Методическая статья

Профилирование IgG против Neu5Gc в человеческой сыворотке с помощью анализа сиалогликанового микрочипа

DOI:

10.3791/56094

⸱

13 июля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ с использованием сиалогликана для микрочипов может быть использован для оценки антител против Neu5Gc в сыворотке крови человека, что делает его потенциальным высокопроизводительным диагностическим анализом рака и других хронических заболеваний, опосредованных воспалением.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки покрыты плащей углеводных цепей (гликанов), которые обычно изменяются при раке, и которые включают изменения экспрессии сиаловой кислоты (Sia). Это кислые сахара, которые имеют 9-углеродный скелет и эти крысиные позвоночные гликаны на поверхности клеток. Двумя основными формами Sia у млекопитающих являются N- ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и ее гидроксилированная форма, N- гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc). Люди не могут продуцировать эндогенный Neu5Gc из-за инактивации гена, кодирующего гидроксилазу Cytidine 5'монофосфата-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). Иностранный Neu5Gc приобретается клетками человека через диетическое потребление красного мяса и молочных продуктов и впоследствии появляется на разных гликанах на поверхности клеток, накапливаясь в основном на карциномах. Следовательно, люди имеют циркулирующие антитела против Neu5Gc, которые играют разнообразную роль в раке и других хронических заболеваниях, опосредуемых воспалением, и которые становятся потенциальными диагностическими и терапевтическимиrgets. Здесь мы описываем высокопрочный сиалогликанный микрочиповый анализ для оценки таких антител против Neu5Gc в сыворотке крови человека. Глюканы, содержащие Neu5Gc, и их согласованные пары контролей (гель-гены, содержащие Neu5Ac), каждый с основным первичным амином, ковалентно связаны с стеклянными слайдами с эпоксидным покрытием. Мы демонстрируем печать 56 слайдов в 16-луночном формате с использованием конкретного нано-принтера, способного генерировать до 896 массивов на печать. Каждый слайд может использоваться для скрининга 16 различных образцов сыворотки человека для оценки специфичности, интенсивности и разнообразия антител против Neu5Gc. Протокол описывает сложность этого надежного инструмента и дает основное руководство для тех, кто стремится исследовать реакцию на диетический углеводный антиген Neu5Gc в различных клинических образцах в формате массива.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sias - кислые сахара, покрывающие гликановые цепи на гликопротеинах клеточной поверхности и гликолипидах у позвоночных. Экспрессия Sia модифицируется в раковых клетках 1 и коррелирует с прогрессированием и / или метастазами 2 , 3 . Двумя основными формами Sia у млекопитающих являются Neu5Ac и его гидроксилированная форма Neu5Gc 2 . Люди не могут синтезировать Neu5Gc из-за специфической инактивации гена, кодирующего фермент CMAH. Этот нечеловеческий Sia метаболически включает в клетки человека как «я», происходящие из диетических продуктов, богатых Neu5Gc ( например, красного мяса) 4 , 5 . Neu5Gc присутствует на низких уровнях на клеточных поверхностях эпителия человека и эндотелии, но он особенно накапливается в карциномах. Neu5Gc признан чужеродным гуморальной иммунной системой человека 2 , 6 .Антигенная сложность Neu5Gc-гликанов может возникать на нескольких уровнях, включая модификацию Neu5Gc, связывание, лежащие в основе гликаны и каркасы, и их плотность, что отражается на сложности ответа антитела против Neu5Gc у людей 6 . Некоторые из этих антител являются биомаркерами карциномы и потенциальными иммунотерапевтическими средствами 7 . Появление химиоферментального синтеза различных сиалогликанов 8 способствовало более глубокому анализу таких антител, чему способствовало использование технологии микрочипов гликана 9 , 10 . Таким образом, благодаря облегченной подготовке и манипулированию большими библиотеками природных и синтетических углеводов глианные микрочипы стали мощной высокопроизводительной технологией для исследования взаимодействия углеводов с множеством биомолекул 10 , 11 , 12 , 13 . В формате массива используются минимальные количества материалов, и этот многовалентный дисплей биологически релевантных гликанов позволяет исследовать тысячи связывающих взаимодействий в одном эксперименте. Важно отметить, что эта технология также может быть применена к обнаружению биомаркеров и для мониторинга иммунных ответов в различных образцах 7 , 12 .

Успешное изготовление микрочипов в гликанах требует рассмотрения трех важных аспектов: типа робота-принтера, химии конъюгации гликанов и оптики обнаружения. Что касается рассмотрения печатного инструмента, доступны два метода: контактные и бесконтактные принтеры. При контактной печати 1-48 стальных штифтов погружают в пластину с множеством колодцев, содержащую раствор гликанов, и высевают на функционализированные стеклянные слайды, непосредственно контактируя с поверхностью стекла. Сумма решения deСжиженный на слайде, является функцией продолжительной продолжительности на поверхности скольжения. Обычно образцы сначала предварительно фиксируются на стеклянном блоке (чтобы достичь однородных пятен), прежде чем они будут напечатаны на поверхности скольжения. В бесконтактных принтерах ( например, пьезоэлектронный принтер) гликаны печатаются из стеклянного капилляра с использованием контролируемых электрических сигналов. Электрический сигнал может быть точно калиброван для достижения более точной печати относительно контактной печати. Размер и морфология пятен также относительно более однородны. Дополнительным преимуществом является повторная рециркуляция образца обратно к исходной пластине после печати. Тем не менее, основным недостатком пьезоэлектронных принтеров является ограничение на печать (4 или 8), что приводит к очень длительной длительности печати, что требует особого внимания стабильности скольжения, температуры, влажности и испарения образца. Бесконтактный струйный принтер требует больших объемов выборки 14 .

