Синаптических пузырьков эндоцитоза обнаруживается световой микроскопии pHluorin сливается с синаптических пузырьков белка и электронной микроскопии везикул поглощения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измеряя эндоцитоза синаптических пузырьков в культивированный Нейроны гиппокампа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Во время эндоцитоза расплавленный синаптических пузырьков извлекаются на нервные окончания, позволяя для рециркуляции везикул и, таким образом, поддержание синаптической передачи во время повторяющихся нервных стрельбы. Нарушением эндоцитоза в патологических условиях приводит к уменьшается в синаптической силы и мозга функции. Здесь мы описываем методы, используемые для измерения эндоцитоза синаптических пузырьков на млекопитающих гиппокампа синапсов в нейрональных культуры. Мы мониторинг синаптических пузырьков белка эндоцитоза путем сплавления синаптических везикулярного мембранный белок, включая synaptophysin и VAMP2/Синаптобревин, на стороне везикулярного lumenal, с pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок, который увеличивает его увеличивает интенсивность флуоресценции как pH. Во время экзоцитоз везикулярной люмен рН увеличивается, тогда как во время эндоцитоза везикулярного люмен рН восстановления подкисленных. Таким образом увеличение интенсивности флуоресценции pHluorin указывает фьюжн, а уменьшение эндоцитоза помечены синаптических пузырьков белка. Помимо использования метода pHluorin изображений для записи эндоцитоза, мы контролируется везикулярного мембраны эндоцитоза измерениями электронной микроскопии (EM) хрен пероксидазы (ПХ) поглощения везикулы. Наконец мы за формирование нервных терминал мембраны ямы в разное время после высокой калия индуцированной деполяризации. Время курс HRP поглощения и мембраны яму формирования указывает время курс эндоцитоз.
Введение
Медиаторы хранятся в синаптических пузырьков и выпущенный экзоцитоз. Синаптических везикул мембранных белков затем учитываются путем эндоцитоза и повторно в следующем раунде экзоцитоз. Эндоцитоза синаптических пузырьков имеет важное значение для поддержания синаптических пузырьков бассейны и удаляет выступающих везикулы от плазматической мембраны. РН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок pHluorin, которая угасает в кислотных обстоятельствах и dequenched в нейтральном pH, был использован для измерения времени эндоцитоза курсы в живой клетки1,2,3. PHluorin белок обычно п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: следующий протокол описывает методы визуализации pHluorin и EM методы, используемые в культивированный Нейроны гиппокампа. pHluorin мониторы синаптических пузырьков белка поглощения в живых клетках и EM обнаруживает усвоение синаптических пузырьков и ультраструктурные изменения.
Уход за животными и процедура руководящими низ и были одобрены NIH животных ухода и использования Комитетом.
1. pHluorin Imaging
- гиппокампа нейрон культуры
- подготовить гиппокампа буфера (HB), объединив 4 мм NaHCO 3 и 5 мм HEPES и приспособиться к рН 7.3 с 5 M NaOH. Сделайте пита....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью метода перевозчик липидов, SpH была выражена в Нейроны гиппокампа, позволяя для идентификации boutons (рис. 1a). Электрическая стимуляция клеток индуцированной экзоцитоз и соответствующее увеличение интенсивности флуоресценции. Увеличение флуоресцирования (ΔF) был остановлен, положив конец стимул (рис. 1b). Увеличение флуоресценции последовал медленное снижение, благодаря эндоцитоз. В случае VAMP2-pHluorin VAMP2 диффунд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы продемонстрировать два метода для мониторинга синаптических пузырьков эндоцитоз. В первом методе мы наблюдает pHluorin сливается с протеином синаптических пузырьков в transfected нейронов и впоследствии электрически стимулировали. Во-вторых мы использовали EM изображений HRP поглощения как индуцированных KCl. Мы использовали различные раздражители по двум причинам. Во-первых высоким содержанием калия приложение вызывает деполяризации всех нейронов в культуре. Это облегчает EM экспертизы, учитывая, что наша метод.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим д-р Ён-Линг Zhu за предоставление synaptophysin-pHluorin2x конструкцию и д-р Джеймс э. Ротман для обеспечения VAMP2-phluorin. Мы благодарим д-р Сьюзен Чэн и Вирджиния Crocker NINDS микроскопии фонда за их техническую поддержку и помощь. Эта работа была поддержана Национальный институт неврологических нарушений и инсульта интрамуральных исследовательской программы в США и Грант от KRIBB исследовательской инициативе программы (корейский биомедицинских ученый программа стипендий), Корея научно-исследовательский институт Бионауки и биотехнологии, Республика Корея.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Липофектамин LTX с Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Трансфекция плазмидной ДНК, включая синаптофизин или нейробазальную среду VAMP2-pHluorin |
| Thermo | Fisher | 21103-049 | Питательная среда для нейронов, прогрев до 37°; C перед применением |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Градиент для дифференцировки нейронов |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Градиент для культуры нейронов |
| Poly-D-лизин покрытый покровный лист | Neuvitro | GG-25-pdl | Субстрат для роста нейронов и визуализации pHluorin |
| Trypsin XI из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma | T1005 | Neuronal культура-расщепление тканей гиппокампа |
| Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота | Sigma | D5025 | Нейрональная культура-ингибирование вязких клеток суспензия |
| пульс-стимулятор | А-М системы | модель 2100 | Применение электростимуляции |
| Щелевая ванна с стимуляцией поля | Warner Instruments | RC-21BRFS | Применение электростимуляции |
| изолятора | стимулаWarner Instruments | SIU102 | Применять электростимулирующую |
| смазку | Dow corning | 111 | pHluorin imaging seal с покровным стеклом и камерой визуализации, избегать утечки из камеры |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient для нормального физиологического раствора, селективный антагонист NMDA-рецепторов, подавлять постсинаптическую активность, которая имеет потенциал для рецидивирующей активности |
| CNQX | Tocris | 190 | Градиент для нормального физиологического раствора, конкурентный антагонист AMPA/каинатных рецепторов, ингибирует постсинаптическую активность, которая имеет потенциал для рецидивирующей активности |
| Осветитель | Nikon | C-HGFI | Металлогалогенный источник света для фотоаппарата pHluorin |
| EMCCD | Andor | iXon3 | pHluorin визуализация, обнаружение интенсивности флуоресценции pHluorin |
| Инвертированная микроскопия | Nikon | Ti-E | Визуализация для трансфицированных клеток синаптофизина или VAMP2 pHluorin |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software для получения и анализа изображений |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Программное обеспечение для анализа изображений и представления данных |
| камера визуализации | Warner Instruments | RC21B | pHluorin, применение стимуляции поля на живых клетках |
| поли-l-лизин | Sigma | P4832 | Электронная микроскопия, субстрат для роста нейронов, нанести на многолуночный планшет в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промыть стерилизованной водой 3 раза |
| Пероксидаза хрена (HRP) | Sigma | P6782 | Электронная микроскопия, мечение эндоцитозированных синаптических везикул путем катализа DAB в присутствии перекиси водорода, конечная концентрация 5 мг/мл в нормальном физиологическом растворе, сделать свежим перед использованием |
| Na какодилат | Электронная микроскопия наук | 12300 | Электронная микроскопия, буфер для фиксаторов и промывки, конечная концентрация 0,1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Электронная микроскопия, мечение эндоцитозированных синаптических везикул, субстрат для HRP, конечная концентрация 0,5 мг/мл в DDW и фильтруется, делает свежим перед использованием |
| раствор перекиси водорода | Sigma | H1009 | Электронная микроскопия, мечение эндоцитозированных синаптических везикул путем индукции реакции HRP-DAB, конечная концентрация 0,3% в DDW, сделать свежим перед использованием |
| глутаральдегид | Электронная микроскопия Sciences | 16365 | Электронная микроскопия, фиксаторы, конечная концентрация 4% в буфере Na-какодилата, сделать свежим перед использованием, хорошо встряхнуть перед использованием |
| TEM | JEOL | 200CX | Электронная микроскопия, визуализация эндоцитозированных везикул и ультраструктурных изменений |
| ПЗС-цифровая камера | AMT | XR-100 | Электронная микроскопия, захват изображений |
| цитрата свинца | Leica | микросистемы 16707235 | Электронная микроскопия, сетчатое окрашивание |
Ссылки
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calc....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
