайт интеграции (IS) - местоположение гена хозяина, в котором интегрирована чужая ДНК (вирус), имеет важные последствия для судьбы как интегрированных вирусов, так и клеток-хозяев. Анализы IS были использованы в различных биологических и клинических исследованиях для изучения селекции и патогенеза сайтов ретровирусной интеграции, развития рака, биологии стволовых клеток и биологии развития 1 , 2 , 3 , 4 . Низкая чувствительность обнаружения, низкая воспроизводимость данных и частое перекрестное загрязнение относятся к числуКлючевые факторы, ограничивающие применение ИСП-анализов для текущих и запланированных исследований.

Разработаны многие технологии анализа IS. Наиболее широко используются анализы сайтов интеграции на основе рестрикционных ферментов, в том числе Linker-Mediated (LM) полимеразная цепная реакция (ПЦР) 5 , обратная ПЦР 6 и ПЦР 7 с линейной амплификацией (LAM). Однако использование сайтов-специфических рестрикционных ферментов создает смещение во время извлечения ИС, позволяя только подмножество интегромов (чужой ДНК, интегрированной в геном хозяина) вблизи рестрикционного сайта, подлежащего восстановлению. 4 . В последние годы также были внедрены аналитические технологии, которые более всесторонне оценивают векторные ИС. Эти анализы используют различные стратегии, в том числе МС-транспозон-опосредованную ПЦР- 8 , нерезистивный (nr) -LAM ПЦР 9 , рестрикционный фермент типа IIПищевое расщепление 10 , механическое срезание 11 и случайную ПЦР (без повторной ПЦР) на основе гексамера 12 , для фрагментации геномных ДНК и амплификации ИС. Современные технологии имеют различные уровни чувствительности обнаружения, охват генома, специфичность мишени, высокую пропускную способность, сложность процедур анализа и предубеждения при определении относительных частот целевых сайтов. Учитывая различные качества существующих анализов и разнообразие целей, для которых они могут быть использованы, следует тщательно подобрать оптимальный подход к анализу.

Эта работа обеспечивает подробные экспериментальные процедуры и рабочий процесс анализа вычислительных данных для двунаправленного анализа, который значительно улучшает скорость обнаружения и точность количественной оценки последовательности, одновременно анализируя ИС вверх и вниз по течению от интегрированной целевой ДНК (см. Рисунок 1 для схематического обзора процедур анализа ). Этот подход также обеспечиваетS - средство для характеристики процесса ретровирусной интеграции (например, верность дублирования целевого сайта и вариации геномных последовательностей восходящих и нисходящих вставок). Другие двунаправленные методы были в основном использованы для клонирования и секвенирования обоих концов ДНК-мишени 11 , 13 , 14 . Этот анализ широко оптимизирован для высокопроизводительной и воспроизводимой количественной оценки векторизованных клонов с использованием хорошо зарекомендовавшего себя метода LM-PCR и картографирования вычислительного анализа, а также для количественного определения обоих восходящих и нисходящих соединений. Двунаправленный анализ с ферментом TaqαI оказался полезным для высокопроизводительной клональной квантификации в доклинических исследованиях генной терапии стволовых клеток 2 , 15 . В этой статье описывается модифицированный метод с использованием более частого резака (RsaI / CviQI - motif: GTAC), который удваивает tОн имеет шансы обнаружить интегромы по сравнению с анализом на основе TaqαI . Описаны подробные процедуры экспериментального анализа и анализа данных, которые используют ферменты мотивации GTAC для лентивирусов (NL4.3 и его производных) и вектора γ-ретровирусных (pMX-векторов). Олигонуклеотиды, используемые в анализе, перечислены в таблице 1 . Внутренний сценарий программирования для анализа последовательности IS представлен в дополнительном документе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Создание восходящих (левых) и нижестоящих (правых) -функций последовательностных библиотек

  1. Получение ДНК-линкера:
    1. Подготовьте 10 мкл линкерного ДНК-раствора, добавив 2 мкл 100 мкМ олигонов LINKER_A (окончательный: 20 мкМ), 2 мкл 100 мкМ олигонов LINKER_B (окончательный: 20 мкМ), 2 мкл 5 М NaCl (окончательный: 1 М) и 4 мкл свободной от нуклеазы воды в ПЦР-трубке. См. Таблицу 1 для последовательностей компоновщика.
