Методическая статья

Модель инвертированного сердца для междоузлийной коллекции трансмутаций из изолированного сердца крысы

DOI:

10.3791/55849

⸱

20 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, 2Department of Molecular Cardiology, Heinrich Heine University, 3Department of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry, German Diabetes Center, Heinrich Heine University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается способ сбора сердечной интерстициальной жидкости из изолированного, перфузируемого сердца крыс. Чтобы физически отделить интерстициальный трансудат от перфузата коронарного венозного эффлюента, перфузированное сердце Лангендорфа перевернуто, а транссудатная (интерстициальная жидкость), сформированная на поверхности сердца, собирается с использованием мягкой латексной крышки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящем протоколе описывается уникальный подход, который позволяет собирать сердечный трансудат (КТ) из изолированного, засоленного персистированного сердца крыс. После выделения и ретроградной перфузии сердца в соответствии с техникой Лангендорфа сердце перевернуто в перевернутое положение и механически стабилизируется баллонным катетером, вставленным в левый желудочек. Затем поверх эпикардиальной поверхности помещается тонкая латексная крышка, ранее отлитая в соответствии со средним размером сердца крыс. Выход латексного колпачка соединен с кремниевой трубкой, а дистальное отверстие на 10 см ниже базового уровня сердца, создавая легкое всасывание. Концентрацию, непрерывно продуцируемую на эпикардиальной поверхности, собирают в пробирках с ледяным охлаждением для дальнейшего анализа. Скорость образования КТ варьировалась от 17 до 147 мкл / мин (n = 14) в контроле и инфарктных сердцах, что составляет 0,1-1% от перфузата венозного кровотока коронарных артерий. Протеомический анализ и высокий перфо(ВЭЖХ) показали, что собранный КТ содержит широкий спектр белков и пуринергических метаболитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечная недостаточность (HF) является основной причиной смерти людей во всем мире 1 . HF часто возникает из-за миокардита, ишемических оскорблений миокарда и ремоделирования левого желудочка, что приводит к прогрессирующему ухудшению сердечной сократительной функции и качества жизни пациентов. Хотя успехи в кардиологии и кардиохирургии значительно снизили смертность от HF, они просто служат временными «задержчиками» неизбежно прогрессирующего процесса болезни, который несет значительную заболеваемость. Поэтому нынешнее отсутствие эффективного лечения подчеркивает необходимость выявления новых молекулярных мишеней, которые могут предотвратить или даже обратить вспять ВЧ. Это включает изменения внеклеточного матрикса, неконтролируемый сердечный иммунный ответ и взаимодействия между сердечными и несердечными клетками 2 .

Важно признать, что микроокружение, которое сердечные клетки подвергаются воздействиюФормирует иммунную и регенеративную реакцию поврежденного сердца. В изолированном, физиологическом растворе сердце, КТ образуется на поверхности сердца в виде небольших капелек, которые получены из интерстициального пространства жидкости ( т. Е. Микроокружения), как в физиологических, так и в патофизиологических условиях 3 , 4 , 5 . Поэтому анализ КТ ( т. Е. Интерстициальной жидкости) может помочь определить факторы, которые регулируют сердечный метаболизм и сократительную функцию 6 или влияют на функции иммунных клеток после миграции в поврежденное сердце. Потенциально это может привести к разработке новых терапевтических стратегий для лечения ВЧ.

Коллекция CT от мышиных сердец технически сложна. В обычных сердцах с перпендикулярным Langendorff эксклюзивная коллекция CT трудна, потому что смесь CT с коронарнойПерфузат венозного эффлюента непредсказуемо разбавляет любую концентрацию метаболитов / ферментов, высвобождаемых из интерстициального пространства. Одна из возможных стратегий преодоления этого ограничения заключается в том, чтобы исключить венозный сток путем канюлирования легочной и одновременной лигирования легочной вены 7 . Однако этот метод сталкивается с трудностями, связанными с канюлированием и лигированием легочной артерии и вены, вызывая потенциальную утечку венозных стоков в сердечный трансудат. Концепция использования модели с обратным сердцем была впервые представлена ​​группой Kammermeier, которая перевернула изолированное перфузированное сердце в перевернутое положение и поместила тонкую латексную крышку на эпикардиальную поверхность для непрерывного отбора КТ без загрязнения венозных стоков 8 , 9 . С помощью этой процедуры показано, что КТ обеспечивает очень чувствительную меру метаболитов, высвобождаемых из сердца 9 ,Капиллярный перенос жирных кислот 8 и вирусных частиц 10 .

Совсем недавно парацерновые факторы, которые могут регулировать местный иммунный ответ и увеличивать сердечный ангиогенез 11 , были связаны с положительным эффектом терапии на основе стволовых клеток при сердечных заболеваниях. Анализ КТ в обратном сердце может помочь химически идентифицировать эти отдельные паракринные факторы. Кроме того, КТ может помочь выявить факторы, связанные с активацией иммунных клеток в организме in vivo .

Подробное описание коллекции CT с поверхности сердца, представленной здесь, экспериментально полезно для исследователей, изучающих взаимодействие иммунных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов по отношению к общей сердечной функции. Как упоминалось выше, интерстициальная жидкость переносит информацию для связи между клетками внутри сердца, whIch удобно оценивать по набору КТ. Подробное техническое описание, в том числе видео-протокол о том, как собирать КТ из обратного сердца, должно способствовать будущему применению этой уникальной техники.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты были одобрены местным регулирующим органом ( LANUV of Nordrhein-Westfalen, Германия) и проводились в соответствии с руководящими принципами использования животных. Животных кормили стандартной диеткой чау-чау и получали водопроводную воду ad libitum . Все оборудование и химикаты, необходимые для каждой стадии эксперимента, доступны в Таблице материалов .

1. Подготовка латексной крышки и внутрижелудочкового шара

  1. Сделайте алюминиевую пресс-форму с использованием фрезерного станка, который соответствует среднему размеру сердца крысы (вес тела 300-350 г). Польский пресс-форма с наждачной бумагой сверхтонкой (10/0).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подробные показатели формы показаны на рисунке 1A .
  2. Вертикально закрепите шейку алюминиевой формы на фрезерной машине, чтобы подготовить латексную крышку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Фрезерный станок заставляет плесень медленно вращаться. В качестве альтернативы можно использовать электродвигатель. li>
  3. Налейте 20 мл жидкого латекса (коммерчески приобретенного, см. Таблицу материалов ) в стеклянный стакан емкостью 50 мл.
  4. Опустите пресс-форму до тех пор, пока весь корпус формы не погрузится в раствор латекса.
  5. Медленно поднимите пресс-форму (5 см / мин) во время вращения.
  6. Продолжайте вращать пресс-форму еще на 15 минут, пока латекс на поверхности формы не затвердеет.
  7. Добавьте около 1 г порошка талька к поверхности формы (уже покрытой тонкой латексной пленкой), чтобы предотвратить повреждение при отсоединении.
  8. Аккуратно отсоедините пальцами уже высушенный латексный колпачок с поверхности формы; Латексная крышка теперь готова к использованию ( рисунок 1B ).
  9. Подключите выход крышки латекса к кремниевой трубке 15 см (ID = 0,2 мм), которая используется позже для сбора КТ.
  10. Заполните желудочный латексный баллон водой и прочно закрепите его на L-образной металлической канюле, соединенной с 1 мл наполненным водой шприцем (> Рисунок 1С).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это будет использоваться для обеспечения вертикального позиционирования сердца (см. Ниже).
  11. Удостоверьтесь, что воздушный шар герметичен, выполнив несколько тестов на сдувание / раздувание с помощью прилагаемого 1 мл шприца.
  12. Подключите канюлю через трехходовую остановку к датчику давления для будущего измерения внутрижелудочкового развитого давления ( рис. 1C ).

2. Подготовка буфера Кребса-Хенселейта (КХБ) и системы перфузии Лангендорфа

  1. Настройте систему перфузии Лангендорфа, используя режим постоянного потока (приводимый в действие роликовым насосом) или постоянное давление (созданное статическим давлением в стеклянной колонке).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная информация о подготовке сердца Лангендорфа была описана ранее 12 .
  2. Подготовьте 2 л модифицированного KHB (в мМ: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO 4 · 7H 2 O, 1,21 K 2 HPO 4 , 2,52 CaCl 2 · 2H 2 O, 24,88 NaHCO 3 , 8,30 D-глюкоза и 2,0 пирувата натрия).
    1. Взвесьте все химикаты, но CaCl 2 и растворите их в 1,8 л двуствортой дистиллированной воды в 2-литровой колбе.
    2. Пузырькой с карбоэфиром (95% O 2 /5% CO 2 ) в течение не менее 5 мин для уравновешивания (рН: 7,4) при магнитном перемешивании.
    3. Добавляют 0,74 г CaCl 2 · 2H 2 O и доводят общий объем до 2 л дистиллированной водой.
    4. Продолжать перемешивание и барботирование среды с помощью карбогена в течение дополнительных 5 мин.
    5. Отфильтруйте KHB через фильтр 0,2 мкм, чтобы устранить мелкие частицы, которые могут препятствовать микроциркуляции сердца.
  3. Подготовка системы перфузии Лангендорфа.
    1. Поместите фильтрованный KHB в предварительно нагретую водяную баню (38 ° C); Держите пузырьки с карбогеном, чтобы создать давление 100 смH 2 O insidE KHB-резервуар.
    2. Подключите резервуар к стеклянному столбу, чтобы установить гидростатическое давление 100 смH 2 O для перфузии Лангендорфа с KHB; Продолжайте кипение КХБ внутри колонны с помощью карбогена.
    3. Отрегулируйте температуру системы обогрева так, чтобы температура на выходе из канюли аорты составляла 37 ° C.
    4. Убедитесь, что система труб не содержит пузырьков.
    5. Окислить KHB карбоновым в течение дополнительных 5 минут, пока PO 2 в KHB не достигнет 500-600 мм рт.ст. (измеряется анализатором крови).
  4. Настройте перфузионную систему для работы либо при постоянном давлении 100 см 2 2, либо при постоянном потоке около 10-20 мл / мин с использованием ручного переключения. Альтернативно, используйте сменный контроллер насоса STH, чтобы мгновенно переключиться в режим перфузии.

3. Изоляция и канюляция сердца

ПРИМЕЧАНИЕ. Самцы крыс Wistar с весом тела 300-350 г использовали таким образом, чтобы размеры сердец соответствовали предварительно залитой латексной крышке. Крысам подвергали либо лигирование левого артериального нисходящего (ЛАД) в течение 50 мин, а затем реперфузию или обманывали. Подробная информация о методике индукции инфаркта миокарда (ИМ) была представлена ​​в других местах 13 . Эксперименты с обратным сердцем у животных-инфаркта проводились через 5 дней после операции.

  1. Анестезируйте крыс, используя испаритель изофлюрана (2% об. / Об.), Соединенный с камерой для хранения животных (20 л).
  2. Перенесите крыс на рабочий стол (без контроля температуры) после достижения глубокой анестезии.
  3. Поднимите кожу и мышцы чуть ниже грудины с помощью щипцов и срезайте по нижнему краю ребер тяжелыми ножницами.
  4. Используя тонкие ножницы, сделайте небольшой срез в диафрагме с краем ребра. Вырежьте ребра каудально, чтобы сделать лоскут всей брюшной стенки грудной клетки.
  5. Аккуратно возьмите сердце большим пальцем aЙ и средний пальцы, и медленно поднимите его вверх, чтобы кардиальные сосуды слегка растянулись.
  6. Акцизируйте сердце, пока аорта не будет полностью обнажена.
  7. Поместите сердце в стакан емкостью 100 мл, содержащий 50 мл охлажденного льдом KHB (4 ° C) и переместите его в аппарат для перфузии.
  8. Немедленно подключите сердце через аорту к капельной канюле и надежно затяните ее швом (4-0). Избегайте попадания пузырьков воздуха в сердце.
  9. Примените постоянное давление перфузии (100 см H2O). В качестве альтернативы можно применять полный расход (начиная с 20 мл / мин).
    Примечание: Время от открытия грудной клетки до прикрепления сердца к перфузионной канюле должно занимать около 3 минут в руках опытного оператора.

4. Модель обратного сердечника

  1. Аккуратно поверните канюлю аорты до тех пор, пока задняя стенка сердца не появится.
  2. Удалите соединительную ткань с помощью ножницЧтобы открыть отверстие левого предсердия, сделав его готовым к внутрижелудочковой канюлированию.
  3. Вставьте сдутый латексный баллон, прикрепленный к жесткому катетеру через левое предсердие, в левый желудочек.
  4. Надуйте баллон, пока он не заполнит всю полость желудочка (объем надувания предварительно обозначен на шприце).
  5. Инвертируйте сердце, пока оно не перевернется, поддерживая его внутрижелудочковым баллонным катетером.
  6. Как показано на фиг.1C , механически стабилизируйте перевернутое сердце в вертикальном положении, используя внутрижелудочковый баллон с жестким металлическим катетером.
  7. Отрегулируйте положение сердца, чтобы избежать чрезмерного скручивания корня аорты.
  8. Отрегулируйте диастолическое давление до 3-5 мм рт.ст. (измеряется внутрижелудочковым баллоном, см. Рисунок 1С ).
  9. Соблюдайте эпикардиальную поверхность сердца и убедитесь, что образуются маленькие капли.
  10. Поместите латексную крышку oНа поверхность сердца, мягко подталкивая его, чтобы покрыть все сердце, используя пальцы.
  11. Убедитесь, что латексная крышка покрывает большую часть поверхности желудочка.
  12. Удалите пузырьки воздуха, если они есть, внутри колпачка и трубки, аккуратно сосать шприцем объемом 1 мл.
  13. Отрегулируйте дистальное отверстие трубки CT-letting на 10 см ниже горизонтального уровня сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эта процедура обеспечивает легкое всасывание отрицательным гидростатическим давлением.
  14. Собирайте капли CT в 1,5 мл приемной трубке, помещенной во льду, смешанную 1: 1 с NaCl. Соберите около 0,15-1,5 мл КТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Смесь лед / NaCl стабилизирует температуру в сборной трубе до нуля (около -4 ° C).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время выборки зависит от экспериментальной цели. Скорость течения ТТ составляет около 27 ± 20 мкл / мин у животных, обманутых животными (n = 3) и 100 ± 47 мкл / мин для животных, лишенных коронарных артерий (n = 11).
  15. Модели КТ с взвешиванием и замораживаниемВ жидком азоте и хранить их при -80 ° C для последующих измерений.

5. Анализ КТ

  1. Используйте КТ-жидкость для анализа метаболитов, в зависимости от научного вопроса.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Данные, показанные на фиг. 2 и фиг. 3, собирали из перфузии с постоянным давлением (100 см 2 2 O) и приблизительно 0,15-1,5 мл жидкости ТТ собирали в течение 10 мин. Это время и объем были достаточны для протеомических (минимум: 50 мкл, рисунок 2 ) 14 и ВЭЖХ (минимум: 20 мкл, рисунок 3 ) 15 анализа различных пуринов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель с обратным сердцем позволяет собирать сердечный интерстициальный трансудат в изолированном сердце ретро-перфузии крысы ( рис. 1А-С ). При перфузии при постоянном давлении 100 смH 2 O скорость образования промежуточной жидкости колебалась от 17 до 147 мкл / мин, составляя 0,1-1% от коронарного венозного эффлюента в изолированном сердце.

Было установлено, что содержание белка в ТТ,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель с обратным сердцем основана на хорошо зарекомендовавшем себя методе перфузии сердца Лангендорфа 12 и выполняется простым переворачиванием сердца в перевернутое положение и удерживанием этого положения с использованием жесткого внутрижелудочкового баллонного катетера. Таким образом, кардиальный интерстициальный трансудат может быть физически отделен от перфузата венозного эффлюента, капающего под действием силы тяжести от основания сердца. КТ можно непрерывно собирать с помощью тонкой и гиб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось NSFC 81570244, FoKo 23/2013 и SFB 1116 / B01 и Сердечно-сосудистым исследовательским институтом Дюссельдорф (CARID).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Латексное решениеProChemieZ-Latex LA-TZhttp://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Алюминиевая формаДомашняямодель-Реверсивная модель
сердца Универсальные духовкиMemmertUNB 400Обратная модель сердца
Латексный воздушный шарHugo SachsРазмер 4Модель обратного сердца
Фрезерный станокProxxonMF70Модель обратного сердца
Хлорид натрияSigmaSZBD0810VХимикаты
Гидрокарбонат натрияRoth68852Химикаты
Хлорид калияMerck49361Химикаты
Сульфат магния ГептагидратMerck58861Химикаты
Дигидрофосфат калия Merck48731Химикаты
D(+)-глюкоза безводныйMerck83371Химикаты
Дигидрат хлорида кальцияFluka21097
ВесыVWRSE 1202Взвешивание химикатов
Двойная дистиллированная водаМельничныереагенты
Медицинский преобразователь давленияGold-Langendorff
аппарат Медицинский зондпотока Transonic3PXNЛангендорф аппарат
Нагревательная циркуляционная ваннаHaake В3 ; Аппарат DC1Лангендорфа
Лабораторные и вакуумные трубкиTygonR-3603Аппарат Лангендорфа
Расходомеры для исследований животныхTransonicT206Аппарат Лангендорфа
PowerLab Устройство сбора данныхAD InstrumentsСхема 7.1Аппарат Лангендорфа
Программное обеспечение для сбора данных LabChartAD InstrumentsСхема 7.1Аппарат Лангендорфа
Перистальтический насосГлизонMINIPULS 3Аппарат Лангендорфа
Стеклянный водяной столбСамодельныйаппарат Лангендорфа
Защитное средство для водяной баниVWR462-7000Аппарат Лангендорфа
Стерильные одноразовые фильтры (0,2 & микро; m)Thermo Scientific595-4520Аппарат Лангендорфа
Анализаторы газов кровиРадиометрABL90 FLEX PLUSГазоанализатор
70% этанолVWRUN1170Очистка  трубки
100% этанолMerck64-17-5Чистка трубок
Wistar КрысыЖанвье-животные
Нержавеющие ножницыAESCULAPBC702RХирургические инструменты
Ножницы из нержавеющейAESCULAPBC257RХирургические инструменты
большие ЩипцыAESCULAP-Хирургические инструменты
8м/м Нержавеющие щипцыF.S.T11052-10Хирургические инструменты
сверхтонкие (10/0) наждачная бумага3M051111-11694Обратная модель сердца
стали

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
  2. Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
  3. Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).
  4. de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
  5. Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
  6. Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
  7. De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
  8. Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
  9. Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
  10. Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
  11. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  12. Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908(2015).
  13. Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
  14. Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
  15. Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
  16. Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
  17. Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи