Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка дофаминергической гомеостаза у мышей с использованием высокопроизводительных жидкостной хроматографии анализа и поглощение синаптосомальных допамина

11.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56093

⸱

21 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

Синаптосомальных допамина поглощения и жидкостной хроматографии высокой производительности представляют экспериментальные инструменты для анализа расследовать допамина гомеостаза у мышей путем оценки функции транспортер дофамина и уровни допамина в полосатой ткани, соответственно. Здесь мы представляем протоколы измерения содержания дофамина ткани и оценить функциональность транспортер дофамина.

Аннотация

Допамин (DA) является модулирующее нейромедиатором контроль двигательной активности, вознаграждение процессы и когнитивные функции. Обесценение синапсах дофаминергической (DAergic) прочно ассоциируется с несколькими центральной нервной системы ассоциированных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, внимание дефицит гиперактивностью и зависимость от наркотиков1,2 ,3,4. Разграничение болезни механизмов с участием DA дисбаланс зависит критически животных моделей имитировать аспекты заболеваний, и таким образом протоколы, которые оценить конкретные части гомеостаза да важно предоставить новые идеи и возможности терапевтического цели для этих заболеваний.

Здесь, мы представляем две полезные экспериментальные протоколы что, при сочетании обеспечивают функциональные считывания DAergic системы у мышей. Биохимических и функциональных параметров гомеостаза да получаются путем оценки уровней да и допамина транспортера (DAT) функциональность5. При расследовании да системы, способность надежно измерять эндогенными уровнями да от взрослого мозга имеет важное значение. Таким образом мы представляем как для выполнения высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на ткани головного мозга от мышей для определения уровней DA. Мы проводим эксперимент на ткани от дорсальной стриатума (р) и прилежащем ядре (NAc), но метод подходит также для других областей DA-иннервируются мозга.

DAT имеет важное значение для reuptake Да в пресинаптическом терминал, таким образом контролируя временных и пространственных активность выпустила DA. Зная, уровни и функциональность DAT в стриатума имеет большое значение при оценке да гомеостаза. Здесь мы предоставляем протокол, который позволяет одновременно выводить информацию о поверхности земли и функции с помощью пробирного поглощение синаптосомальных6 да.

Нынешние методы в сочетании со стандартной immunoblotting протоколы обеспечивают исследователь с соответствующими инструментами для характеристики системы DAergic.

Введение

Допамин (DA) является критической для моторное поведение, вознаграждение и когнитивные функции1,,78,9модулирующее нейромедиатором. Дисбаланс в DA гомеостаза причастны несколько нервно-психических заболеваний, как синдром дефицита внимания и гиперактивности, наркомания, депрессия и болезни Паркинсона1. Да освобождается от Пресинаптический нейрон в синаптическую щель, где он связывает и активирует рецепторы на предварительной и постсинаптической мембраны, тем самым дальнейшей передачи сигнала. Уровень Да в синапсе после выпуска пространственно и временно управляется DAT3,10. Транспортер секвестров да из внеклеточного пространства и таким образом поддерживает да физиологические уровни3,11. Генетическая удаление DAT в мышей вызывает дофамина фенотип характеризуется повышенными уровнями синаптических Да, истощения внутриклеточных да бассейнов и глубокие изменения в постсинаптической DAergic сигнализации10,12.

Здесь представлены два отдельных протоколов, один метод измерения да ткань содержание и другой, чтобы оценить функциональность DAT. совмещенное с поверхности biotinylation assay, описываемого Габриэль et al.13 эти два методы предоставляют информацию о да содержание и функциональные уровни DAT для тщательной оценки да гомеостаза. С помощью этих методов да гомеостаза различных трансгенных мышей или модели заболеванием можно охарактеризовать и описаны. Эти инструменты были реализованы и оптимизированы и стандартного использования в наших лабораториях. Текущие исследования служили исследовать последствия на DA гомеостаза изменяя C-терминал DAT14 или выражая Cre рекомбиназа под тирозин гидроксилазы (TH) промоутер 5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

руководящие принципы датской инспекции экспериментов животных (разрешение номер: 2017-15-0201-01160) последовал и эксперименты в полностью АААЛЖ аккредитованных Фондом под наблюдением местных животных Комитет.

1. синаптосомальных поглощение дофамина (метод 1)

Примечание: этот протокол для параллельной оценки два мозга, но может успешно использоваться для выполнения синаптосомальных да поглощение эксперименты с четырьмя мозги в параллельные.

  1. Препараты
    1. этикетка 48 1,5 мл микро центрифуга трубы в таблице 1 (24 для каждого мозга). Используйте разные цвета для труб, принадлежащие каждой мозга для предотвращения путаницы между выборками
    2. Label 51 сцинтилляционные трубки #1-51.
    3. Место фосфат буфер солевой раствор (PBS) на льду. Это будет использоваться для держать мозг охлажденные.
    4. Повернуть на центрифуге для предварительно охладите до 4 ° с.
    5. Заранее взвесить два микро-пробирок получить точное ткани вес во время синаптосомальных подготовки (раздел 2.6).
    6. Подготовка гомогенизации буфер путем смешивания 4 мм HEPES и 0,32 М сахарозы. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 и держать на МКО.
      Примечание: Гомогенизации буфер может храниться в аликвоты при-20 ° C и талой день эксперимента.
    7. Подготовка поглощение буфера, объединяя следующих: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaCl 2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л). Скорректировать рН 7,4 с NaOH (приводит к концентрации натрия примерно 130-мм) и держать на льду
      Примечание: Для 2 мозги, подготовьте 1500 мл поглощение буфера. Подготовить поглощение буфера как 10 x Стоковый раствор без аскорбиновой кислоты и глюкозы в 4 ° C. Make 1 x рабочий раствор свежего на день, дополняющего с аскорбиновой кислотой и глюкозой. Отрегулируйте пэ-аша с NaOH до 7,4.
    8. Подготовка поглощение буфера + лиганд, объединяя следующие: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaC l2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л), 1 мкм pargyline, 100 Нм дезипрамин, 10 Нм Ингибиторы катехол-О-метил трансферазы (КОМТ). Отрегулируйте к пэ-ашу 7.4 с NaOH и держать на льду
      Примечание: Используйте буфер поглощение 50 мл и добавить лиганда. Pargyline добавляется для предотвращения деградации да путем окисления через моноаминоксидазы (Мао). КОМТ ингибитора (RO-41-0960) добавляется к предотвращению деградации Да (катехоламинов в целом) через КОМТ. Тормозят поглощение через транспортеры норадреналина и серотонина и тем самым сделать поглощения результатов конкретный для DAT. добавляется дезипрамин
    9. Подготовка поглощение буфера + лигандом + кокаина, объединяя следующие: 25 мм HEPES, 120-мм NaCl, 5 мм KCl, 1,2 мм CaCl 2, 1,2 мм MgSO 4, 1 мм аскорбиновой кислоты (0,194 г/Л), 5 мм D-глюкоза (0.991 г/Л), 1 pargyline мкм, 100 Нм дезипрамин , 10 Нм КОМТ ингибитор, 500 мкм кокаина. Скорректировать рН 7,4 с NaOH и держать на льду
      Примечание: Используйте буфер поглощения 7 мл + лиганда и добавить кокаина. Кокаин добавляется фон измерения поглощения да неспецифические для вычитания из данных, оставив только DAT-конкретных поглощение (поскольку SERT и NET являются тормозится дезипрамин, как описано выше). Кроме того, очень мощным и конкретных DAT ингибитор GBR-12935, вместо него может использоваться.
      Важно: Не все на льду отныне .
  2. Синаптосомальных подготовка
    1. пожертвовать одной мыши одновременно шейки матки вывихов и обезглавливание.
    2. Вырезать кожу с помощью ножниц выявить черепа и отрезать любой избыток тканей кзади череп слева от обезглавливание. Вырезать черепа с небольшой прямые ножницы вдоль sutura sagittalis заканчивается максимально кпереди.
    3. Советы двух ножниц в каждый глаз мыши и прорваться через череп, чтобы удалить оставшуюся часть черепа и мозга нетронутыми. Быстро удалить мозга и поместите его в ледяной PBS. Это будет держать холодной, а второй мозг тренированное.
    4. С помощью матрицы мозга, вскрыть 3 мм корональных ломтик стриатума (передний задний: 1,5 мм -1,5 мм) следуют тонкие диссекции с нокаутером. Смотрите Рисунок 1 для зоны Панч.
    5. Держите ткани на льду на все времена движение вперед.
    6. Передавать микро пластиковых пробирок 1.5 мл для взвешивания ткани.
      Примечание: Этот вес будет использоваться на шаге 1.2.14.
    7. 1.2.1-1.2.6 повторить шаг второй мозг.
    8. После того, как вес был получен для обоих мозги, передачи ткани для гомогенизации стекла, содержащие 1 мл ледяной гомогенизации буфера.
    9. Гомогенизировать ткани с помощью мотор приводом пестиком в 800 об/мин, 10 даже ударов.
      Примечание: Один ход равно одно вверх и вниз действий, первого удара должна быть около 5 сек, следующие 3-4 s. гомогенизации в изотонический среде имеет важное значение для предотвращения разрыва синаптосомах 6. С помощью соответствующих сил и изотонический среднего позволит Пресинаптический терминалы для запечатывания включающего цитоплазмы, синаптических пузырьков, митохондрии и Цитоскелет 15.
    10. Передавать микро пластиковых пробирок 1.5 мл огневки и собирать оставшихся огневки из стекла гомогенизации, полоскание с 0,5 мл дополнительные гомогенизации буфера.
    11. Держите образец на льду во время гомогенизированные ткани от головного мозга. Параллельно два мозги в шаги 1.2.12-1.2.13.
    12. Гранулы ядер и клеточной мусора путем центрифугирования (1000 x g, 10 мин, 4° C).
    13. Передавать новый 1,5 мл пробирок microcentrifuge супернатант (S1) (содержащие клеточных мембран и цитоплазмы) и центрифуги на 16000 x g 20 мин на 4 ° C.
    14. Удалить супернатант (содержащих цитоплазму) и Ресуспензируйте Пелле (P2) (содержащие сырой синаптосомах) в 40 мкл буфера гомогенизации / мг ткани (на основании веса, полученного на шаге 1.2.6). Нежно ресуспензируйте сырой синаптосомальных дроби с пипеткой p1000, как слишком много сил будет разорвать синаптосомах.
      Примечание: Важно, чтобы в конечном итоге с по крайней мере 280 мкл. Если нет, то необходимо будет разбавления с более чем 40 мкл на мг. 1.2.1-1.2.13 шаги должны быть выполнены как можно быстрее, и все должно храниться на льду. Как только сырая синаптосомах были высокомобильна в буфере гомогенизации они являются довольно стабильными, пока они хранятся на льду 6 , , 15 16.

2. Поглощение эксперимент

  1. Добавить 440 мкл буфера поглощение + лиганд + кокаина в 440 мкл буфера поглощения и назначенный 12 труб microcentrifuge 1,5 мл + лигандом для 36, оставшиеся 1,5 мл microcentrifuge трубы (см. таблицу 1 для макета).
    Примечание: Удалите их из льда 15 мин до начала эксперимента по довести их до комнатной температуры, но держать на льду пока, то для сохранения ингибиторов.
  2. Подготовить кривой насыщения (Допамин (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H допамина) (91.1 Ci/ммоль) в различных концентрациях окончательный (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1,0 мкм)).
    1. Ярлык шесть 2 мл microcentrifuge трубы 10, 5, 2.5, 1.25, 0,62 и 0.31.
    2. Добавить 750 мкл буфера поглощение + лиганд в 5 microcentrifuge труб с наименьшим номером.
    3. Добавить 1,455.4 мкл буфера поглощение + лиганд, 14,6 мкл допамина (1 мм), 30 мкл 3-H допамина (11 мкм) трубки помечены 10.
    4. Передачи 750 мкл из трубки помечены 10 на трубу, помечены 5. Хорошо перемешайте и передать 2,5 труба 750 мкл от этой трубки. Повторите этот разрежения с оставшейся трубы.
  3. Предварительной промывки фильтры из микрофибры стекла с 4 мл поглощение буфера после размещения их на ведро 12 хорошо фильтр.
  4. Добавить 10 мкл суспензии синаптосомальных мембран в первые 24 1,5 мл микро центрифуга трубки (см. таблицу 1 для макета) содержащий 440 мкл буфера. Вихревой тщательно и спин вниз вскоре обеспечить что синаптосомах погружали в буфере. Оставить на 37 o C на 10 мин
    Примечание: Важно быть точным на раз в ходе эксперимента поглощение за справедливое сравнение между мозгом. Использовать секундомер для точности.
  5. Добавьте 50 мкл допамина концентрация 10 и 5 мкм (раздел 2.2) первые две колонки и отпуск на 37 o C на 5 мин при встряхивании. После ровно 5 мин остановите реакции, добавив 1 мл ледяной поглощение буфера. Сделайте то же самое с концентрацией 2.5 и 1,25 мкм (раздел 2.2), а затем с концентрацией 0,62 и 0,31 мкм.
  6. Добавить образцы фильтры предварительно промыть из микрофибры и мыть с 5 x 4 мл ледяной поглощение буфера. Когда первые 12 образцов были добавлены фильтры, переместить фильтры сцинтилляционные трубы. Повторите это с следующие 12 образцов.
  7. Повторить шаг 2.4-2.6 для следующего мозга.
  8. Подготовить 3 Макс подсчет трубки, поместив микрофибры фильтр в нижней части трубы сцинтилляционные 49-51 и добавив 25 мкл максимальная допамина концентрации на вершине (10 мкм).
  9. Оставьте все 51 сцинтилляционные, трубы Зонта на 1 ч.
  10. Добавить 3 мл сцинтилляционные жидкости к каждому сцинтилляционные трубки и трясти энергичные на шейкер на 1 ч.
  11. Игр [3 H]-Да в бета счетчик на 1 мин
    1. Откройте программу и выберите: Метки: H-3, плита/фильтр: 4 мл во флаконе, 4, 6, Assay типа: нормальный и подсчета времени: 1 мин
      Примечание: Этот шаг может выполняться следующий день если более удобным. Образцы, покрыты фольгой на ночь оставить.
  12. Определение белка
    1. использовать стандартный набор BCA Assay протеина для определения концентрации белка синаптосомах для корректировки с сиг / мин (cpm) фмоль/мин/мкг и для правильного сравнения поглощения между выборками.

3. Анализ данных

  1. использования данных от поглощения эксперимент сделать насыщенность кривой для каждой группы и рассчитать скорость реакции (V max) и константа Михаэлиса Menten (M K).
    Примечание: Значение K M отражает концентрации субстрата, необходимые для достижения половина V Макс. Соответственно, V Макс непосредственно отражает функции DAT (максимальную емкость поглощения), который зависит от количества DAT на поверхности и как может модулировать свою деятельность Посттрансляционная модификаций и/или взаимодействия белков, а также на изменения в Ион градиентов. Значение K M является косвенным показателем сходства субстрат для транспортера, важно также может модулировать Посттрансляционная модификаций и/или взаимодействия белков. Чтобы полностью оценить функциональные изменения Поэтому важно непосредственно определить уровни поверхности выражения, например поверхности biotinylation assay. Описание reuptake допамина и разработка на смысл K М и V максимальные значения были рассмотрены Schmitz et al. 17.

4. Высокая производительность жидкостной хроматографии (метод 2)

  1. мозга рассечение
    1. Label и весят microcentrifuge трубы; один на каждый регион на мышь.
    2. Пожертвовать одной мыши одновременно шейки матки вывихов и обезглавливание. Быстро удалите мозга, как описано в разделе 1.2. Сразу выполнить далее диссекции.
    3. С помощью матрицы мозга, вскрыть 3 мм корональных ломтик стриатума следуют тонкие двусторонние рассечение NAc и р-н с нокаутером. Смотрите Рисунок 3 области Панч.
    4. Передача ткани для 1.5 мл пробирок microcentrifuge и быстро на сухой лед. Вес ткани и поместите его обратно на сухой лед немедленно.
      Примечание: Вес ткани имеет важное значение для расчета концентрации позже.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. повторите шаги с следующим мыши.
      Примечание: Место ткани на 80 o C до дальнейшей обработки или немедленно приступить к обработке ткани.

5. Подготовка тканей

  1. поворот на центрифугу, чтобы дать ему остыть до 4 ° C в предварительно
  2. подготовить решение гомогенизации (0,1 N хлорной кислоты (4 HClO)) и держать на ДВС.
  3. Использование гомогенизации решения, готовить свежие 0.1 пмоль/мкл допамина стандарт от 1 мм раствор (10000 x разрежения).
    Примечание: Стоковый раствор готовится путем растворения допамина в буфере гомогенизации запасов концентрацию 1 мм, который может храниться при температуре 20 ° C около одного месяца. Если интерес представляют других областях мозга, концентрация стандарта будет должны быть изменены, поскольку других областях мозга, включая prefrontral коры, гиппокамп, substantia nigra и брюшной вентральная область обладают до 100 раз меньше да, по сравнению с стриатума.
  4. Добавить 500 мкл гомогенизации решение для каждой выборки (т.е. NAc и г ткани; раздел 4.1) и гомогенизации образцы с использованием ультра гомогенизатор на полной скорости для приблизительно 30 s. держать образец в ледяной воде во время гомогенизации. Между каждой выборки, очистить ultra гомогенизатор с водой (полная скорость 30 s).
  5. Центрифугуйте образцы на 30 мин при 4 ° C, 14.000 x g.
  6. Передачи примерно 200 мкл пример стекла 0,22 мкм фильтр (1 см в диаметре), используя пластиковый шприц 1 мл.
    Примечание: Использование стеклянных фильтров является не важных, поскольку фильтры выбрали 0,22 мкм для удаления высокомолекулярных веществ.
  7. Анализ образцов, электро химической Обнаружение (EC)-ВЭЖХ методологии 18 как описано в разделе 6.

6. Анализ жидкостей хроматографии высокой производительности

  1. подготовить следующие решения для мобильных фазы: ацетат натрия сульфатоктановая кислота Na 2 ЭДТА 0,1 мм, Ацетонитрил 8%, уксусная кислота 0,1 М, 1 мм, 55 мм pH = 3.2.
    Примечание: Настройки рН 0,1 М уксусной кислотой. Важно быть точным с рН. Раствор должен быть degassed на он-лайн дегазатор (составной частью ВЭЖХ системы). Сделать 2 Л мобильных фазы и менять его примерно раз в месяц (изменить его, когда шум становится заметным). Из-за колебаний он принимает около 24 ч для регулировки после изменения этапа мобильных.
  2. Настройки детектора:
    1. набор Вольт выход до 700 мВ и температура 32 ° C на детектор печи, это очень важно. Сделайте программу диапазон, используя онлайн руководство. Смотрите в руководстве для более подробной информации). Добавить время программы согласно таблице 2.
      Примечание: В этом исследовании, программа устанавливается автоматически изменить текущий набор удержания время, держать ВЭЖХ на оптимальный ток и держать на вершины Хроматограмма как расширен как можно скорее, но по-прежнему в представлении. Это был оптимизирован для полосатой мозга лизатов от мышей.
  3. Когда программы добавлен детектор, сделать 3 точки калибровочной кривой, вводя стандарт три раза (5, 10 и 15 мкл).
    Примечание: Стандарт (10 мкл (10 мкл x 0.1 пмоль/мкл = 1 пмоль DA)) следует вводить каждый десятый образца и образцы, калиброванные в ближайший стандарт. Штрафа настройки системы предыдущий день, регулируя стандарт 3-точка и проверки, если Хроматограмма выходит в ожидаемый диапазон. Если наблюдается значительный шум, измените мобильные фазы. Если пик выше, чем 990 mV, то снова залить образца в низкой громкости, или сделать новую программу диапазон и новой стандартной кривой. Предел обнаружения измеряется как 3 раза значение шума в МВ до низкого пикового значения, вводят для каждого стандарта (NA, DOPAC, да, 5-HIAA, с высокой добавленной стоимостью, 3-м и 5-HT).
    1. Установка системы, открыв LC решения и активация начинается 1; Этот анализ в режиме онлайн. Введите идентификатор пользователя и пароль и нажмите кнопку ОК. Ожидание для LC решения для подключения к документам. Перейти к пакетной таблицы и заполнения данных (например, образец типа: неизвестных образцов и std для стандартных, анализ типа: он QT, объем inj: 10, ISTD amt: уровень 1 кон). Сохранить файл (перейдите к файл - > сохранить пакетный файл как - > спасти).
    2. Сделать систему ввести первый образец, нажав ' Начало Пакетная '. Это приведет к инъекций 10 мкл пример Автоматический пробоотборник с модулем растворителя доставки.
      Примечание: Используйте насос расхода 0,15 мл/мин и C18 столбца с разворота фазы. Здесь был использован Амперометрическое детектор для электрохимических обнаружения. Электрод стеклоуглерода должно быть присвоено 0,8 V с Ag/AgCl электродов ссылки. С целью анализа допамина, использовать хроматографии 3 мкг ОРВ (3) C18 (DA 2 мм x 100 мм, частиц размером 3 мкм) для достижения хроматографического разделения.
    3. Экстракт пик зарегистрированных и расчетных областей.
      1. Перейти к сбора данных следовать Хроматограмма, когда образцы закончили. Перейти к Lc, после выполнения анализа - > выбрал имя файла (Хроматограмма откроет) - > нажмите кнопку Просмотр. На панели ручной интеграции, добавьте все вершины быть интегрированы - > идти для данных отчета и распечатать чтения.
        Примечание: Здесь программное решение LC был использован для данных анализа и системы управления.
  4. Из районов, пик, рассчитать концентрацию дофамина в образце, следующим с помощью известной концентрации стандарта:
    1. использовать площади пика стандарта (равен 1 пмоль) для получения фактор а.
      figure-protocol-1
    2. использовать фактор для получения образцами концентрации.
      Концентрация образца (в пмоль 10 мкл) = коэффициент A × площади пика образца
    3. использовать эту формулу для получения образца концентрация нг.
      Пример концентрации пмоль / 10 мкл x 500 мкл x МВт допамина = концентрация образца в нг
      образец концентрация (в НГ) = концентрация образца (в пмоль 10 мкл) x 500 мкл x МВт допамина
    4. использовать образец концентрация в НГ, чтобы получить t Он образец концентрация в тканях ПГ/г (образец концентрации ПГ / ткань g = ткани ПГ/г).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Текущий протокол да поглощения (рис. 1) включает в себя все шаги, необходимые для оценки функции DAT в синаптосомах от мышей. Наши репрезентативных данных метода поглощения DA (рис. 2) изображает кривой насыщения с нескорректированных данных (рис. 2B) и скорректировать данные (рисунок 2A). Насыщенность кривая показывает поглощения от мышей дикого типа. Обычно один бы да ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта рукопись описывает полезными экспериментальные протоколы разграничить да гомеостаза в любой мыши модели выбора. Мы предоставляем подробные протоколы для измерения уровней Да в ткани мозга от мышей с помощью ВЭЖХ и синаптосомальных да поглощения для оценки функциональных да транспорта через DAT. Ниже будут разработаны процедуры, протоколы и ограничения для ВЭЖХ эксперимент и синаптосомальных да поглощение assay.

Протокол синаптосомальных поглощение может предоставить полезную информацию для...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана UCPH 2016 Программа Excellence (уг, а.р., К.Я), Lundbeck Foundation (м.р.) Lundbeck фонд центр биомембран в наномедицины (уг), национального института из здравоохранения грантов P01 да 12408 (уг), датский Совет независимых исследований - медицинских наук (уг).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ингибитор COMTSigma Aldrich, ГерманияRO-41-0960Для протокола захвата синаптосомального DA
3H]-дофаминаPerkin-Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, СШАNET67-3001MCДля протокола захвата синаптосомального DA
Стеклянные фильтры из микроволокнаGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Бакингемшир1822-024Для протокола захвата синаптосомального DA
HiSafe Сцинтилляционная жидкостьPerkin Elmer1200-437Для протокола поглощения синаптосомального DA
MicroBeta2Perkin ElmerДля протокола захвата синаптосомального DA
Набор для анализа белка BCAThermo Scientific Pierce23225Для протокола захвата синаптосомального DA
HEPESSigma Life ScienceH3375Для протокола захвата синаптосомального DA
СахарозаSigma LifeScience S7903Для протокола поглощения синаптосомального DA
NaClSigma LifeScience S3014Для протокола захвата синаптосомального DA
KClSigma Life ScienceP9541Для протокола захвата синаптосомального DA
CaCl2Merck KGaA10043-52-4Для протокола захвата синаптосомального DA
MgSO4Sigma Life Science63065Для протокола поглощения синаптосомальной DA
Аскорбиновая кислотаSigma Life ScienceA0278Для протокола поглощения синаптосомальной DA
D-глюкозыSigma Life ScienceG7021Для протокола поглощения синаптосомальной DA
PargylineSigma AldrichP-8013Для протокола захвата синаптосомальной DA
DesipramineSigma AldrichD3900Для синаптосомального захвата DA
протокол ДопаминSigma Life ScienceH8502Для протокола захвата синаптосомального DA
КокаинSigma Life ScienceC5776Для протокола захвата синаптосомального DA
Матрицамозга ASI инструментыRBM2000CДля протокола захвата синаптосомального DA
Cafano механический тефлоновый разрушительBuch & HolmСнятос производства Для протокола поглощения синаптосомального DA (гомогенизация)
Antec Decade (Амперометрический детектор)Antec, Лейден, НидерландыСнято с производства: новая модель DECADE Elite / Lite™ Электрохимические детекторы типа 175 и 176для ВЭЖХ протокола
Avantec 0.22 μ m стеклянный фильтрFrisenette ApS, Дания13CP020ASДля протокола ВЭЖХ
Колонка: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, ГерманияНомер детали: 00A-3300-E0Для протокола ВЭЖХ
Программное обеспечение для решения LCShimadzuLabSolutions Рабочая станция сериидля протокола ВЭЖХ
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlДля протокола ВЭЖХ (Тканевой препарат)
EDTASigmaE5134-50gДля протокола
ВЭЖХNatriumdihydrogenphospharBie& Berntsen1.06346 1000гДля протокола ВЭЖХ
Натрия 1-октансульфоната моногидратAldrich74885 -10гДля протокола ВЭЖХ
Ацетонитрил, изократическая ВЭЖХ маркиШарлауAC03402500Для протокола ВЭЖХ
Filtre 0.22 мкмFrisenette ApS, ДанияAvantec 13CP020ASДля протокола ВЭЖХ (Тканевый препарат)
Ортофосфорная кислота 85%Merck1.00563. 1000млДля протокола ВЭЖХ
ElectrodeAntec, Лейден, НидерландыAN1161300Для протокола ВЭЖХ (см. инструкцию в интернете)
Программа детектора на электрохимическом детекторе DECADE IIAntec, Лейден, НидерландыLite™ Электрохимические детекторы типа 175 и 176для протокола ВЭЖХ
[ Shimadzu LabSolutions

Ссылки

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580(2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468(2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка дофаминергической гомеостаза у мышей с использованием высокопроизводительных жидкостной хроматографии анализа и поглощение синаптосомальных допамина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.