    2. Инкубируйте раствор ДНК-линкера при 95 ° C в течение 5 минут в инструменте ПЦР, остановите программу прогона и выключите питание инструмента ПЦР. Оставьте раствор линкера в приборе в течение 30 мин, чтобы медленно охладить ДНК-линкер. Раствор ДНК-линкера можно хранить при 4 ° С.
  2. LTR-специфическое расширение биотина-праймера:
    1. Используйте спектрофотометр UV-Vis для определения концентрации ДНК и значений 260-280 нм геномной ДНК in vivoИли in vitro . Разбавьте 1-2 мкг образца геномной ДНК до конечного объема 170 мкл раствора геномной ДНК, используя воду без нуклеазы.
    2. Приготовление 200 мкл ПЦР-реакции путем смешивания 2,5 мкл каждого из 10 мкМ ВИЧ-1-специфических праймеров биотина (L-BP и R-BP в таблице 1 : всего 10 мкл для четырех лентивирусспецифических праймеров), 20 мкл 10X термостабильного ДНК-полимеразный буфер, 4 мкл 10 мМ dNTP (окончательный: 200 мкМ каждого dNTP), 3 мкл терморезистентной ДНК-полимеразы 2,5 U / мкл и 163 мкл геномной ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для гаммаретровирусных векторов (векторы pMX) используют 5 мкл каждого из двух 10 мкМ pMX-специфичных праймеров биотина (L-BP и R-BP: всего 10 мкл) вместо четырех вышеуказанных биотин-праймеров, специфичных для ВИЧ-1.
    3. Разделите раствор на четыре трубки ПЦР (каждые 50 мкл) и выполните один цикл удлинения при следующих условиях: 94 ° C в течение 5 минут, 56 ° C в течение 3 минут, 72 ° C для 5Мин и 4 ° C для хранения.
    4. Объедините все четыре реакции ПЦР в 2 мл микроцентрифужную пробирку и следуйте процедуре очистки ПЦР в наборе для очистки ПЦР. Элюат с 50 мкл элюирующего буфера (5-кратный разбавленный водой буфер элюирования, предусмотренный в комплекте). Немедленно перейдите к шагу 1.3.1 или сохраните элюированную ДНК при -20 ° C.
  3. RsaI и расщепление CviQI
    1. Подготовьте реакцию расщепления 100 мкл, добавив 50 мкл ДНК (из стадии 1.2.4), 10 мкл 10-буфера A и 2 мкл (20 U) фермента RsaI. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа в инструменте ПЦР.
    2. Добавьте 1 мкл (10 U) фермента CviQI к реакции и инкубируйте при 25 ° C в течение 30 минут в приборе ПЦР. Немедленно перейдите к шагу 1.4.1
  4. Тупой конец:
    1. Подготовьте 4,5-мкл смесь, содержащую 2,5 мкл большого фрагмента ДНК полимеразы I (klenow) и 2 мкл 10 мМ dNTP. Перенос 181; L смеси к образцу ДНК с этапа 1.3.2. Общий объем составит 102 мкл. Хорошо перемешать путем встряхивания и инкубации при 25 ° C в течение 1 часа в приборе для ПЦР. Немедленно перейдите к шагу 1.6.1.
  5. Получение гранул стрептавидина:
    1. Кратко встряхните раствор стрептавидина и перенесите 50 мкл в новую 2 мл микроцентрифужную пробирку. Удаляют супернатант с помощью магнитной подставки и промывают гранулы 200 мкл связующего раствора.
    2. Повторно суспендируйте шарики в 100 мкл связующего раствора и удалите трубку с магнитной подставки. Немедленно перейдите к шагу 1.6.1.
  6. Связывание стрептавидина:
    1. Перенесите 100 мкл ДНК образца (этап 1.4.1) в 100 мкл повторно суспендированного раствора шарика (шаг 1.5.2) и тщательно перемешайте пипетированием, чтобы избежать вспенивания раствора. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение 3 часов на вращающемся колесе или валике.
    2. Используйте магнитную подставку для захвата бусинок и выбросьте супернатант. Вымойте гранулы дважды в 400 мкл моющего раствора и дважды в 400 мкл 1х T4 ДНК-лигазного буфера (разбавленный из 10X раствора с использованием воды, свободной от нуклеазы).
    3. Ресуспендируют гранулы в 200 мкл 1x T4 ДНК-лигазного буфера (разбавленного из 10-кратного раствора с использованием воды, свободной от нуклеазы) и помещают ее в сторону от магнитной подставки. Немедленно перейдите к шагу 1.7.1.
  7. Лигирование линкера:
    1. Подготовьте реакционный раствор для липирования объемом 400 мкл в 2 мл микроцентрифужной пробирке путем смешивания 0,5 мкл ДНК-линкера (стадия 1.1.2), 10 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера, 20 мкл 5X T4 ДНК-лигазного буфера (содержащего 25% полиэтилена Гликоль), 5 мкл ДНК-лигазы Т4, 164,5 мкл свободной от нуклеазы воды и 200 мкл повторно взвешенных гранул (этап 1.6.3). Поместите реакционную трубку на вращающееся колесо и инкубируйте при комнатной температуре (22 ° C) в течение 3 часов (или 16 ° СО / Н).
    2. Промывайте гранулы дважды промывочным раствором и дважды с 1X термостабильным ДНК-полимеразным буфером (разбавленным из 10-кратного раствора с использованием воды без нуклеазы) с использованием магнитной подставки.
    3. Ресуспендируют гранулы в 50 мкл 1х термостабильного ДНК-полимеразной ПЦР-буфера и удаляют его с магнитной подставки. Немедленно перейдите к шагу 1.8.1 или храните при температуре 4 ° C в течение одного дня.
  8. Предварительное усиление как левой, так и правой частей ДНК:
    1. Приготовление 200 мкл ПЦР-реакции путем добавления 10 мкл 10 мкМ 1L-праймера, 10 мкл 10 мкМ 1R-праймера, 20 мкл 10 мкМ праймера Link1 (таблица 1), 10 мкл 10X термостабильного ДНК-полимеразного буфера, 4 мкл 10 мМ dNTP (окончательный: 200 мкМ каждого dNTP), 8 мкл (20 U) термостабильной ДНК-полимеразы и 88 мкл свободной от нуклеазы воды к повторно суспендированным шарикам (50 мкл) с этапа 1.7.3.
    2. Аликвоту реакционной смеси в 4 ПЦР-пробирки (каждые 501; L) и проводят ПЦР со следующим условием: инкубация 94 ° C в течение 2 мин; 25 циклов 94 ° С в течение 20 с, 56 ° С в течение 25 с и 72 ° С в течение 2 мин; И конечное удлинение при 72 ° С в течение 5 мин.
    3. Объедините все 4 реакции ПЦР в 2 мл микроцентрифужную пробирку и следуйте процедуре очистки ПЦР в наборе для очистки ПЦР. Элюируйте 50 мкл буфера для элюирования.
    4. Определить концентрацию ДНК и 260/280 нм с помощью спектрофотометра UV-Vis; ДНК можно хранить при -20 ° С до готовности к следующему этапу. Выполните шаги 1.9.1 / 1.10.1 (необязательно) или непосредственно с шагами 1.11.1 / 1.12.1.
  9. Удаление внутреннего ДНК-амплификатора левой стороны (необязательно):
    1. Перенесите до 100 нг ДНК-продукта ПЦР с шага 1.8.4 в 2 мл микроцентрифужную пробирку и отрегулируйте объем до 10 мкл с использованием воды, свободной от нуклеазы.
    2. Подготовьте реакцию рестрикционного фермента, специально ориентированную на левую внутреннюю DNA-ампликон.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Условия реакции могут различаться в зависимости от выбора фермента. Например, при удалении левой ДНК левой стороны из лентивирусных векторов на основе NL4.3 добавляют 1 мкл pvuII , 2 мкл буфера B и 7 мкл свободной от нуклеазы воды. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа в инструменте ПЦР. Немедленно перейдите к шагу 1.11.1 или храните при -20 ° C.
  10. Удаление правого внутреннего амплификатора ДНК (необязательно):
    1. Выполните то же, что и в шаге 1.9.1.
    2. Подготовьте реакцию рестрикционного фермента, специально предназначенную для правого внутреннего амплификатора ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Например, при удалении внутренней ДНК правой стороны из лентивирусных векторов на основе NL4.3 добавьте 1 мкл sfoI , 2 мкл буфера B и 7 мкл свободной от нуклеазы воды. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 часа в инструменте ПЦР. Немедленно перейдите к шагу 1.12.1 или храните при -20 ° C.
  11. Оставил-специфическое усиление:
    1. Подготовьте 50 мкл ПЦР-реакции путем смешивания 5 мкл ДНК со стадии 1.8.4 (или с необязательной стадии 1.9.2), 5 мкл 10 мкМ 2L-праймера (окончательный: 1 мкМ), 5 мкл 10 мкМ праймера Link2 (Конечный: 1 мкМ), 5 мкл 10х термостабильного ДНК-полимеразного буфера, 1 мкл 10 мМ dNTP (окончательный: 200 мкМ каждого dNTP), 2 мкл (5 U) термостабильной ДНК-полимеразы и 27 мкл нуклеазы воды.
    2. Проведите ПЦР со следующим условием: инкубация 94 ° C в течение 3 мин; 8-15 циклов 94 ° С в течение 20 с, 56 ° С в течение 25 с и 72 ° С в течение 2 мин; И конечное удлинение при 72 ° С в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Амплифицированную ДНК можно хранить при -20 ° C. * Предлагается оптимизация числа циклов.
    3. Следуйте процедуре очистки ПЦР в наборе для очистки ПЦР. Элюируйте 50 мкл буфера для элюирования. Определите концентрацию ДНК и значения 260/280 нм.
  12. Конкретное усиление с правой стороны:
    1. Все процедуры идентичны «усилению по левому краю» (шаги 1.11.1-1.11.3), за исключением использования разных праймеров; Используйте праймер-специфический праймер (2R-праймер, см. Таблицу 1 ) на этом этапе.
  13. Тест вариации длины амплификатора ПЦР:
    1. Проанализируйте вариации длины ампликона ПЦР, выполнив 2% -ный электрофорез в агарозном геле или капиллярный электрофорез ( рис. 2 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это важный шаг для подтверждения завершения процедур анализа и проведения грубой оценки шаблонов ИС на основе шаблонов полосы ПЦР. Очищенный ПЦР-ампликон из стадий 1.11.3 и 1.12.3 может быть использован для различных платформ секвенирования ДНК. Выполните соответствующие процедуры подготовки образцов для классического секвенирования последовательности (Sanger) или последовательности следующего поколения. ДНК может храниться при -20 °; С.

2. Вычислительный анализ последовательностей ИС

  1. Подготовка файлов данных:
    1. Подготовьте три файла входных данных: файл данных последовательности fasta (Test_data.fa в дополнительных данных), файл tsv для поисковых мотивов для векторных и линкерных последовательностей (Demultiplexing_Trimming_blunt_GTAC.tsv в дополнительных данных) и файл tsv для информации о рестрикционных ферментах (Enzyme.tsv в дополнительных данных).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти файлы необходимы для демультиплексирования, обрезки векторных и линкерных последовательностей и удаления внутренних векторных последовательностей ( рисунок 3A ). Подробные пошаговые инструкции для выполнения вычислительного рабочего процесса содержатся в файле README.txt в дополнительных данных.
  2. Вычислительный анализ:
    1. Запустите сценарии демультиплексирования и обрезки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Необработанная последовательность будет обработана для демультиплексирования и для тримминкаG векторных, линкерных и праймерных последовательностей (см. STEP-1 в дополнительном файле README.txt).
    2. Запустите команду сопоставления (см. STEP-2 в файле README.txt), чтобы отобразить обработанные последовательности в эталонный геном, используя инструмент выравнивания BLAST (BLAT; www.genome.ucsc.edu).
    3. Запустите количественный сценарий анализа IS (см. STEP-3 в файле README.txt).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Создаются два выходных файла (Initial_count_without_homopolymer_correction.txt и Final_count.txt). Более подробные сведения о сопоставлении и стратегии перечисления последовательностей можно найти в файле README.txt в дополнительных данных и в предыдущих публикациях 2 , 15 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двунаправленный анализ ИС генерировал различные размеры ПЦР-ампликонов как для восходящих (левых), так и для нисходящих (правых) хостов-узлов ( рис. 2 ). Размер ПЦР-ампликона зависит от местоположения ближайшего моста GTAC вверх и вниз от интегрома. Анализ также продуцировал внутренние ДНК-ПЦР-ампликоны: ретровирусные последовательности вблизи полипуринового тракта и сайт связывания праймера были последовательно амплифицированы в ходе ПЦР левого и правого ка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двунаправленный анализ позволяет одновременно анализировать как последовательности восходящего (левого), так и нижестоящего (правого) вектора-хозяина ДНК-соединения и полезен в ряде применений генной терапии, стволовых клеток и исследований рака. Использование ферментов GTAC-motif (RsaI и CviQI) и двунаправленный подход к ПЦР значительно улучшает шансы обнаружения интегрома (или клональной популяции) по сравнению с предыдущими анализами на основе TCGA-мотив ( TaqαI ) 2 ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование осуществлялось Национальными институтами здравоохранения Грантов R00-HL116234, U19 AI117941 и R56 HL126544; Национальный научный фонд Грант DMS-1516675; Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); И инициатива KRIBB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Термостабильная ДНК-полимеразаAgilent600424PicoMaxx Polymerase
Термостабильный ДНК-полимеразный буферAgilent600424PicoMaxx Полимеразный буфер
Дезоксинуклеотид (dNTP) растворNew England BiolabsN0447LdNTP (по 10 мМ каждая)
ПЦР-пробиркиVWR International53509-304ПЦР-стрип-пробирки с индивидуальными Прилагаемые колпачки
2 мл микроцентрифужная пробиркаМолекулярные биопродукты3453микроцентрифужные пробирки
набор для очистки ПЦРQiagen28106
RsaI New England BiolabsR0167Lфермент рестрикции
CviQINew England BiolabsR0639Lфермент рестрикции
Буфер ANew England BiolabsB7204SNEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I большой (кленовый) фрагмент New England BiolabsM0210LПритупление
шариков стрептавидина растворInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
Связующий растворInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER
Набор моющего раствораInvitrogen 60101Dynabeads kilobaseBINDER kit
магнитная подставкаThermoFisher12321DDynaMag™-2 Магнит
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202LT4 ДНК-лигаза
10X T4 ДНК-лигаза буферNew England BiolabsB0202ST4 ДНК-лигаза реакционный буфер
5X T4 ДНК-лигаза буферInvitrogen 46300-018T4 ДНК-лигазный буфер с полиэтиленгликолем-8000
УФ-Вид спектрофотометрFisher ScientificS06497Nanodrop 2000
pvuIIновая Англия BiolabsR0151Lфермент рестрикции
sfoIновая Англия BiolabsR0606Lфермент рестрикции
буфер Bновая Англия BiolabsB7203SNEB буфер 3.1
Вода без нуклеазыIntegrated DNA Technologies11-05-01-14
Капиллярный электрофорезQiagen9001941QIAxcel капиллярный электрофорез
Veriti 96-луночный быстрый термоамплификаторThermo Fisher Scientific4375305PCR
Инструмент Вращающееся колесо (или ролик)EppendorfM10534004Ролик для клеточных культур Барабаны
ДНК размер маркерQiagen929559маркер размера QX (100 - 2,500.н)
Маркер размера ДНКQiagen929554маркер размера QX (50 - 1,500.н)
Маркеры выравнивания ДНКQiagen929524QX Маркер выравнивания ДНК
геномкаНет в наличииНедоступноОбразец геномной ДНК из экспериментов in vivo или in vitro
смесь растворов с

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
  2. Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
  3. Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
  4. Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
  5. Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
  6. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150(1990).
  7. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
  8. Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72(2011).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  10. Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
  11. Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
  12. Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
  13. Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
  14. Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543(2014).
  15. Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
  16. Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234(2004).
  17. Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  18. Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284(2013).
  19. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
  22. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
  23. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи