Методическая статья

Химио ферментативного синтеза N- гликанов массив развития и антител ВИЧ профилирования

DOI:

10.3791/55855

⸱

5 февраля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модульный подход к синтезу N- гликанов для крепления к оксида алюминия покрытием стекла слайд (ACG слайд) как glycan microarray был разработан и его использование для профилирования широко нейтрализующих антител ВИЧ была продемонстрирована.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем очень эффективный способ для быстрой подготовки широкого круга N-связанных олигосахариды (по оценкам превышает 20 000 структур), которые обычно встречаются на человеческих гликопротеинов. Для достижения желаемого структурного разнообразия, стратегии началось с химио ферментативный синтез трех видов oligosaccharyl фторид модулей, следуют их поэтапного α-селективного glycosylations на 3-O -6O позиции манноза остатки общих основных трисахариды, имеющие решающее значение β-mannoside связь. Далее мы придает N- гликанов поверхности оксида алюминия покрытием стекла (ACG) слайд для создания ковалентных смешанные массива для анализа взаимодействия гетеро лиганда с антитела ВИЧ. В частности поведение привязки вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAb), PG9, смесь близко расположенными человек5GlcNAc2 (5человек) и 2,6-ди sialylated Би antennary комплекс типа N- glycan (SCT ) на массив ACG, открывает новые возможности для руководства эффективным immunogen дизайн для разработки вакцины против ВИЧ. Кроме того наш массив ACG воплощает в себе мощный инструмент для изучения других антител на ВИЧ для привязки гетеро лиганд.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N- гликанов на гликопротеинов ковалентно связаны с аспарагин (Asn) остатки Asn-Xxx-Ser/Чет sequon консенсуса, которые затрагивают несколько биологических процессов, как белка конформации, антигенностью, растворимость и Лектин признание 1 , 2. Химический синтез N-связанных олигосахариды представляет собой значительный вызов синтетических из-за их огромные структурной неоднородности микро и весьма разветвленной архитектуры. Тщательный отбор защиты групп для настройки реактивности строительных блоков, достижения селективности в anomeric центрах и надлежащего использования промоутер / activator(s) являются ключевыми элементами в синтезе сложных олигосахариды. Для решения этой проблемы сложности, большой объем работы для продвижения N- glycan синтез сообщалось недавно3,4. Несмотря на эти надежные подходы находить эффективный метод для подготовки широкого круга N- гликанов (~ 20000) остается основной задачей.

Быстрой мутации ВИЧ-1 для достижения обширные генетического разнообразия и его способность бежать от нейтрализации реакции антитела, составляет среди наиболее серьезных проблем для разработки безопасных и профилактической вакцины против ВИЧ-15,6 , 7. одна эффективная тактика, что ВИЧ использует, чтобы избежать иммунного ответа является столб-поступательные гликозилирования оболочки gp120 гликопротеин с разнообразной N-связаны гликаны, производные от принимающей гликозилирования машины8, 9. Недавний доклад относительно точный анализ рекомбинатных мономерных гликозилирования gp120 ВИЧ-1 от 293T клеток человеческого эмбриона почек (ГЭС) предполагает возникновение структурных микрогетерогенности с характерным клеток конкретных шаблон10 , 11 , 12. Таким образом, понимание специфики glycan ВИЧ-1 bNAbs требует хорошо характеризуется gp120 связанных с N- glycan структур в количестве, достаточном для анализа.

Открытие технологии microarray glycan условии высокой пропускной способности на основе изучение особенности широкий спектр углеводов связывающих белков, вирусы/бактериальных адгезины, токсинов, антител и lectines13,14 . Организация систематического гликанов в формате выстроились на основе чипа может определить проблематичным низкого сродства белка glycan взаимодействия через многовалентных презентация15,16,17,18. Этот механизм на основе чипа glycan удобно, как представляется, эффективно имитировать интерфейсы ячеек. Чтобы обогатить технологии и преодоления неравномерным проблема, связанная с обычными массив форматов, наша группа недавно разработали glycan массив на слайде оксида алюминия покрытием стекла (ACG), с помощью фосфоновая кислота закончился гликанов для повышения интенсивности сигнала, однородность и чувствительность19,20.

Для улучшения нынешнего понимания о glycan epitopes вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAbs), мы разработали стратегию высокоэффективная модульная для подготовки широкого спектра N-связаны гликанов21 ,22 быть напечатаны на ACG слайд (см. Рисунок 1). Специфика профилирования исследования ВИЧ-1 bNAbs на массив АКГ предложили необычные обнаружения гетеро glycan поведение привязки сильнодействующим bNAb PG9, который был изолирован от ВИЧ инфицированных лиц23,24,25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка D1/D2 руку модули22

  1. Подготовка промежуточной 2
    1. Весят начиная материала 1 (показано на рисунке 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 мг, 0,204 ммоль)) в 15 мл трубку и растворить в Tris содержащие буфер (25 мм, pH 7.5) дихлорид марганца (НКД2, 10 мм) для достижения окончательного glycan концентрации 5 мм.
    2. Добавьте 2 эквиваленты уридина дифосфат галактозу (UDP-Gal).
    3. Добавить 150 единиц фермента β-1, 4 galactosyl трансферазы из бычьего молока и инкубировать смеси на 37 oC на 15 h.
    4. После 15 ч, тонкий слой хроматографии (ТСХ) чтобы указать общее потребление исходного материала путем выявления реакционной смеси на плите TLC, разработка с n-бутанол/уксусной кислоты/воды (H2O) 1:1:1 коэффициент и окрашивания раствор 0,25 М церия аммония молибдата следуют Отопление. Затем утолите реакцию при нагревании в 90 oC на 5 мин.
    5. Центрифуга реакционной смеси со скоростью 2737 g x 3 мин и загрузить супернатант в верхней части столбца геля полиакриламида (см. Таблицу материалы). Элюировать столбца с помощью дистиллированной деионизированной воды и собирать продукт с фракций 1-2 мл.
    6. Контролировать сбор фракций на TLC26, разработка с n-бутанола: H2-O: уксусной кислоты 1:1:1 соотношение и пятнать раствором церия аммония молибдата следуют Отопление. Lyophilize27 продукт, содержащий дроби для получения промежуточных 2 (115 мг, 86%), как белый порошок. Характеризовать продукт ЯМР28 и29 масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).
  2. Подготовка промежуточной 3
    1. Весят начиная материала 2 (показано на рисунке 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 мг, 0,122 ммоль)) в 15 мл трубку и растворить его в трис буфер (25 мм, pH 7.5) содержащий НКД2 (10 мм) для подготовки окончательного glycan концентрации 5 мм.
    2. Добавьте 2 эквиваленты гуанозина 5'-diphospho-β-L-Фукоза динатриевая соль (ВВП-ОФП).
    3. Добавить 150 единиц фермента α-1, 3 fucosyl трансферазы от Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) и инкубировать смеси на 37 oC на 15 h.
    4. Выполните шаг 1.1.4.
    5. Выполните шаг 1.1.5.
    6. Выполните шаг 1.1.6 для получения промежуточных 3 (82 мг, 84%), как белый порошок. Характеризовать продукт ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).
  3. Подготовка модулей 4 и 5
    1. Взвешивать составные 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0,360 ммоль) или составные 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 г, 0,125 ммоль) в 25 мл сингл шея раунд нижней колбе и сушат под вакуумом для 30 мин.
    2. Снять Склянка вакуума, заполнить его с газом азота, добавить панель магнитные перемешать, кепка с резиновой перегородки и прикрепить всплывающую азота.
    3. Inject 7 мл сухого пиридина и 3 мл ангидрида уксусной кислоты (Ac2O) в колбу на ледяной бане на 0 oC. Stir результирующая реакция на 12 ч при комнатной температуре с помощью магнитной мешалкой в 600-700 об/мин. Испарения растворителей, с помощью поворотной испарителя на вакуумные давления 0 - 10 мбар при 50 oC.
    4. Разбавить сырой смеси с использованием дихлорметана (DCM) по 30 мл и извлекать с насыщенного водного раствора натрия гидрокарбоната (3NaHCO) (2 x 20 мл) в воронку separatory 50 мл.
    5. Заново распаковать водный слой с DCM (3 x 15 мл) и сухие комбинированные органических слоев за сульфат натрия. Удалите сульфат натрия, фильтрации и мыть с DCM (5 мл). Испарения растворителя, используя роторный испаритель в 400 мбар вакуумного давления на 40 oC.
    6. Загрузите решение сырой смеси в 2 мл DCM верхней кровати кремнезема.
    7. Элюировать столбец со смесью, содержащей толуола и ацетон от 0 - 20% ацетона в толуоле и собирать фракции 5-10 мл.
    8. Контролировать сбор фракций методом ТСХ (шаги 1.1.4 и 1.1.6), разработка с толуол/ацетон (7/3), и окрашивание с раствором церия аммония молибдата следуют Отопление на горячей плите.
    9. Испарения продукта, содержащего фракций, используя роторный испаритель, чтобы получить желаемые товары как белой пены в 72% и 85% доходности, соответственно.
    10. Наплыв 7 мл Ацетонитрил продукции: Толуол: H2O 4: соотношение 2:1 в раунд нижней колбе 25 мл.
    11. Добавление церия аммония нитрата (2 эквиваленты) во время охлаждения до 0 oC помощью ледяной бане. Перемешайте реакции при комнатной температуре 3 h на ~ 500-800 об/мин.
    12. После TLC указывает общее потребление исходного материала (TLC развивающихся толуол ацетоном (7/3) и визуализации с УФ поглощения в 254 Нм или путем пятнать с раствором церия аммония молибдата следуют Отопление), разбавьте смесь реакции с Этилацетат (30 мл) и экстракт с H2O (15 x 2 мл).
    13. Экстракт комбинированных органических слоев с 5 мл раствора насыщенным хлорида натрия (NaCl).
    14. Испарения растворителя, используя роторный испаритель в 240 мбар вакуумного давления на 40 oC.
    15. Загрузите решение сырой продукт в 2 мл DCM верхней кровати кремнезема. Элюировать столбец со смесью, содержащей толуола и ацетон (0 - 20% ацетона в толуоле) и собирать фракции 5-10 мл. Контролировать сбор фракций методом ТСХ, разработка с толуол/ацетон (7/3).
    16. Испарения продукта содержащие фракции, используя роторный испаритель в 77 мбар вакуума и 40 oC, чтобы получить желаемые товары как белой пены.
    17. Растворить в 10 мл DCM в 25 мл сингл шея раунд нижней колбе и здорово-30 oC. соответствующие спирты
    18. Добавьте diethylaminosulfur фторид (ДАСТ, 2 эквиваленты). Перемешайте смесь реакции на-30 oC на 2 ч.
    19. После TLC показывает потребление исходного материала (TLC развивающихся толуол ацетоном (4/1) и визуализации с УФ поглощения в 254 Нм или путем пятнать с раствором церия аммония молибдата следуют Отопление), разбавьте смесь реакции с DCM (30 мл) , и мыть с насыщенным NaHCO3 (15 x 2 мл).
    20. Экстракт комбинированных органический слой с 5 мл насыщенного раствора NaCl, высушить его, добавив безводный сульфат магния, фильтровать смеси после мытья с DCM (5 мл) и собрать его в 100-мл сингл шеи раунд нижней колбе.
    21. Испарения растворителя, используя роторный испаритель в 400 мбар вакуумного давления на 40 oC.
    22. Загрузите решение сырой продукт в 2 мл DCM верхней кровати кремнезема. Элюировать столбец с смеси толуола и ацетон (0-20% ацетона в толуоле) и собирать фракции 5-10 мл.
    23. Контролировать сбор фракций методом ТСХ, разработка с толуол/ацетон (7/3).
    24. Испарится продукт, содержащий фракций, используя роторный испаритель, чтобы получить желаемые товары 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl фторид (54% над 2 шага) и 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl фторид (67% над 2 шага) как белые твердые вещества.
    25. Характеризовать продукт ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).

2. Подготовка Glycan 10

  1. Подготовка intermidiate 7
    1. Весить Дихлорид Серебряный трифлатов (AgOTf) (0.039 g, 0,155 ммоль), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 ммоль) в 25 мл сингл шеи раунд нижней колбе, сушить под вакуумом Шленк линии для 30 минут, удалить его из вакуумные и заполнить его с газом азота.
    2. Перевести свежезаваренным сушеные 4 Å молекулярные сита (0,2 г) в колбу, содержащие AgOTf и Cp2HfCl2, добавить магнитные перемешать бар, кепка с перегородка немедленно и добавить a азота шар.
    3. Перевести 3 мл сухого толуола в колбу с сухой стеклянный шприц. Перемешать смесь реакции на 1 ч при комнатной температуре и затем охладить до 0 oC.
    4. Внедрить решения доноров 4 (рис. 2, 0,043 г, 0,046 ммоль) и акцептор 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (рис. 3, 0,045 г, 0,031 ммоль) в 3 мл толуола в колбе через перегородки, используя шприц 10 мл 0 o C. перемешайте смесь реакции при комнатной температуре в течение 3 ч.
    5. После того, как TLC показывает потребление исходных материалов (TLC, разработка ацетоном и DCM (8,5/1.5) и визуализации с УФ поглощения в 254 Нм или путем пятнать с раствором церия аммония молибдата следуют Отопление), утолить реакции путем инъекций 10 эквиваленты triethyl Амин.
    6. Фильтр молекулярные сита через кровать celite в 50-мл флакон круглодонные и далее мыть с 10 мл этилацетата. Экстракт комбинированных органических слоев с насыщенный раствор водный NaHCO3 (2 x 20 мл) в воронку separatory 50 мл. Экстракт водный слой с этилацетат (3 x 15 мл).
    7. Экстракт комбинированных органических слоев с насыщенным раствором NaCl (5 мл), высушить его с помощью безводный сульфат магния, фильтр смесь для удаления магния сульфат, мыть с этилацетат (3 x 15 мл) и сбора фильтрата в 100-мл флакон круглодонные.
    8. Испарения растворителя, используя роторный испаритель в 240 мбар вакуумного давления на 40 oC.
    9. Загрузите решение сырой продукт на колонне кровать кремнезема в DCM. Элюировать столбец со смесью, содержащей DCM и ацетон (0-10% ацетона в DCM) и собирать фракции 5-10 мл.
    10. Контролировать сбор фракций методом ТСХ, разработка ацетоном и DCM (8,5/1.5). Испарится фракций, содержащих продукта с помощью роторный испаритель для получения intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70%), как белой пены.
    11. Характеризовать продукт ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).
  2. Подготовка intermidiate 8
    1. Весят hexasaccharide 7 (рис. 3, 0.040 g, 0,016 ммоль) в 25 мл сингл шеи раунд нижней колбе, сушить под вакуумом для 1 h, удалите его из вакуума, заполнить его с газом азота, добавить панель магнитные перемешать и шапочка с резиновой перегородки.
    2. Перевести 3 мл acetonitrile:methanol (метанола) (соотношение 2:1) в колбу.
    3. Добавить p-толуол сульфокислоты моногидрат (0,001 г, 0,008 ммоль) в реакции колбу и перемешать реакции на 800 об/мин за 5 ч.
    4. После того, как TLC указывает comsumption начиная материал (TLC, разработка ацетоном и DCM (8,5/1.5) и визуализации с УФ поглощения в 254 Нм или путем пятнать с раствором церия аммония молибдата следуют Отопление), утолить реакции путем инъекций 10 эквиваленты triethyl Амин.
    5. Испарения растворителя, используя роторный испаритель в 337 мбар вакуумного давления на 40 oC.
    6. Растворить в сырой смеси с примерно 2 мл DCM и загрузить его на верхней кровати кремнезема.
    7. Элюировать столбец с смесь DCM и ацетон (0 - 10% ацетона в DCM) и собирать фракции 5-10 мл. Контролировать сбор фракций методом ТСХ, разработка ацетоном и DCM (8,5/1.5). Испарения растворителя, с помощью роторный испаритель в 400 мбар вакуума и 40 oC.
    8. Сухой остаток при пониженном давлении дать промежуточные 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-ацетил-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Рис. 3, 0,022 g, 57%) как белое вещество. Характеризовать продукт ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).
  3. Подготовка intermidiate 9
    1. Подготовка intermidiate 9 (рис. 3) было выполнено с помощью доноров 5 (0,015 г, 13.2 мкмоль) и акцептор 8 (рис. 3, 0,020 г, 8.80 мкмоль).
    2. AgOTf (0.011 g, 44.1 мкмоль) и Cp2HfCl2 (0,012 г, 30,8 мкмоль) были использованы в качестве промоторов.
    3. Выполните шаги 2.1.1 для 2.1.10 для получения промежуточных 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-объемным-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-уплотнительное-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-объемным-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-уплотнительное-triacetyl-α-объемным-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as белой пены.
  4. Глобальный deprotection intermidiate
    1. Взвешивать составные 9 (0,010 г, 2.9 мкмоль) в 25 мл сингл шеи раунд нижней колбе, добавить строку магнитные перемешать, колпак с резиновой перегородки и прикрепить всплывающую азота.
    2. Перевод 2 мл 1, 4 диоксан: H2O (4:1) в колбу. Гидроксид лития (LiOH) (0,005 г, 50% веса) добавьте в настой. Перемешать смесь реакции на 90-100 oC на 12 h и дайте ему остыть на RT.
    3. Испарения растворителей, с помощью роторный испаритель и сухой колбу в вакууме за 1 ч, заполнить его с азотом, удалите его из вакуумного коллектора и крышка с резиновой перегородки.
    4. Вдохнуть 4 мл сухого пиридина и 2 мл ангидрида уксусной кислоты в колбе через перегородки, используя шприц 10 мл на 0 oC. Stir реакционной смеси для 12 h на RT.
    5. Испарения растворителей, с помощью роторный испаритель в 0-10 мбар вакуумного давления на 50 oC.
    6. Распустить сырой смеси, используя 30 мл DCM и извлечь решение с насыщенный водный NaHCO3 (2 x 20 мл) в воронку separatory 50 мл.
    7. Заново распакуйте водный слой с DCM (3 x 15 мл). Испарения растворителя, с помощью роторный испаритель.
    8. Загрузите решение продукта в примерно 2 мл DCM верхней кровати С18 кремния. Элюировать столбец со смесью воды и метанола (0 - 100% метанола в воде) и собирать фракции 5-10 мл.
    9. Сбор фракций продуктов и испаряются при сниженном давлении для получения желаемого продукта как белой пены.
    10. Растворите продукта в 5 мл сухого метанола в 25 мл вокруг нижней колбе и шапочка с резиновой перегородки.
    11. Передавать 0 oC помощью ледяной ванне 0,1 мл натрия метоксида (NaOMe) в метаноле и прохладный и размешать смесь для 12 h.
    12. Удаление растворителя, с помощью роторный испаритель и сухой продукт под высоким вакуумом.
    13. Распустить сырой продукции в 5 мл метанола: H2O: уксусной кислоты (6:3:1).
    14. Добавить палладия гидроксид (2Pd(OH)) (50% по wt) и перемешать реакции в атмосфере водорода с использованием водорода шар для 15 h.
    15. Фильтр реакции через кровать celite и мыть с 2 мл метанола, следуют 2 мл dd воды.
    16. Испарения растворителей, с помощью роторный испаритель.
    17. Распустить сырой смеси с приблизительно в 1 мл воды и загрузить его на вершине геля полиакриламида кровати (см. Таблицу материалы). Элюировать продукт с водой и сбора фракций 1-2 мл.
    18. Контролировать сбор фракций методом ТСХ, развивать с n-бутанола: H2O: уксусной кислоты (СУПЕРГУМИКОРА).
    19. Сбор продукции фракций и lyophilize чтобы получить желаемый продукт 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a белый порошок.
    20. Характеризовать продукт ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных).

3. Подготовка гликанов с фосфоновая кислота хвост19,22

  1. Весят соответствующих glycan (2-5 мкмоль) в 5 мл раунд нижней колбе, добавить панель магнитные перемешать и шапочка с резиновой перегородки.
  2. Перевести 400 мкл свежезаваренным сушеные диметилформамиде.
  3. Добавить [2 (2 (2 (бис (бензилокси) фосфорила) ethoxyethoxy) этил (2, 5-dioxopyrrolidin1-ил) карбонат] (10-25 мкмоль, подготовленный в доме) в glycan решение. Перемешайте смесь на 800 об/мин за 5 ч.
  4. Испарения растворителей, с помощью поворотного испарителя на 5-10 мбар вакуумного давления на 40 oC.
  5. Распустить реакционной смеси в 0,5 мл воды и загрузить в верхней части кровати геля полиакриламида (см. Таблицу материалы). Элюировать продукта с помощью воды и сбора фракций 1-2 мл.
  6. Контролировать сбор фракций на TLC26. Пятно реакционную смесь на плиту TLC и добавить решение пятен 0,25 М церия аммония молибдата; следить за отопление с помощью горячей плите. Сбор за продукт, содержащий фракций и lyophilize чтобы получить желаемый продукт как белый порошок.
  7. Растворять продукт в 2 мл воды и добавить Pd (OH)2 (50% по весу). Перемешайте реакции на 800 об/мин в атмосфере водорода с использованием водорода шар для 15 h.
  8. Фильтр реакции через поток кальцинированный кровать и мыть с 2 мл метанола, следуют 2 мл дистиллированной деионизированной воды. Испарения растворителей, с помощью роторный испаритель в 300 мбар вакуумного давления на 40 oC.
  9. Распустить сырой смеси с приблизительно в 1 мл воды и загрузить его на вершине геля полиакриламида кровати (см. Таблицу материалы).
  10. Элюировать продукт с водой и сбора фракций 1-2 мл. Контролировать сбор фракций на TLC26. Lyophilize фракции (заморозить продукт с помощью жидкого азота, то место на лиофилизатор под вакуумом) для получения желаемого продукта как белый порошок. Характеризуют продукцию ЯМР и масс-спектроскопии (см. дополнительный файл данных) с помощью D2O как растворитель.

4. Glycan массив

  1. Подготовка алюминия с покрытием стекла слайды (ACG слайд) 19 , 20 , 22
    Примечание: Изготовление алюминиевым покрытием стекла слайдов было сделано в тонких разделения фильме технологии, инструмент исследовательский центр технологий и национальных применяется научно-исследовательских лабораторий, парк науки Синьчжу, Тайвань.
    1. Пакет с покрытием слайды, вакуум уплотнение, их для предотвращения формирования НАО и держать закрытой до электрохимической реакции на поверхности анодирование.
  2. Поверхности анодирование алюминия с покрытием стекла слайды 19 , 20 , 22
    1. Установите инкубатор температуры на 4 ° C. Подготовить водный раствор щавелевой кислоты 0,3 М и держать его в ледяной бане. Возьмите стакан 500 мл, добавить панель магнитной мешалкой.
    2. Передать щавелевая кислота 0,3 М 500 мл стакан, а затем поместите стержень 10 см длиной платина как катода в раствор. Держите перемешивания (на 300 об/мин) щавелевую кислоту на протяжении всего процесса анодирования.
    3. Включите лаборатории tracer программного обеспечения, нажмите на кнопку «Настроить», то «функция выбора развертки напряжения.» Задать начало и остановить напряжения в 25,8 V, количество точек до 100, соответствие 1 и развертки задержки до 1200 ms и нажмите кнопку «ОК».
    4. Зажим с алюминиевым покрытием стекла стороны обращенной к катоду. Нажмите кнопку «запуска тест». Соблюдайте измерения тока (~ 8-10 мА).
    5. После поверхности анодирование слайд с двойной дистиллированной водой тщательно вымыть, очистить сухим азотом и затем хранить в камере 30% относительная влажность до дальнейшего использования.
  3. Изготовление ACG glycan microarray 22
    1. Подготовка 100 мкл всех моновалентной гликанов (I-XI) в этиленгликоля в концентрации 10 мм индивидуально.
    2. Разбавьте выше glycan с буфера печати (80% этиленгликоля и 20% деионизированной воды) чтобы сделать 100 мкм концентрации.
    3. Гетеро лиганд исследования подготовить 5 мкл гликанов отдельных I-XI и каждому мкл 5 человек5GlcNAc2 (соотношение 1:1).
    4. Печать microarrays, Роботизированная закрепить (см. Таблицу материалы), осаждения 0,6 nL ранее подготовленных гликанов на ACG слайды31.
    5. Храните Распечатанные слайды в коробке под контролем влажности сухой перед assay привязки.
  4. Картирование glycan epitopes широко нейтрализующих антител ВИЧ-1 PG9 22
    1. Подготовка 1 мл раствора БСА содержится PBST буфера, 3% w/v.
    2. Подготовка 70 мкл PG9 (50 мкг/мл) в PBST буфера (BSA содержится PBST буфера, 3% w/v).
    3. Подготовка 120 мкл антител вторичных флуоресцентные метки осла античеловеческие IgG (Alexa Fluor 647 конъюгированных) 50 мкг/мл в буфере PBST (BSA содержится PBST буфера, 3% w/v) в темноте.
    4. Mix основное антитело (PG9) и вторичные флуоресцентные метки антитела в соотношении 1:1 (по 60 мкл). Инкубировать готовые антитела для 30 мин при 4 ° C.
    5. Загрузите слайд АКГ в камеру слайд инкубации, которая делится на 16 скважин. Передать массив glycan 100 мкл готовые антитела и Инкубируйте на 4 ° C на 16 h.
    6. Накапайте вне готовые антитела. Удалите слайд инкубации камеры.
    7. Сначала вымойте слайд в буфер PBST (PBS и 0,05% Tween-20), а затем деионизированной водой и сухой в 2000 x g спина.
    8. Откройте программное обеспечение для анализа изображений microarray дна (см. Таблицу материалы). Вставьте слайд с выстроились особенности вниз.
    9. Нажмите в меню «Параметры», установите разрешение изображения до 5 мкм на пиксель и волны в 635 нм с PMT450 и мощностью до 100%.
    10. Нажмите на кнопку «Проверка», чтобы начать изображений слайд.
    11. Нажмите значок «файл», чтобы сохранить изображение сканирования в формате tif.
    12. Выполните анализ изображений, следуя руководство пользователя программного обеспечения32.
    13. Расчет общей интенсивности флуоресценции и проиллюстрировать с помощью программного обеспечения33 обработки изображений (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Здесь, средний процент ошибок для всех точек данных представлен погрешностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модульные химио ферментативный стратегия для синтеза широкий спектр N -гликанов представлена на рисунке 1. Стратегия является основывается на том, что разнообразие могут быть созданы в начале химио ферментативный синтез трех важных модулей, следуют α-конкретных mannosylation в 3-O или 6-O положение маннозы остатки общего Основные Трисахариды N- гликанов. Учитывая структурного разнообразия би-, три- и Тетра antennary сложный...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Класс bNAbs ВИЧ-1, включая PG9, PG16 и PGTs 128, 141-145 были сообщается сильнодействующим в нейтрализации 70-80% циркулирующих изолятов ВИЧ-1. Среди вариантов всей группы ВИЧ-1 M высоко сохраняются epitopes этих bNAbs, поэтому они могут вести эффективную immunogen дизайн для вакцины против ВИЧ для получения нейтрализующих антител23,24,25 . В рамках наших постоянных усилий по идентификации glycan epitopes широко нейтрализующих а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят тонких разделения фильме технологии, инструмент технологии исследовательский центр (ITRC) и национальных применяется научно-исследовательских лабораторий, парк науки Синьчжу, Тайвань. Эта работа была поддержана национального научного Совета (Грант нет. Большинство 105-0210-01-13-01) и Синика.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаSigma Aldrich64197
АцетонитрилSigma Aldrich75058
Ангидрид уксуснойкислоты Sigma Aldrich108247
Безводный сульфат магнияSigma Aldrich7487889
трифторид бора этиловый эфирSigma Aldrich109637
Бычий сывороточный альбуминSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 полиакриламидBio-Rad1504118
бис(циклопентадиенил)гафния(IV) дихлоридSigma Aldrich12116664
β-1, 4 галактозилтрансферазы из коровьего молокаSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion technology с роботизированным штифтом SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Молибдат церия и аммонияTCIC1794
Нитрат церия аммонияSigma Aldrich16774213
Предметное стекло чистое Schott 
Цитидин-5′-монофосфо-N-ацетилнейраминовая кислотаSigma Aldrich3063716
дейтерированный хлороформSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 конъюгированныйJackson Immuno Research, США709605098
дихлорметанSigma Aldrich75092
Трифторид диэтиламиносульфурыSigma Aldrich38078090
ДиметилформамидSigma Aldrich68122
ЭтилацетатSigma Aldrich141786
ЭтиленгликольAcros Organic107211
FAST рама для инкубационных камерSigma Aldrich
Guanosine 5'- дифосфо-b-L-фукозная динатриевая соль Программное обеспечение Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 Раздел 4 протокола
GenePix Pro 4300A reader (микрочиповый анализ изображений)Молекулярные устройстваwww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (обработка изображений)GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Гидроксид литияSigma Aldrich1310652
хлорид марганцаСигма Олдрич7773015
МетанолСигма Олдрич67561
N-бутанолСигма Олдрич71363
Щавелевая кислотаАкрос Органик144627
гидроксид палладияСигма Олдрич12135227
фосфат Буферизованный физиологический растворThermo Fisher Scientific 
ПиридинСигма Олдрич110861
-толуолсульфоновая кислота моногидратСигма Олдрич773476
Трифлат серебраСигма Олдрич2923286
Бикарбонат натрияСигма Олдрич144558
Хлорид натрияСигма Олдрич7647145
Натрий гидрокарбонатSigma Aldrich144558
метоксид натрия Сигма Олдрич124414
сульфат натрияСигма Олдрич7757826
толуол Сигма Олдрич108883
Трис буфер AmrescoN/AУльтрачистый сорт
Tween-20Amresco9005645
Уридиндифосфат галактозы (UDP-галактоза)Sigma Aldrich137868521
10010023

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094(2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581(2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NPG9

Похожие статьи