Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ячеечная модель культуры сопротивления артерий

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55992

⸱

8 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Описан ячеечная модель культуры сопротивления артерий, позволяя для рассечения сигнальные пути в эндотелия, гладких мышц, или между эндотелия и гладкой мускулатуры (myoendothelial-Джанкшн). Избирательное применение агонистов или белка изоляции, электронной микроскопии, иммунофлюоресценции могут быть использованы с помощью этой модели культуры клеток.

Аннотация

Myoendothelial соединения (меж), уникальный сигнализации microdomain в артериях сопротивления малого диаметра, экспонаты локализации специфических белков и сигнальных процессов, которые можно контролировать тонус сосудов и кровяного давления. Как это проекция либо из клеток эндотелия и гладкой мускулатуры и из-за его небольшой размер (в среднем, площадь ~ 1 мкм2), меж трудно изучать в изоляции. Однако мы разработали модель культуры клеток называется Сопредседатель культуры клеток сосудистой (VCCC), которая позволяет в vitro меж формирования, эндотелиальных клеток поляризации и рассечение сигнализации белков и процессов в стенке сосудистого сопротивления артерии. VCCC имеет множество приложений и могут быть адаптированы с учетом различных типов клеток. Модель состоит из двух типов клеток, выращиваемых на противоположных сторонах фильтра с 0,4 мкм поры, в которые в пробирке MEJs могут образовывать. Здесь мы опишем, как для создания VCCC через покрытие клеток и изоляции эндотелия, меж и гладких мышц фракции, которые затем могут быть использованы для изоляции белка или деятельность анализов. Фильтр с нетронутым клеток слои могут устанавливаться, встраиваемых и секционного для immunofluorescent анализа. Важно отметить, что многие из открытий от этой модели были подтверждены с помощью нетронутыми сопротивления артерий, подчеркивая ее физиологической значимости.

Введение

В артериях сопротивления малого диаметра тонкой внутренней упругой пластинки (IEL) отделяет эндотелия (ЕК) и гладкомышечные клетки (SMC). Клетки могут проекта через отверстия в этом эластичной матрице и устанавливают прямые соединения цитоплазматических через разрыв соединения каналы1,2. Эта уникальная структура называется перекрестка myoendothelial (меж). МЕЖ-это небольшой (примерно 0,5 мкм x 0,5 мкм, в зависимости от сосудистого русла), сотовой проекция состоит преимущественно из эндотелиальных клеток, но могут происходить из гладких мышц, а также3,4. Ряд исследователей продемонстрировали огромную сложность сигнальной сети, которые происходят выборочно на меж, делает его особенно важное место для содействия двунаправленной передачи сигналов между эндотелия и гладкой мускулатуры5 ,6,,78,9,10.

Однако механистических рассечение сигнальных путей на меж трудно в артерии, нетронутыми. Потому что меж проекцию сотовый, это не возможно в настоящее время изолировать в vivo меж от сосудистой стенки. По этой причине была разработана модель VCCC1 . Важно отметить, что VCCC реплицирует физиологических эндотелиальной морфология11 и поляризации сигнализации между апикальной и меж части клетки12. Именно эта уникальная модель, которая облегчает открытие, альфа-гемоглобина в эндотелиальных клеток, поляризованных меж. Это в отличие от условно культивировали эндотелиальных клеток, которые не выражают альфа-гемоглобин13. Для исследователей, заинтересованных в микрососудистой эндотелия она может быть более целесообразно использовать эндотелиальных клеток, которые были культивировали в VCCC, особенно если цель состоит в том, чтобы вскрыть сигнальных путей, которые происходят в артериях сопротивления малого диаметра.

