Кинематическая походка анализа в сагиттальной плоскости дает весьма точную информацию о том, как выполняется движение. Мы описываем применение этих методов для выявления дефицита походки для мышей подвергали аутоиммунных опосредованной демиелинизации. Эти методы могут также использоваться для характеристики дефицита походки для других моделей мыши, с нарушениями опорно.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сагиттальная плоскость кинематической походка анализа мышей C57BL/6, подвергается MOG35-55 индуцированной Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кинематическая походка анализа в сагиттальной плоскости часто используется для характеристики мотора дефицит рассеянным склерозом (MS). Мы описываем применение этих методов для выявления дефицита походки в мышиной модели МС, известный как Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). Паралич и моторного дефицита в мышей подвергали ЕАЕ обычно оцениваются с использованием клинических скоринга масштаба. Однако эта шкала дает только порядковый номер данные, которые содержит мало информации о конкретном характере моторного дефицита. ЕАЕ тяжести заболевания также были оценены rotarod производительность, которая обеспечивает измерение общей двигательной координации. Напротив Кинематическая походка анализа задние конечности в сагиттальной плоскости генерирует очень точную информацию о как движение нарушается. Для выполнения этой процедуры, отражающие маркеры помещаются на задние конечности, чтобы обнаружить совместное движение, в то время как мыши ходьба на беговой дорожке. Программное обеспечение для анализа движения используется для измерения движения маркеров во время ходьбы. Параметры кинематической походка затем являются производными от полученные данные. Мы покажем, как эти параметры походка может использоваться для количественного определения нарушениями движений тазобедренного, коленного и голеностопного суставов в ЕАЕ. Эти методы могут использоваться для лучше понять механизмы заболевания и выявления потенциальных методов лечения для MS и других нейродегенеративных расстройств, которые наносят ущерб мобильности.
Введение
Походка представляет собой серию повторяющихся движений конечностей, используемые для достижения локомоции. Походка состоит из шаг циклов, которые делятся на две фазы: фазу позицию, которая является когда нога движется назад на земле в движение тела вперед; и фазой, где ноги от земли и двигаться вперед. Нарушения походки являются отличительной черты многих нейродегенеративных расстройств, таких как травма спинного мозга (SCI), рассеянный склероз (РС), боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Паркинсона (PD) и инсульт; Доклинические грызунов модели этих расстройств часто резюмировать их соответствующих походка нарушениями1. Основные контрольные механизмы передвижения в мышах были интенсивно изучали2,3. Кроме того существуют модели мыши многих человеческих неврологических расстройств4. Анализ походки в мышах поэтому является привлекательным подход для оценки нескольких аспектов моторного дефицита, которые известны анатомической коррелирует. Изучение походки в моделях мыши может обеспечить понимание основы патологического двигательного дефицита в нейродегенеративных расстройств и идентификации потенциальных методов лечения.
Некоторые методы, используемые для измерения походка грызунов включать визуального осмотра (например, Бассо мыши шкала5 и открытом поле тест6) и анализ походки из брюшной плоскости7. Совсем недавно методы измерения Сагиттальная плоскость кинематика движения задних конечностей завоевали популярность, потому что они предоставляют дополнительные сведения о выполнении движения и следовательно более чувствительны к тонкие изменения в походке8, 9 , 10 , 11. Кинематическая методы, разработанные для изучения движения задних конечностей в сагиттальной плоскости во время ходьбы на беговой дорожке9,12 были широко изучены в контексте SCI, ALS, травматические повреждения коры головного мозга, инсульт, и Болезнь Хантингтона8,9,10,11,13,14,,1516. Напротив эти методы уже видели ограниченное использование для моделей мыши рассеянный склероз17в изучении опорно-двигательного дефицита.
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) является наиболее часто используемым мыши модель MS18. Два основных метода индукции ЕАЕ является активной или пассивной иммунизации. В активных ЕАЕ мышей иммунизацию с антигенами миелина, вызывая аутореактивная T клеточный neuroinflammation и демиелинизации в спинной мозг и мозжечок. С другой стороны, пассивный ЕАЕ, индуцируется передачи аутореактивная T клетки мыши с активной ЕАЕ наивно мыши19. Как описано в других разделах, течения заболевания и невропатологии находятся под влиянием центральной нервной системы (ЦНС) антигена и мыши штамм20,21,,2223,24 ,25. В экспериментах ЕАЕ управления мышей вводят с полным Фройнд в адъювантной (CFA) без антигена миелина. ЕАЕ характеризуется восходящий паралич, который начинается с хвоста слабость и потенциально может включать передние конечности, что приводит к атаксии и паралич20. Мы недавно охарактеризовал походка изменения у мышей C57Bl/6, подвергается миелин Олигодендроциты гликопротеина 35-55 (35-55MOG)-индуцированной ЕАЕ. Эти исследования показали анализа походки, быть выше, чем классическая поведенческого анализа, потому что отклонения от нормальных лодыжки движения тесно связано с степень потери белого вещества в поясничного отдела спинного мозга мышей ЕАЕ26. Напротив численность корреляции между потерей белого вещества и два других традиционных поведенческих мер (клинические скоринга и rotarod) был гораздо слабее26.
Мы здесь описывают использование кинематической походка анализа для выявления дефицита движения в сагиттальной плоскости ЕАЕ мышей, ходьба на беговой дорожке. Пяти Светоотражающий маркеров были размещены на задних конечностей для определения движения тазобедренного, коленного и голеностопного суставов в высокоскоростной видео записи. Программное обеспечение для анализа движения был использован для извлечения кинематической данные о совместных экскурсий. Полезность этих методов количественного определения дефицита движения для модели35-55 MOG ЕАЕ обсуждаются. Эти методы также применяются к изучению дефицита походки в других моделях мыши нейродегенеративных расстройств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
этот протокол в соответствии с канадского Совета по руководящим принципам, животное уход и был одобрен Комитетом Университета Далхаузи на лабораторных животных.
1. построить Светоотражающий маркеры:
- с помощью ручной дырокол, удар желаемое количество малых кругов из листа бумаги Светоотражающий. Каждое животное требует 5 маркеров для одной записи; два больших и три небольших маркеров.
- С помощью тонкой ножницы, сделать разрубом простирается от периметра к центру круга.
- Удалите защитное бумажное покрытие маркера раскрыть клейкую поверхность. С помощью тонкой щипцы, ручка маркер твердо и накрутите ее в на себя используя ваш палец, чтобы сформировать форму конуса. Чтобы сделать небольшой маркер, плотно скручиваемость конуса. Чтобы сделать большой маркер, скручиваемость конуса слабо.
- С помощью ручных клеевой пистолет, заполните внутри конусообразной маркер с клеем во время захвата кончик конуса с щипцами и придерживаться маркер плоский кусок картона. Клей будет препятствовать маркер из рушится и изгиб во время записи для обеспечения оптимального отражения света. Когда это клей сухой (примерно 10 минут), удалить маркер из картона с помощью скальпеля ( рис. 1A).
2. Готовить животных для записи
- Anesthetize мыши с изофлюрановая газа (2,5%; 2 литров/мин O 2), поместив мышь в камеру всасывание. Когда мышь находится в бессознательном состоянии, поместите его в носовой конус, расположены на вершине рециркуляции водогрейных одеяло. Анестезии предназначен для иммобилизации мышь для размещения маркеров; процедура не является болезненным. Поэтому, глубина анестезии не нужно оценивать.
- Смазать актуальные глаза обоих глаз.
- Бритья желаемого задних конечностей, используя Электрические ножницы. Начинаются на лодыжке и продлить позвоночника и нижней части ребер; обеспечить не мех остается как это будет препятствовать адгезии маркер.
Примечание: Здесь, право задних конечностей был записан; Однако, может использоваться либо задних конечностей. - С использованием перманентный маркер, указать местоположение подвздошный гребень и тазобедренного сустава. Подвздошный гребень чуть ниже нижней части ребер и легко ощутима, объединяя колени под курсором мыши ' тело ф.
Примечание: Тазобедренного сустава можно найти путем сгибания и ноги, чтобы найти точки сочленения между таза и бедренной кости. - Использование тонкой щипцы, возьмите заостренным концом маркера небольшой и окунуть базы в быстродействующий клей клей, или альтернативный эквивалент. Поместив маркер на кончике четвертая цифра и провести на месте для 2-3 s чтобы клей для просушки. Место два другие небольшие маркеры на плюснефаланговый совместных и лодыжки в том же порядке ( рис. 1B).
- Место большие маркеры на подвздошный гребень и тазобедренного сустава ( рис. 1B) так же, как небольшой маркеров.
- Удалить мыши из носовой конус и немедленно передать номер записи, с помощью передачи клетке. Поместите курсор мыши на стационарных беговой дорожке и позволяет для полного восстановления от анестезии.
3. Походка записи
- предварительного записи мыши ' s походки, возьмите картину калибровки блока с известными размерами на беговой дорожке.
Примечание: Это позволит Пиксели в видео, чтобы быть преобразованы в реальные измерения. Камеры должны располагаться примерно 120 см от беговой дорожки.- Позиции камеры на одинаковой высоте и беговая дорожка. Сохранить же положение камеры для записи после калибровки изображения.
- После того, как мышь полностью оправился от наркоза, поверните беговая дорожка на низкой скорости (5 см/с) чтобы начать мыши. Убедитесь, что направление ремня беговой дорожке таковы, что маркеры на мыши сталкиваются сторону камеры.
- Увеличение беговой дорожки скорость постепенно до 20 см/с, это идеальная скорость для последовательного походка у большинства здоровых мышей.
Примечание: Хотя это идеально иметь всех мышей, ходьба с одинаковой скоростью, некоторые могут быть не в состоянии последовательно достичь такой скорости.- , Если мышь не может ходить на 20 см/с, снизить скорость при необходимости и не забудьте сделать это к сведению. Уменьшить скорость беговой дорожке до достижения последовательного шаг циклов.
Примечание: Дальнейшего анализа данных можно настроить для различия в скоростях.
- , Если мышь не может ходить на 20 см/с, снизить скорость при необходимости и не забудьте сделать это к сведению. Уменьшить скорость беговой дорожке до достижения последовательного шаг циклов.
- Начать запись видео, как только мышь ходьбе постоянно (т.е., ходьба темпами последовательно, не воспитание или ткачества стороны в сторону). Продолжить запись до 8-12 последовательных шага циклы были записаны. Для каждого видео, запись скорость беговой дорожки и стороне мыши Записанная.
- После того, как запись будет завершена, выключите беговой дорожки и возвращение мыши в своей клетке. Очистите беговой дорожки тщательно между записями как запахи оставленные другими мышей может изменить поведение входящих мышей. Чтобы уменьшить стресс и повреждения кожи, не удалить маркеры; разрешить мышей, чтобы удалить их самостоятельно.
4. Анализ
- обрабатывать видео с помощью программного обеспечения для анализа движения.
Примечание: В наших экспериментах, мы использовали пользовательские скрипты, предназначенные для обработки изображений и статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалы) которые были написаны д-р Николас Stifani. Следующие шаги выполняются с использованием программного обеспечения для анализа выбранного движения.- Извлекать пиксельные координаты маркеров из видео и с использованием калибровки видео, преобразование значения пикселов сантиметров и рассчитать совместный углы в каждом кадре.
- Определить начало и конец каждого шага цикла, тем самым получение информации о Длительность шага и длины.
- Нормализовать шаг цикла продолжительностью 200 нормализованных кадров, таким образом, чтобы качели и позиции представлены 100 кадров, соответственно.
- С помощью нормализованных фреймов, Расчет кинематических параметров для анализа данных с использованием программного обеспечения таблицы (см. Таблицу материалы).
- Установить средний угол конкретных совместных, взять среднее из всех углов в рамке нормализованных как:
Примечание: здесь x представляет значение угла в дано нормализованных рама и n представляет номер нормализованных кадра. - Установить диапазон движения конкретного сустава для данной мыши, вычесть наименьший угол от крупнейших угол в набор нормализованных кадров следующим:
Диапазон движения = угол максимум - угол Минимальный.
Примечание: Здесь угол максимум и угол минимум являются наибольшей и наименьшей углы, достигнутые в рамках цикла нормализованных шаг, соответственно. - Установить RMS разница, сначала вычесть средний угол каждой экспериментальной время точки из базовой записи. Далее площадь каждого различия, взять среднее всех квадратов значений и квадратного корня среднее. Уравнение является следующим:
Примечание: здесь
представляет средний угол от базовой записи; y представляет средний угол от каждой экспериментальной момент времени; n и представляет количество нормализованных кадров. Корень означает квадрат разности (RMS) измерения, используемые для оценки отклонения в походкой от базовых записей.
- Установить средний угол конкретных совместных, взять среднее из всех углов в рамке нормализованных как:
- Использование научных графиков и статистики программное обеспечение для анализа и представления данных (см. Таблицу материалы).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 -это схематическое представление процедуры, используемой для анализа кинематики походки. Во-первых, отражающей маркеры изготовлены и помещены на мыши на 5 Анатомические точки. Походка затем записывается в то время как мыши ходьба на беговой дорожке. Программное обеспечение для анализа движения используется для извлечения кинематической данных для последующего анализа.
Рисунок 2A -C представляют шаг цикла упр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В мышей с ЕАЕ два наиболее распространенных методов измерения моторного дефицита клинических скоринга и падения задержки с27,rotarod28. Эти методы имеют ряд ограничений. Хотя удобно и широко используется, клинических скоринга ограничивается уступая только порядковый номер уровня данных, означает, что величина различий между клинической оценки не известны. Клинические забил также страдает от не в состоянии представить точную информацию о характере моторного дефици...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы хотели бы признать Sid Chedrawe за его техническую помощь с съемки. Эта работа была поддержана финансирование от MS общества Канады (EGID 2983).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фотоаппарат | Nikon | D750 | Используется для съемок видео |
| Светоотражающая лента | B& L Engineering | MKR-Tape-2 | |
| Тонкие ножницы | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Щипцы | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Клеевой пистолет | Craftsmart | E231647 | |
| ручка скальпеля #4 | Roboz | R5-9884 | |
| Лезвие скальпеля No10 | Feather | 2020-12 | |
| C57BL/6 мышей | Charles River Laboratories | ||
| Анестезиологический аппарат | EZ Анестезия | EZ-AF9000 Auto Flow System | |
| Рециркуляционное одеяло для нагрева воды | Androit | HTP-1500 | |
| местная смазка для глаз | Refresh | DIN00210889 | |
| Shaver Oster | 78997-010 | ||
| Высокоскоростная камера | Fastec | Fastec IL3-100 | |
| Мощный фонарь | Smith Victor Corporation | Model 700 SG (кварцевый фонарь 600 Вт, 120 Вольт) | |
| Световая стойка | Promaster | LS1 | |
| Беговая дорожка | Изготовлена на заказ в Зоологическом институте, Кельнский | ||
| Microsoft Excel 2016 | Microsoft | Version 2016 | |
| KinemaJ | Nicolas Stifani | Это скрипт, созданный для использования с ImageJ | |
| KinemaR | Nicolas Stifani | Это скрипт, созданный для использования с Rstudio | |
| Vicon Motus | Vicon Motus Version | 9.00 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.00 |
Ссылки
- Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28 (11), 1469-1473 (2013).
- Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17 (4), 224-238 (2016).
- Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16877-16882 (2014).
- Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1 (4), 215-224 (2002).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
- Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206 (1), 7-14 (2012).
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
- Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23 (36), 11411-11419 (2003).
- Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230 (2), 280-290 (2011).
- Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7 (9), 701-708 (2010).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
- Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211 (1), 1-10 (2010).
- Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33 (18), 1667-1684 (2016).
- de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59 (2), 112-128 (2009).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224(2007).
- Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
- Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58 (13), 1523-1531 (2010).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129 (Pt 8), 1972-1983 (2006).
- Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169 (3), 205-213 (2007).
- Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89 (10), 1698-1706 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
