Мы представляем собой протокол для быстрого характеристика биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия с термолабильных лигандов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) – это мощный метод для количественной оценки термодинамических параметров, регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия. Эта информация имеет решающее значение в разработке новых фармацевтических соединений. Однако многие фармацевтически соответствующих лигандов являются химически неустойчивыми при высоких температурах, используемых в ДСК анализов. Таким образом измерения привязки взаимодействия сложным, потому что концентраций лигандов и термически преобразованы продукции постоянно меняются в ячейке калориметра. Здесь мы представляем протокол, с помощью термолабильных лигандов и ДСК для быстрого получения термодинамические и кинетические информации о складывания, привязки и лигандом процессов преобразования. Мы применили метод к ДНК aptamer MN4, которая связывает термолабильных лигандом кокаина. С помощью новой глобальной установки анализа, который приходится термолабильных лигандом преобразования, полный набор складывания и привязки параметров получаются из пару DSC экспериментов. Кроме того мы показываем, что константа скорости термолабильных лигандом преобразования могут быть получены с только один дополнительный набор DSC. Представлены руководящие принципы выявления и анализа данных из нескольких более сложных сценариев, включая необратимой агрегации биомолекулы, медленно складывающиеся, медленно привязки, и быстрое истощение запасов термолабильных лиганда.
Введение
Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)-это мощный метод для quantitating биомолекулярных привязки и складной взаимодействия1,2,3. Сильные ДСК включают способность для уточнения привязки и складные механизмы и давать соответствующие термодинамических параметров2,3. Кроме того DSC может быть выполнена в растворе рядом физиологических условиях и не требует маркировки биомолекулы или лиганд, например, с флуорофоров, спин этикетки или ядерные изотопы4. Инструмент сканирует температ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Пробоподготовка
- Очищайте желаемого биомолекулы13.
Примечание: Этот протокол использует приобретенные кокаина связывания ДНК aptamer MN4 после обмена против 2 М NaCl, три раза после трех раундов деионизованной воды с помощью центробежного фильтра с мембраной отсечения молекулярный вес 3 кДа. - Синтезировать и очистить или приобрести желаемый термолабильных лигандом13.
Примечание: MN4 связывает термолабильных лигандом кокаина. MN4 также связывает хинин, который используется в качестве отрицательного контроля для thermolability лиганда при этих температурах экспериментально. - Подготовьте ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативных данных для термолабильных лигандом DSC показаны на рисунке 1. Положение и высоту термолабильных пик лиганд прыгните последовательно сдвигает вниз к что несвязанных биомолекулы как обедненный термолабильных лиганда с каждого сканирования (рис. 1a). Бесплатный денатурации профиль используется в качестве ссылки для конечной точки преобразования термолабильных лиганда (рис. 1b). Данные д.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модификации и устранение неполадок
Данные анализа глобальной установки, используемых в Рисунок 1 и 2 были описаны ранее4. Здесь мы приводим практические аспекты выполнения и анализа ДСК привязки эксперименты с термолабильных лигандами. Обратите внимание, что базовый DSC получены для термолабильных лигандом только вычитается из лигандом + биомолекулы набора данных, эффективно гасят тепла освобожд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Благодарности
R. W. H. V был поддержан МакГилл естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) программа обучения в Bionanomachines. А. к. м. и P. E. J. были поддержаны Сенти грантов 327028-09 (A. K. М) и 238562 (P. E. J.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хлорид натрия | Chem Impex | #00829 | |
| Натрия фосфат одноосновной дигидрат | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Натрия фосфат двухосновной | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Дейоинизированная вода для молекулярной биологии | Millipore | H20MB1001 | |
| 0,2 микрона стерильные шприцевые фильтры | VWR | CA28145-477 | |
| Центробежные фильтры 3 кДа | Многопоровые | UFC900324 | |
| Диализные трубки 0,5-1,0 кДа Spectrum | Laboratories | 131048 | |
| Силиконовые трубки | VWR | 89068-474 | |
| Пластиковые фланцевые колпачки DSC | TA Instruments | 6111 | |
| ДНК-аптамер MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Кокаин | Sigma Aldrich | C008 | |
| Хинин | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III микрокалориметр | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| программное обеспечение DSCRun | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Программное обеспечение NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Ссылки
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