Использование прочные пластиковые вставки, содержащий фильтр с малого диаметра поры (0,4 мкм в диаметре) для совместного культуры двух типов различных клеток предотвращает клетки мигрируют между слоями. Это приводит к 10 мкм расстояние между клетками, которые значительно больше, чем в естественных условиях, но по-прежнему реплицирует многие из характеристик в vivo MEJs, включая локализация протеина и второй messenger сигнализации1 , 14. Кроме того, VCCC позволяет для ориентации клетки сигнализации через добавлением агонистов или антагонист конкретных клеточных отделения для конкретного типа. Например загрузка ЕК с BAPTA-AM в хелатной кальция и стимулирования РРХВ фенилэфрин14. В отличие от других описаний Сопредседатель культура модели15,16,,1718,19,20,21это обеспечивает Инструкция по изоляции отдельных фракций для мРНК и белков, включая собственный меж фракция в поры фильтра. Добавление этой методики VCCC позволяет для расследования конкретных изменений в мРНК локализации или транскрипции22, фосфорилирование белков12,23и активность белка12. Этой статье будет описано нанесение EC верхней части фильтра и SMC на дне, хотя возможна культура типы двух клеток в разных конформации11,18,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. покрытие клетки для VCCC

  1. культуры большой 225 см 2 фляги EC и SMC в стерильных условиях при 37 ° C, до 70-90% притока. Убедитесь, что используются более ЕС чем SMC; При использовании первичного человека EC и SMC, обычно 3 больших колбы ЕС с 1 большой эликсир SMC.
    1. Использовать первичные элементы на более низких проходы и не используйте мимо прохода 10. Выберите носитель культуры, основанные на клетки быть совместно культивируемых. Для первичного человека коронарной артерии EC используйте EBM-2 EC базальной СМИ с факторами роста EGM2 МВ. Для первичного человека коронарного SMC используйте SmBM SMC базальную СМИ с факторами роста SmGM-2. До использования с культивируемых клеток, добавить факторы роста в СМИ.
  2. Строительство 1 день VCCC: спрей Петри большой (150 мм) и крышки с дезинфицирующим средством (например, Cavicide) и вытереть бумажным полотенцем или безворсовой салфетки. Затем спрей Петри с 70% этанола (EtOH) и поместите их в вытяжку воздуха сухой.
  3. Открытие плиты пластины фильтра (см. Таблицу материалов) в стерильных условиях и пальто SMC сторону (дно фильтра) вставки с фибронектин решения. Сохраняя Вставка в предоставленной пластина 6-Ну, накапайте раствор фибронектин через сторону щели в нижней части плиты, убедившись, что нижней половины фильтра охватывает (не более 1 мл).
  4. После 30 мин лечения фибронектин раствором при комнатной температуре в капюшоне культуры клеток, возьмите вставок из плиты, вакуумные любое избыточное решение и инвертировать, поместив в нижней половине чистого Петри. Отложите в сторону. Будьте уверены, чтобы не мешать вставки мембраны фильтра при аспирации излишки раствора; этого можно избежать, нежно наклона пластины и вакуумировать решение у края вставки.
  5. Trypsinize 225 см 2 настой SMC с 3 мл раствора подогретым 2 X трипсина-ЭДТА, и после того, как клетки сняты с плиты, добавить 9 мл SMC СМИ для нейтрализации трипсина (3:1, СМИ: трипсин). Трансфер в конической трубки, смесь хорошо и пипетки 10 мкл на Горяева для определения количества клеток.
    1. Подсчитать количество ячеек в 5 x 5 коробок (т.е., 18), умножьте это на 10 000, чтобы получить количество клеток в 1 мл (180 000 человек). Затем умножьте на 12 мл (общий объем суспензии клеток, 2,16 млн SMC). Убедитесь, что есть достаточно SMC пластины желаемое количество скважин.
      Примечание: например, 1 также должны иметь 75.000 SMC и таким образом 18 скважин бы 1,35 млн всего SMC. Деление клетки 1,35 млн, необходимых 180 000 клеток в 1 мл, и это приводит в 7,5 мл суспензии клеток, которые будут необходимы для покрытия. Затем вычислите окончательный объем необходимых (18 скважин x 750 мкл = 13,5 мл). Таким образом, принять 7,5 мл суспензии клеток, доводят объем до 13,5 мл с подогретым SMC СМИ и перемешать хорошо.
  6. Плиты 750 мкл суспензии клеток, содержащих около 75000 SMC на нижней стороне каждого фильтра, стараясь не разлива любой из средств массовой информации и мобильные решения. Установите крышку на верхней и тщательно передачи Петри с вставками в инкубаторе при 37 ° C ночь.
    Примечание: Плотность оптимального клеток для других типов клеток нужно будет определяться эпирически.
  7. На 2 день, заполнить чистой 6-ну блюда с 2 мл свежего, подогретым SMC и средств массовой информации. Выньте пластины из инкубатора. Возьмите вставок, по одному и удалите СМИ, всасывания, затем место в 6-ну блюдо с SMC СМИ.
  8. Пальто противоположной стороне фильтра (EC стороне) с 1 мл 0,5% раствора говядину желатин для по крайней мере 30 минут при 37 ° с.
  9. Trypsinize flask(s) 2 225 см ЕС с 3 мл подогретым 2 X трипсина-ЭДТА (10 x, разбавленных в стерильных Дульбекко ' s PBS) раствор с нежный стук Фляга для того, чтобы поднять клетки от пластину.
    Примечание: Это может быть необходимо поместить флакон обратно в инкубатор при 37 ° C для 1-3 мин.
    1. Раз клетки снять пластину, добавить 9 мл EC СМИ для нейтрализации трипсина (3:1). Трансфер в конической трубки, бассейн вместе, смесь хорошо и пипетки 10 мкл на Горяева для определения количества клеток.
      1. Подсчитать количество ячеек в 5 x 5 коробок (т.е., 60), умножьте это на 10 000, чтобы получить количество клеток в 1 мл (600 000). Затем умножьте на 12 мл (общий объем суспензии клеток, EC 7,2 млн). Убедитесь, что есть достаточно ЕС для пластины желаемое количество скважин.
        Примечание: Примерно 360 000 ЕС требуются в колодец. Например 18 скважин требуют ЕС 6,48 млн. Деление клетки 6,48 млн, необходимых 600.000 ЕС на 1 мл, и это приводит в 10,8 мл суспензии клеток, которые будут необходимы для покрытия. Затем вычислите окончательный объем необходимых (18 скважин x 1 = 18 мл). Таким образом, принимают 10,8 мл суспензии клеток, доводят объем до 18 мл с предварительно разогретую EC СМИ и нежно ресуспензируйте.
  10. Пластина 1 мл 360000 ЕС на верхней стороне каждого вставка фильтра. Пусть клетки инкубировать спокойно при 37 ° C в течение 24 ч. заменить средство на 4 день. Урожай на день 5.

2. Заготовка фракций от VCCC

  1. выполнения изоляции в комнате 4 ° C и сохранить все документы на МКО.
  2. Имейте в виду количество отдельных вставок изоляции и добавить буфера lysis 50 мл трубки помечены меж (для изолированных фильтров). Пометьте два блюда 10 мм; один для ЕС и один для SMC.
  3. Настройка рекомендуется объем буфера lysis в зависимости от как концентрированный lysate необходимо; 15 вставляет, 500 мкл буфера lysis для меж трубки и 250 мкл на Петри блюдо.
  4. Работы с одним 6-ну пластины вставок в то время. Всасывания от среднего в капот культуры клеток, а затем транспорта в холодную комнату на льду
    Примечание: Приведенные ниже инструкции являются 1 Вставьте изоляции.
  5. Пипетки 10 мкл ПБС на стороне SMC вставки.
  6. Используйте ячейку стеклоподъёмника Наскребать вниз клетки в один конец вставки и передача клетки от стеклоподъёмника SMC Петри блюдо, которое имеет литического буфера в него.
  7. После того, как клетки стеклоподъёмника коснулась литического буфера в блюдо, не позволяют ему коснуться вставка фильтра до тех пор, пока она была полностью уничтожена и сушеная на бумажные полотенца. Повторите соскоб SMC фильтр по крайней мере один-два раза полностью удалить оставшиеся ячейки мусор SMC.
  8. Превратить Вставка течение и пипетки 10 мкл ПБС в стороне верхней/EC вставка фильтра. Повторите шаги 2.6 и 2.7 с скребок клетки и EC Петри.
  9. Собирать оставшиеся ячейки и PBS шлама со стороны ЕС фильтра с пипеткой и передачи EC Петри с буфера lysis. Будьте очень внимательны в соскоб клеток с обеих сторон фильтра, чтобы оставить минимальное загрязнение EC/SMC в меж дроби.
  10. Осторожно использовать скальпель вырезать фильтр с пластиковым вкладышем. Сделать это путем резки 70-80% от пластиковых и использовать пинцет, чтобы вытащить фильтр полностью от пластиковые вставки структуры. Установите фильтр в 50 мл Конические трубки помечены меж буфера lysis и обеспечить его сидит литического буфера и остается влажной.
  11. , Повторите изоляции, в группах по 6, пока не будут обработаны все вставок.
  12. Убедитесь, что различные группы хранятся в отдельных труб и блюда.
  13. Vortex 50 мл меж Конические трубки на полную силу для 15 s или пока хорошо не смешано. Удалите фильтры из меж конические с щипцами, перетаскивая их вдоль боковых стен трубки, чтобы оставить максимальное количество белков и жидкости в трубе. После этой точки, сбросить фильтры.
    14. Делать
  14. после того, как все фильтры были удалены из меж Конические трубки, Быстрый спин (10-15 s на Макс скорость ~ 16000 x g) в центрифуге тянуть все жидкости и белки в нижней части трубки. Передача содержимого меж трубки и ЕС и SMC Петри блюд в отдельный, меньшие пробирок.
  15. Дополнительно: Sonicate содержимое трубки меж/SMC/EC параметр 4 для трех 10 s импульсов на льду или гомогенизации аккуратно от руки.
  16. Центрифуг на Макс скорость (~ 16 000 x g) 15 мин на 4 ° C. Накапайте из супернатант и пробирного lysate для содержания белка, с помощью метода пробирного bicinchoninic.

3. Заготовки VCCC En Face иммунофлюоресценции

  1. на день 5 из VCCC инкубации, снимите вставки из инкубатора. Работая в капот культуры клеток, всасывания у SMC СМИ от каждого из нижней скважины вставить фильтр и промойте два раза с ПБС. Повторите с ЕС стороной.
  2. Ведение вставки, неповрежденным и в пластине, добавьте параформальдегида 4% (PFA) для 10-20 мин в комнате душевой 4 ° C на нежный шейкер. Вымойте обе стороны вставка фильтра с ПБС 5 минут и повторить два раза.
    Предупреждение: PFA токсичных и должны быть тщательно обработаны.
  3. Выполнения блокировки, первичных и вторичных инкубаций антитела в пластине, обеспечивая, что обе стороны фильтра хранятся в антитела + преграждая разрешение (9 мл PBS, 25 мкл Тритон X100, 50 мг альбумина bovine сыворотки, 500 мкл нормальной сыворотки)
  4. Установить фильтр на слайде, вырезать фильтр из пластиковые вставки с помощью скальпеля монтируется на ручку и место на слайде микроскопа с монтажа среднего.

4. Заготовки VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. на день 5 из VCCC инкубации, снимите вставки из инкубатора. Всасывания у средств массовой информации с обеих сторон вставка фильтра в капюшоне культуры клеток и промойте каждой стороне фильтра два раза с ПБС.
  2. Ведение вставки нетронутыми и в пластине 6-хорошо, добавить 4% PFA и инкубировать на ночь в комнате душевой 4 ° C на нежный шейкер и.
    Предупреждение: PFA токсичных и должны быть тщательно обработаны.

5. Встраивание VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. после фильтра вставки были исправлены примерно за 24 ч в 4% PFA, передачи до 70% EtOH для по крайней мере 24 часа, но до нескольких недель.
  2. Процесс фильтры на long (с ночлегом) работать на процессоре автоматизированной ткани. Использовать программу следующим образом: 70% парафина EtOH для 30 мин, 85% EtOH 30 мин, 95% EtOH 30 мин, 100% EtOH 30 мин, 100% EtOH 45 мин, 100% EtOH 45 мин, ксилол 30 мин, ксилол 30 мин, ксилол 45 мин, 60 ° C 30 мин, 60 ° C парафин 30 мин , 60 ° C парафин 45 мин
  3. После обработки, передачи собранного фильтры для внедрения станции в жидкий парафин, сохраняя фильтр в кассету.
  4. Удалить фильтр из кассеты, тщательно с использованием щипцов провести его только на краю. С ножницами, вырезать фильтр в два раза образуя два полукруг формы половинок. Положите 2 половин на холодную тарелку части внедрения станции просто долго достаточно, чтобы заполнить встраивание формы с жидким парафином.
  5. Раз наполнен жидкий парафин, очень кратко touch внедрения плесень холодной пластины, а затем вставлять каждой половины фильтра на встраивание формы (сократить стороны), это гарантирует, что при резании, один будет резки от центра к краю фильтра .
  6. Во время внедрения, используйте щипцы провести фильтр для предотвращения половинки от попадания в друг друга, до тех пор, пока достаточно прохладно для них самостоятельные парафина. Переместите вложения плесень холодной пластины до тех пор, пока полностью затвердевшим.
    Примечание: Охлаждение блоков на лотках льда помогает предотвратить морщинистой секций.

6. Секционирование и окрашивание VCCC для поперечной иммунофлюоресценции

  1. для блоков парафина секционирование и слайд монтажа: вырезать 5 мкм секций, поместить эти разделы в ванну воды 42 ° C и забрать разделы, используя положительно заряженные слайды. Сохраните слайды на ночь в 42 ° C духовке сушиться.
  2. Перед началом регидратации шаги, выпекать слайды при температуре 60 ° C для плавления парафина и помочь присоединиться VCCC разделы к слайду. Прохладный кратко, то увлажняет слайды через два изменения ксилол, 100% EtOH, 95% EtOH, одно изменение 70% EtOH и два изменения в дистиллированной воде.
  3. Избежать методы извлечения антигена, включающие микроволновой печи или отопления как разделы могут упасть слайд.
  4. Выполнение стандартной блокировки за 1 ч при комнатной температуре, затем ночи инкубации с основного антитела на 4 ° C, следуют мытья шаги и вторичные антитела за 1 ч при комнатной температуре. Крепление с монтажа СМИ и coverslip.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Вставки фильтр, используемый для VCCC имеют небольшие, 0,4 мкм отверстия. Рисунок 1A, en лицо зрения врезные фильтра VCCC, показывает поры, в которых могут образовываться меж в пробирке. Схема изображает гладкомышечные клетки, покрытие на нижней стороне фильтра один день до эндотелиальные клетки покрыты с противоположной стороны (рис. 1B). После того, как клетки покрыты, EC, меж и SMC фракций могут быть изолиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

