Четырёхкратное иммуноокрашивание обонятельной луковицы для визуализации обонятельных сенсорных аксонов Молекулярные коды идентичности

Summary

Ольфакторные сенсорные нейроны выражают широкое разнообразие молекул, сортирующих аксоны, для установления правильной нейронной схемы. В этом протоколе описывается метод иммуногистохимического окрашивания для визуализации комбинаторных выражений молекул аксоновской сортировки на концах аксонов обонятельных сенсорных нейронов.

Abstract

Обонятельная система мыши часто используется для изучения механизмов формирования нейронных схем из-за ее простой анатомической структуры. Обонятельный сенсорный нейрон (OSN) представляет собой биполярную клетку с единственным дендритом и одним неразветвленным аксоном. OSN выражает только один ген обонятельного рецептора (OR), OSN, выражающие данный тип OR, сходятся к их аксонам к нескольким наборам инвариантных клубочков в Offactory Bulb (OB). Замечательной особенностью проекции OSN является то, что выраженные ORs играют поучительные роли в аксонной проекции. ORs регулируют экспрессию нескольких молекул, сортирующих аксонов, и генерируют комбинаторный молекулярный код молекул, сортирующих аксоны, на концах аксонов OSN. Таким образом, чтобы понять молекулярные механизмы OR-специфических механизмов наведения аксонов, очень важно охарактеризовать их профили экспрессии на терминах аксонов OSN в пределах того же клубочка. Целью этой статьи было введение методов сбора как можно большего количества клубочковE на одном участке ОВ и для проведения иммуноокрашивания с использованием нескольких антител. Это позволило бы сравнить и проанализировать образцы экспрессии молекул аксоновской сортировки без изменения окраски между разделами ОВ.

Introduction

Во время развития нейроны точно связаны друг с другом с образованием правильных нейронных цепей, что имеет решающее значение для нормальной функции мозга. Поскольку аберрантные нейронные цепи в мозге считаются причиной психических расстройств, таких как аутизм и шизофрения, понимание механизмов формирования нейронных каналов является одной из основных проблем в области нейронауки.

В обонятельной системе мыши каждый обонятельный сенсорный нейрон (OSN) в обонятельном эпителии (OE) выражает только один функциональный ген обонятельного рецептора (OR), а OSN, выражающие один и тот же OR, сходятся к их аксонам к определенной паре клубочков в стереотипных местах в Ольфакторная лампа (ОБ) ^{1 , 2} . Обонятельная система мыши является превосходной модельной системой для изучения молекулярных механизмов образования нейронных цепей, поскольку исследователи могут использовать выражение OR для определения специфического sUbtype OSNs и визуализировать проекционные сайты аксонов OSN как прозрачные клубочковые структуры. Замечательной особенностью проекции OSN является то, что ORs играют поучительные роли при проектировании аксонов OSN в OB ^{3 , 4 , 5 , 6} . Более конкретно, после того, как аксоны OSN направляются в приближенные целевые области, они отделяются для образования клубочка с помощью OR-зависимого способа. Предыдущие исследования показали, что молекулы OR контролируют экспрессию аксонобразующих молекул, которые регулируют селегацию клубочков ^{7 , 8} . Более того, накопление данных свидетельствует о том, что молекулы OR генерируют нейронный идентификационный код с помощью уникальной комбинации молекул, сортирующих аксоны ⁹ . Таким образом, чтобы понять механизм OR-зависимой клубочковой сегрегации, необходимо охарактеризовать профили экспрессии монокристалла аксоновEcules в OSN.

Флуоресцентное иммуноокрашивание является распространенным методом визуализации экспрессии конкретных генов. Поскольку белки молекул, сортирующих аксоны, преимущественно локализованы для аксонов OSN, исследователям необходимо использовать секции OB для характеристики их выражений в OSN. Корональное разделение ОВ обычно использовалось для иммуноокрашивания. Однако этот препарат теряет топографическую информацию вдоль передней-задней оси в той же ОВ-секции. Поэтому мы разработали парасагиттальный препарат медиальной стороны ОВ, который может монтировать как можно больше окружающих клубочков на одном и том же участке ОВ. В сочетании с иммуноокрашиванием с использованием нескольких антител этот препарат позволяет сравнивать и анализировать образцы экспрессии молекул аксонов-сортировщиков без изменения окраски между участками ОВ.

Кроме того, иммуногистохимический метод окрашивания был представлен без постфиксирования с PFA aЙ сахарозы. Этот метод позволяет исследователям получать достаточное количество высококачественных данных о окрашивании для многопараметрического анализа данных. Представленные здесь протоколы предоставят подробную информацию о мощных методах для исследователей, изучающих формирование обонятельной нервной цепи.

Protocol

Все экспериментальные процедуры проводились с одобрения комитета по этике животных эксперимента в Токийском университете и в соответствии с Токийским университетом руководящих принципов по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка решений

1. Приготовить 0,01 М фосфат-буферный солевой раствор (PBS): добавить таблетку PBS (0,14 М NaCl, 0,0027 М KCl, 0,010 М PO ₄ ^3- , pH 7,4) в 1 л дистиллированной воды и перемешать при комнатной температуре до полного растворения.
2. Подготовьте 4% параформальдегида (PFA) в PBS: добавьте 4 г PFA в 100 мл PBS. Перемешивают раствор при 60 ° С до полного растворения.
   1. После растворения PFA в PBS отрегулируйте pH раствора до 7,4 с помощью 1 N гидроксида натрия (NaOH). Затем охлаждают на льду и фильтруют раствор через фильтровальную бумагу для удаления любых твердых частиц. Хранить при температуре 4 ° C.
      Внимание: При использовании этих реагентов следует проявлять соответствующую осторожность. РучкаС осторожностью и использованием перчаток, защитных очков и лабораторного покрытия под химическим колпаком.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте свежий 4% раствор PFA, приготовленный в течение 2 дней.
3. Подготовьте 0,01 М PBS, дополненную 0,3% Triton X-100 (PBST): добавьте 3 мл Triton X-100 до 997 мл PBS. Перемешивают раствор при комнатной температуре до полного растворения.
4. Подготовьте 1% и 5% -ный блокирующий раствор: добавьте 10 г обезжиренного молока до 200 мл PBST для приготовления 5% -ного блокирующего раствора. Перемешать при комнатной температуре до полного растворения. Разбавьте 5% -ный блокирующий раствор пять раз PBST для приготовления 1% -ного блокирующего раствора.

2. Подготовка секций парасагиттального ОВ

1. Используйте животных в возрасте 1-2 недель. Эти возрастные группы подходят для следующих экспериментов, потому что гломерулы хорошо видны, а мозг можно разрезать черепом.
2. Анестезируйте животное с внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (50 мг / кг массы тела). Перфузируйте животное транскардиально ледяным 4% PFA в PBS. Обращайтесь с осторожностью и используйте перчатки, защитные очки и лабораторное покрытие под химическим колпаком.
3. После перфузии отрежьте голову ножницами и осторожно удалите кожу. Затем вставьте лезвие ножниц в пространство между верхним и нижним зубами и разрезайте по горизонтали, чтобы удалить нижнюю челюсть. Отрежьте лишнюю ткань с помощью щипцов и ножниц, чтобы оставить обонятельную ткань, включая ОВ и ОЕ.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Не удаляйте череп, окружающий OB, так как это удерживает срединные гломерулы, выровненные по вертикали прямо.
4. Погрузите обонятельную ткань в PBS для удаления воздуха в полости носа. Отрежьте заднюю часть головного мозга вертикально и поместите обонятельную ткань на дно встраивающей формы с режущей стороной вниз. Заполните пресс-форму с помощью метода Optimal Cutting Temperature (OCT), а затем погрузите форму в жидкий азот.
   1. После того как ткань в соединении полностью заморожена, инкубируйте ее в криосахTat при -20 ° C в течение 1 часа.
5. Сделайте серийные парасагиттальные секции (10 мкм) ОВ с помощью криостата и соберите их, приклеив к стеклянным слайдам, покрытым MAS. После прилипания немедленно высушите слайды с помощью сушилки для взрыва.

3. День 1: четырехкратное иммуноокрашивание OB-фрагментов

1. Промойте слайды в течение 5 минут с помощью PBS при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
2. Блокируйте неспецифические сайты связывания путем инкубации слайдов в течение 1 часа с 5% -ным блокирующим раствором при комнатной температуре.
3. Инкубируйте слайды O / N с коктейлем первичных антител (400 мкл каждого слайда) в 1% -ном блокирующем растворе при RT. Использовать следующие первичные антитела: антитело против кириллы 2 (1: 1000), антиоксидант козьего антисевафорина-7А (Sema7A) (1: 500), антитело против OL-протокадгерина крысы (OLPC) (1: 500) И мышиный антивезикулярный глютамат-транспортер2 (VGLUT2) антитело (1: 500).

4. День 2: четырехкратное иммуноокрашивание OBЛомтики

1. Отбросьте раствор первичного антитела и промойте слайды в течение 5 минут PBST при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
2. Инкубируйте слайды в течение 1 часа с коктейлем вторичных антител (400 мкл каждого слайда) в PBS при комнатной температуре. Используйте следующие вторичные антитела: осел-анти-мышь Alexa Fluor 405 (1: 400), осел-анти-козел Alexa Fluor 488 (1: 400), осла-антигинейская свинья Alexa Fluor 555 (1: 400) и осел- Крыса Alexa Fluor 647 (1: 400).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Все вторичные антитела должны исходить от одного и того же хозяина. Выберите другую длину волны флуоресценции вторичных антител для каждого первичного антитела, чтобы обеспечить отсутствие перекрытия длин волн.
3. Отбросьте раствор и промойте слайды в течение 5 минут с помощью PBS при комнатной температуре. Повторите 3 раза.
4. Установите покровные стекла на слайдах с помощью монтажной среды. Для этого нанесите 2 капли монтажной среды на каждый предмет слайда, а затем поместите покровное стекло, удалив пузырьки воздуха.

5. Интенсивность Measurements

1. Получите флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте следующие кубы фильтров: кубик фильтра DAPI (возбуждение 360/40 нм, излучение 460/50 нм и дихроичное зеркало 400 нм) для сигналов Alexa Fluor 405, фильтр-куб GFP (возбуждение 470/40 нм, излучение 525/50 нм, И 495 нм дихроичное зеркало) для Alexa Fluor 488, куба фильтра TRITC (возбуждение 545/25 нм, излучение 605/70 нм и дихроичное зеркало 565 нм) для Alexa Fluor 555 и куба фильтра Cy5 (возбуждение 620/60 нм, 700 / 75 нм и дихроичное зеркало 600 нм) для Alexa Fluor 647.
   Примечание. Отрегулируйте время экспозиции для получения флуоресцентных сигналов изображения без насыщения.
2. Определите клубочковое строение с помощью иммунофлюоресцентных сигналов VGLUT2. Измерьте интенсивности окрашивания аксонов-сортирующих молекул в клубочках с помощью ImageJ.

6. Анализ данных

1. Вычитают фоновые сигналы от интенсивности окрашивания молекул, сортирующих аксоны.
2. ПодготовьтеE, в которой имеются столбцы, состоящие из аксонобразующих молекул и рядов, составленных из клубочков.
3. Выполните анализ основных компонентов (PCA) с использованием подготовленного набора данных выражения. Затем получите оценки PCA, коэффициенты вклада и факторные нагрузки каждого основного компонента.

Results

Обонятельная гломерулярная карта формируется путем первоначального глобального нацеливания и последующей гломерулярной сегрегации аксонов OSN ^{1 , 2} . Гломерулярная сегрегация регулируется адгезионными / отталкивающими аксональными взаимодействиями, опосредованными молекулами, сортирующими аксоны, уровни экспрессии которых определяются выраженными молекулами OR ⁷ . Молекулярные молекулы аксонов, участвующие...

Discussion

Четырехкратное иммуноокрашивание парасегитальных ОВ-секций позволило визуализировать и количественно определять уровни экспрессии до четырех аксонобразующих молекул одновременно в большем числе клубочков. Анализируя эти многопараметрические данные с помощью СПС, можно предположить, что характеристики для экспрессии этих молекул можно предсказать.

Для успешного окрашивания критический валидность образца ткани. Некоторые протоколы предполагают, что ткани следует фиксировать с помощью 4% PFA и ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фосфатно-солевой буфер (PBS) таблетки, pH7.4	TAKARA BIO	T9181
Обезжиренное молоко	nacalai	tesque 31149-75
козье антитело к Sema7A	R& D Systems	AF2068
крыса антитело против OLPC	Merck Millipore	MABT20
мышь антитело против VGLUT2	Merck Millipore	MAB5504
козье антитело против BIG-2	R& Антитела D Systems	AF2205
gunea pig anti-Kirrel2	Operon Biotechnologies		Anti-Kirrel2 антитела были получены путем иммунизации морских свинок KLH-конъюгированными синтетическими пептидами (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP
donkey anti-mouse Alexa Fluor 405	Abcam	ab175658
donkey anti-goat Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
ослик против морской свинки Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21432
осел против крыс Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153
Параформальдегид (PFA)	Wako	162-16065
Стекла с покрытием MAS	MATSUNAMI	MAS-01
	Инструменты для тонкой науки	11253-27
Весенние ножницы Vannas	Инструменты для препарирования	15000-00
Ножницы для препарирования	Инструменты для тонкой науки	14090-09
флуоресцентный микроскоп	KEYENCE	BZ-X700
DAPI фильтрующий куб	KEYENCE	OP-87762
GFP фильтрующий куб	KEYENCE	OP-87763
TRITC фильтр	куб KEYENCE	OP-87764
Cy5 фильтр	куб KEYENCE	OP-87766
фильтровальная бумага	ADVANTEC	00011185
O.C.T компаунд	Sakura Finetek	M71484