Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Полуавтоматические анализ морфологии скелетных мышц мыши и волоконно тип состава

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56024

⸱

31 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology Division, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Иммуногистохимическое окрашивание изоформ тяжелой цепи миозина стала-искусство дискриминатора скелетных мышечных волокон-типа (т.е., I типа, типа IIA, введите IIX, типа IIB). Здесь мы представляем окрашивание протокола наряду с Роман полуавтоматические алгоритм, который способствует быстрой оценки морфологии тип волокна и волокна.

Аннотация

Лет различия между типами скелетных мышечных волокон были лучше визуализированы пятнать миозин АТФазы. Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно-типа. Тип I, IIA, введите IIX и тип IIB волокна теперь могут быть определены с точностью на основе их MyHC профиля; Однако, ручной анализ этих данных может быть медленным и вниз вправо утомительно. В этой связи Быстрая, точная оценка волоконно тип композиции и морфология является весьма желательным инструментом. Здесь мы представляем протокол-искусство иммуногистохимическое окрашивание MyHCs в Замороженные разделы, полученные от мыши задних конечностей мышцы в концерте с Роман полуавтоматические алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна. Как и ожидалось, камбаловидной мышце отображается пятная для типа I и типа IIA волокна, но не для типа IIX или типа IIB волокон. С другой стороны мышцы передней tibialis состояла преимущественно из типа IIX и тип IIB волокон, небольшая часть волокон типа IIA и мало или вообще не типа волокна. Несколько преобразований изображения были использованы для составления карт вероятностей для измерения различных аспектов волокна морфологии (т.е., площадь поперечного сечения (CSA), максимальный и минимальный диаметр Ферэ). Значения, полученные для эти параметры были затем по сравнению с вручную полученных значений. Были замечены никаких существенных различий между либо режим анализа отношении CSA, максимальное или минимальное Ферэ диаметр (все p > 0,05), указывающее точность нашего метода. Таким образом протокол анализа наши иммуноокрашивания могут применяться к исследованию воздействия на мышцы состава во многих моделях старения и миопатии.

Введение

Он был известен на некоторое время, что скелетных мышц состоит из одного волокна многих типов1. Первоначально, две группы волокон были охарактеризованы на основе их сократительных свойств и с именем, соответствующим образом, медленно дергаться (тип I) и быстро дергаться (тип II). Далее, эти категории были отделены на основе волокна метаболизма. С тех пор типа волокна богаты в митохондриях и зависят от окислительного метаболизма, они были раскрыты устойчиво положительных Никотинамидадениндинуклеотид tetrazolium редуктаза (NADH-TR) диафоразы2 или сукцината дегидрогеназа (SDH)3 пятнать. Наоборот, тип II волокна выставлены меньшей и переменных степеней NADH-TR диафоразы или SDH окрашивание и были разделены на две подгруппы быстро дергаться (тип IIA и IIB типа) несколько грубо на основе их относительных окислительного потенциала. Эти различия между волокнами была визуализирована более эффективно путем пятнать миозин АТФазы где типа волокна пятно темно после предварительной инкубации при pH 4.0 и тип IIB волокна поглощают осадок следующим предварительной инкубации при рН 10,0 волокнами типа IIA пятнать промежуточно4.

Совсем недавно иммуногистохимическое окрашивание изоформ миозин тяжелой цепи (MyHC) стала тоньше дискриминатора волоконно тип5. Тип I, тип IIA и IIB типа волокна могут быть все определены с точностью на основе их MyHC профиля. Кроме того другой тип быстро дергаться метаболически промежуточные волокна, тип IIX, были определены6. Гибридные волокон, выражая более чем одного MyHC были также подтверждено5,,78. Некоторые виды, такие как кошка и павиан известны не Экспресс тип IIB MyHCs6. Несмотря на то, что MyHC иммуноокрашивания в настоящее время состояние искусства оценки состава мышц, анализ данных, полученных через этот метод является громоздким и длительным без автоматизированной помощи. С этой целью горсть полу автоматизированных методов для анализа этих данных были развитые5,9,10. Здесь мы представляем относительно стандартный протокол для идентификации иммуногистохимических мышечных волокон типа5,,78,10, вместе с полуавтоматическим Роман алгоритм, который ускоряет анализ морфологии тип волокна и волокна с точностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все процедуры, связанные с мышей были утверждены университета Колорадо-Anschutz медицинской кампуса помощи для институционального животных и использования Комитетом (91813(05)1D).