VCCC имеет ряд преимуществ с точки зрения изложив MEJs в пробирке, но есть точки обсуждения, при определении, если VCCC может использоваться для конкретного приложения. Например если различных типов клеток, которые будут использоваться с этой моделью, он будет нужно быть оптимизированы. Мы использовали первичной клетки человека, но это можно изолировать клетки из бычьего аорты24, или wildtype или нокаут мышей и использовать их в1,VCCC,5...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана национальной сердца, легких и крови Институт предоставляет лектор стипендий 14PRE20420024 R01088554, T32HL007284 и Американской ассоциации сердца. Мы особенно благодарим Санкт Джуд сотовой Imaging общих исследований ядро, включая Рэндалл Уэйкфилд и Линда Хорнер для изображений, электронной микроскопии, Адам Straub для помощи с изображениями представитель иммунофлюоресценции и Pooneh Багер для нее ценную информацию о протоколе рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
диаметр 24 мм, 0,4 и микро; m Transwell Полиэфирный мембранный фильтрующий вкладышCorning3450Это одна 6-луночная пластина вставок
225 см колбаCorning431082
6-луночные пластины (без фильтрующих вкладышей)Corning3506
Первичные эндотелиальные клетки коронарных артерий человекаLonzaCC-2585
Первичные гладкомышечные клетки коронарных артерий человекаLonzaCC-2583
EBM-2 EC Базальная средаLonzaCC-3156
EC факторы роста (EGM2 MV Single quots)LonzaCC-4147Добавить в базальную среду перед применением
SmBM SMC базальная средаLonzaCC-3181
SMC факторы роста (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Добавить в базальную среду перед применением
0,5% Trypsin-EDTA 10XGibco15400-054Разбавить в 2 раза стерильным dPBS
ГемоцитометромVWR15170-208
большие чашки Петри для SMC Plating (150 мм)Corning353025
бычьим желатиномSigmaG-9382
Человеческий фибронектинCorning3560085&микро; г/мл фибронектина и хранить при -20
10x Буферизованный раствор соли Хэнкса (HBSS)Gibco14065-056Разбавить до 1x стерильной водой
10x Фосфат Dulbecco Buffered Salt (dPBS)Gibco14200-075Разбавить до 1x стерильной водой
Одноразовый изогнутый скальпель (режущая кромка 30 мм) с ручкойAmazonMDS15210
щипцамиFisher17-467-201
Клеточный подъемникCorning3008
Скребокдля клеток BD Falcon353085
50 мл коническая трубкаCorning352070
10 мм чашки ПетриFalcon35-1008
Rneasy мини наборQiagen74104
Реактив для лизиса РНКQiagen79306
ПараформальдегидSigma158127Make 4% раствор с dPBS
70% этанолFisher04-355-305
Кавицидное дезинфицирующее средствоFisher131000
RIPA Буфер для лизиса белкаSigmaR0278
Sonic dismbranatorFisher Model 50
1x PBS для заготовки EC/SMC и иммуноцитохимияGibco10010023не обязательно должна быть стерильной
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Embedding/Sectioning/Staining
ParafinFisherP31-500
Автоматизированный тканевый процессорExcelsiorES
Встраиваемая станция + холодная пластинаLeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Микротомное лезвиеVWR25608-961 или 25608-964
Предметные стекла микроскопаThermo Fisher22-230-900
Покровные стеклаThermo Fisher12-548-5E
Продлить золотое монтажное средствоThermo FisherP36931
НазваниеCompanyНомер в каталоге>Комментарии
Другие растворы**Выполнять все действия в стерильных условиях при использовании раствора на живых клетках
Стерильную воду в. Используя стерильную воду, сделайте DPBS (450 мл стерильной воды: 50 мл 10X DPBS), перемешайте и отфильтруйте стерилизованную (0,2&микро; m фильтр).<бр/> Конечная концентрация: 1X
стерильная вода из автоклава HBSSдля стерилизации. Используя стерильную воду, сделайте HBSS (450 мл стерильной воды: 50 мл 10X HBSS), смешайте и отфильтруйте стерилизованную (0,2&микро; m фильтр).
Конечная концентрация: 1X
Исходный растворИспользуйте 50 мл стерильной воды для получения фибронектина, чтобы сделать запас 1 мл аликвот, затем заморозьте до необходимости
Конечная концентрация: 100&микро; г/мл
фибронектина для покрытия SMC-стороны VCCCразморозьте одну аликвоту и добавьте 1 мл фибронектина (100&микро; г/мл) до 19 мл 1X HBSS для достижения конечной концентрации 5&микро; г/мл.<бр/> Конечная концентрация: 5&мкм; г/мл
2x Раствортрипсина ЭДТА Разбавьте 10X 0,5% Трипсин-ЭДТА до 2X с 1X dPBS (40 мл DPBS: 10 мл 10X трипсин) .
Конечная концентрация: 2X
Блокирующий/антителенный раствор(9 мл 1X PBS, 25 мл Triton X100, 50 мг бычьего сывороточного альбумина, 500 мл нормальной сыворотки)
Бычий желатин для покрытия EC VCCCСмешайте 0,5 г бычьего желатина со 100 мл дистиллированной воды. Автоклав перед первым использованием и хранить при комнатной температуре. Хранить в стерильных условиях.
Конечная концентрация: 0,50%
1x PBS для забора клетокне обязательно должна быть стерильной
автоклаве стерилизовать дПБС фибронектина

Ссылки

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123(2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

миоэндотелиальный соединительный комплекскокультивирование сосудистых клетокэндотелиальные клеткигладкомышечные клеткифракционирование клетокиммунофлуоресцентный анализзаливка парафиномвестерн-блоттингвыделение белков
Ячеечная модель культуры сопротивления артерий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.