1. день 1: начального (1°) иммуноокрашивания с бычьим сывороточным альбумином (БСА) блокирование

  1. воздушно-сухой Замороженные разделы мыши задних конечностей мышцы (например, tibialis anterior, камбаловидной) смонтированы на заряженных слайды для ~ 30 мин 11. нарисовать границу вокруг разделов с помощью пера Пап гидрофобный барьер.
  2. Место ~ 250 мкл 5% BSA/фосфатный буфер (BSA/PBS) на каждый слайд, чтобы блокировать неспецифической антитела связывая. Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 1 ч.
  3. Блокирует, готовят 1:50 разведениях 1° антитела супернатант в 5% BSA/PBS (все являются мышиных моноклональных антител; см. таблицу 1 6 , 12) подготовить 250 мкл решение каждого слайда. Держите 1° антитела запасов и разведения на ice.

figure-protocol-1
Таблица 1: первичного антитела, которые используются для отличить MyHCs.

  1. после аспирации блокировки раствор 5% BSA/PBS, добавить 250 мкл антител разбавления 1° в соответствующие слайды. Добавить 250 мкл 5% BSA/PBS для средних (2°) антител только отрицательный контроль слайды.
  2. Инкубировать на 4 ° C в течение 24-48 ч в влажной среде.
    Примечание: Петри в алюминиевой фольги с смоченной фильтровальная бумага может служить подходящим инкубации камеры.

2. День 2:2 ° иммуноокрашивания с флуоресцентных антител

  1. аспирационная раствор антител 1°, или 5% BSA/PBS решение управления. Вымойте все слайды в три раза, 10 мин с 5% BSA.
  2. Время стирки, готовят разведения 1: 200 очищенный, конъюгированных Флюорофор 2 ° антител в 5% BSA/PBS (см. таблицы 2, все козы анти мыши). Подготовка 250 мкл раствора на слайд. Держать 2° Флюорофор конъюгированных антител в темноте на льду

figure-protocol-2
Таблица 2: Флюорофор конъюгированных вторичные антитела используются для визуализации первичного антитела признание от MyHCs.

  1. после аспирации третьего приложения 5% BSA/PBS блокирования решения, добавьте 250 мкл 2° разбавления антитела ко всем слайдам. Инкубируйте 90 мин при комнатной температуре в темной и влажной среде.
  2. Раствор антител аспирата 2°. Вымойте все слайды в три раза, 10 мин с 5% BSA/PBS.
  3. Полоскание с PBS. Сухой для 10 мин
  4. Горы coverglass с средой непостоянных, низкой вязкость водной монтажа.
  5. Когда сух, уплотнение края слайд с ногтей. Высушить и хранить в темной slidebox.

3. Обработка изображений слайдов с помощью эпифлуоресцентного

  1. очистить слайды с небольшой, 70% этанола, пропитанной лаборатории оботрите.
  2. Цифровых изображений получить immunostained мышцы разделов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с Фотографический аппарат (см. Таблицу материалов).
    1. Выберите область примерно 1 мм 2 (10 X цель, 1.4 NA).
    2. Просмотр Alexa 488-конъюгированных 2° флуоресцентным антитела через 505 нм Лонг-фильтр. Просмотр флуоресценции, порожденных возбуждения Alexa 594-конъюгированных 2° антител через фильтр Лонг перевал 595 Нм. Оцифровки изображения с PC компьютер, оснащенный совместимый изображений программное обеспечение. Включают в себя линейку из обработки изображений программное обеспечение для последующего анализа.

4. Анализ изображений с Фиджи

Примечание: прежде чем продолжить с анализом, Фиджи (доступна свободно от национальных институтов здравоохранения, Бетесда, MD) должен быть установлен через https://imagej.net/Fiji/Downloads. Кроме того макрос, используемый в этом процессе предоставляется в Дополнительный файл. Поместите файл макроса в легко доступной директории.

  1. Нагрузки brightfield изображение выбранного раздела в Фиджи. Перейдите к плагины → сегментации → сегментации обучаемая Weka.
  2. Целях предусматривается области сотовой секции, рисовать линии на волокна и нажмите кнопку " добавить в класс 1 ". Затем, нарисуйте линию на пространство между волокнами и нажмите кнопку " добавить к классу 2 " в ознаменование внеклеточных доменов. Повторяйте до тех пор, пока есть 5-10 метки в каждом классе.
    1. Нажмите поезд классификатора. В результате наложения красный и зеленый, добавить больше меток вручную (см. шаг 4.2) неправильно сегментирована части изображения, если необходимо. Повторяйте до тех пор, пока волокон (красный) надлежащим образом отделены от пространство между волокнами (зелёный).
  3. Нажмите " получить вероятность " и сохранить изображение в недавно помеченной папке.
  4. Повторите описанную выше процедуру (шаги 4.2-4.3) с флуоресцентные изображение взято из того же поля. Метка immunostained волокна как " 1 класса " и все не люминесцентные регионы как " класса 2 ". Сохранить полученный вероятность карту в ту же папку, где хранится образ обработанные brightfield.
  5. Открыть один из ранее сохраненные вероятности карт в Фиджи. Рисование прямой линии на панели шкалы, предоставляемый изображений программное обеспечение. Перейти к анализу → задать масштаб. Изменить параметры (то есть, известный расстояние, единица длины) в их соответствующие значения как предоставленные линейки шкалы, а затем проверить " глобального " поле на шкале для каждого изображения.
  6. Перейдите к плагины → макросы → запустить → Тьяги et al. волокна количественной оценки macro.ijm (см. Дополнительный файл). Сразу же появится на панели навигации. Откройте изображение ' s принимающей папки; появится диалоговое окно. Для каждого диалогового окна, измените " фон " значение dropdown " света. "
    Примечание: папка теперь будет заполняться с изображениями волокна контуры и файлы программного обеспечения таблицы результатов (диаметр CSA и Ферэ самое непосредственное отношение к количественное определение морфологии волокна; измеряемых параметров может быть скорректирована в анализировать набор измерений). Волокно морфология данных, генерируемых поры анализ функции Фиджи будут автоматически переведены в таблицу файлы программного обеспечения для обоих флуоресцентные и светлые области изображения.
  7. Вычислить долю волокна, выражая данной MyHC в поле, разделив количество флуоресцентные волокна в поле количество всего волокон в соответствующие светлые области изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Задних конечностей мышцы (то есть, tibialis anterior, камбаловидной), расчлененный от мужчины C57BL/6 мыши неизвестного возраста были флэш-замороженные путем тонуть пластиковые формы, содержащие мышцы в OCT смеси в жидкий азот охлажденный изопентана. Затем с помощью cryotome, 8-10 мкм серийный разделы были вырезать при-20 ° C и переданы различные стекла положительно заряженных слайды12.

Мы выбрал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы предоставили полезные направления для идентификации типов скелетных мышечных волокон. Поступая таким образом, мы опишем новый алгоритм для анализа данных.

Так как наши результаты во многом подтверждают те из предыдущих докладах5,8,10 и отражают наши собственные ручных измерений, алгоритм, как представляется, быть точным. Тем не менее мы столкнулись некоторые редкие экспериментальной ловушки, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы имеют не конфликтующие интересы раскрыть.

Благодарности

Мы благодарны Фонду Бйотхер и Ассоциация боковой амиотрофический склероз (#17-II-344) за их поддержку этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычья сыворотка альбуминSigma AldrichA9418-100G5% в PBS
Гидрофобный барьер Пап-ручкаНаучное устройство Лаборатория9804-02
Предметные стекла для микроскопаGlobe Scientific1358W Покровное
стеклоFisher Scientific12-544-E
ImmumountThermo Scientific9990402
Лак для ногтейL'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Инвертированный флуоресцентный и светлопольный микроскопСнято с производства
SPOT RT/KESPOT Imaging SolutionsRT940
Dell Optiplex
BA-F8 Первичные исследования антителГибридома Банк в Университете АйовыМоноклональная мышь IgG2b; 1:50
SC-71 Первичные исследования развития антителБанк гибридома в Университете Айовымонклональная мышь IgG1; 1:50
BF-F3 Первичные исследования развития антителГибридома банка в Университете Айовымоноклональная мышь IgGM; 1:50
6H1 Исследования развития первичных антителБанк гибридома в Университете Айовымоноклональная мышь IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 анти-IgG2bInvitrogenA21145козий анти-мышь; 1:200
Alexa Fluor 488 анти-IgG1InvitrogenA21121козий анти-мышь; 1:200
Alexa Fluor 594 анти-IgGMInvitrogenA21044козий анти-мышь; 1:200
OCTSakura Finetek4583
изопентанFisher ScientificO3551-4охладить с жидким азотом
PBSFisher BioreagentsBP665-110x, разбавить до 1x
салфеткиKimberly-Clark06-666A

Ссылки

  1. Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
  3. Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
  4. Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
  5. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  6. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
  7. Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
  8. Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
  9. Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
  10. Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).
  11. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
  12. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
  13. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  14. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  15. Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Тип волокна скелетной мышцытяжелая цепь миозинаиммуногистохимическое окрашиваниеморфология волоконплощадь поперечного сечениядиаметр Феретамышцы задних конечностей мышикарты вероятностипрограммное обеспечение Fiji
Полуавтоматические анализ морфологии скелетных мышц мыши и волоконно тип состава
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.