В отличие от ограниченных доступных вариантов методов печати, химия конъюгации гликанов является более сложным соображением, с множеством вариантов на выбор. Отобранная химия иммобилизации должна учитывать как активные группы на гликанах, так и реактивность поверхности скольжения. Гликаны, которые должны быть иммобилизованы на определенную поверхность микрочипа, синтетически синтезированную или естественно изолированную, требуют одинаковой реактивной группы. Кроме того, гликаны должны быть чистыми и гомогенными. С другой стороны, поверхность иммобилизации и химия должны обеспечивать воспроизводимость и надежную плотность крепления. Были разработаны множественные методы иммобилизации с использованием ковалентного или нековалентного (физического поглощения) 10 , 11 , 12 , 13 . Для получения более подробной информации о печатной технологии микрочипов гликана для непосвященныхD следователь, см. Эти превосходные обзоры 13 , 15 . Важно отметить, что недавняя минимальная информация, необходимая для инициативы Glycomics Experiment (MIRAGE), описывает руководящие принципы для подготовки образцов 16 и для представления данных из анализа микрочипов гликана 17 для улучшения стандартов в этой растущей области.

Здесь мы опишем подробный протокол для изготовления микромассивов сиалогликана с использованием специального контактного нанопринтера в формате с 16 ячейками. Каждый из гликанов имеет первичный амин, который опосредует их ковалентную связь с стеклами, активированными эпоксидным стеклом. Мы также описываем разработку и анализ одного слайда с использованием различных образцов сыворотки крови, антител и лектинов, связывающих Sia-связывание. Анализы микроматрицы Sialoglycan включают в себя несколько основных этапов, которые включают в себя изготовление, обработку, разработку и анализ массивов. Изготовление массивов требует планированияЛучевой макет, подготовка гликанов и исходной пластины, программирование нано-принтера и печать слайдов. Затем слайды обрабатываются, разрабатываются и анализируются ( рис. 1 ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы сыворотки человека были получены из израильского банка крови и использовались в соответствии с Хельсинкской декларацией и Тель-Авивским институтом по пересмотру.

1. Планирование и компоновка массивов

  1. Определите макет слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Каждый слайд содержит 16 поддиапазонов, разделенных на 16 одинаковых блоков с номерами B1-B16 ( рисунок 1B , дополнительный рисунок 1A ).
  2. Определите расположение контактов. Используйте четыре контакта, каждый из которых печатает четыре поддиапазона (блоки) на слайд:
    Pin 1 печатает блоки 1, 2, 9 и 10;
    Pin 2 печатает блоки 3, 4, 11 и 12;
    Pin 3 печатает блоки 5, 6, 13 и 14; а также
    Pin 4 печатает блоки 7, 8, 15 и 16 ( дополнительный рисунок 1A ).
  3. Определите блок и 384-луночный планшет.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Порядок, в котором гликаны появляются в каждом блоке, требует тщательного планирования. В этом примере arrAy, распечатать каждый образец в четырех повторах, спроектировать флуоресцентные маркерные пятна, которые будут расположены в нижнем правом углу (для облегчения анализа пятен), и распечатать пятна IgG (STD) стандартной кривой в шести возрастающих концентрациях ( дополнительный рисунок 1B ).
    1. Для каждого напечатанного пятна сначала раздайте материал в четыре лунки (по одному для каждого штифта) в 384-луночном планшете.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Порядок материалов на 384-луночной планке основывается на планируемой компоновке блока ( дополнительный чертеж 1B-C ).

2. Подготовка гликанов и исходной пластины

  1. Подготовьте буфер для печати гликона (50 мл 300 мМ фосфатного буфера, pH 8,4). Взвешивают 58,5 мг моногидрата мононатрийфосфата (NaH 2 PO 4 · 1 H 2 O) и 3,9 г гептагидрата динатрийфосфата (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) в 40 мл деионизированной воды (DIW). Титрат до рН 8,4 с использованием 4 М NaOH. Отрегулируйте громкость до 50 млD через мембрану 0,2 мкм для стерилизации.
  2. Подготовьте буферный буфер (50 мл 187 мМ фосфатного буфера, pH 5). Взвешивают 289 мг моногидрата мононатрийфосфата (NaH 2 PO 4 · 1 H 2 O) и 1,94 г гептагидрата динатрийфосфата (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) в 40 мл ДИ. Титруют до рН 5, используя 1 М HCl. Отрегулируйте объем до 50 мл и процедите через мембрану 0,2 мкм для стерилизации.
  3. Подготовьте буфер кривой STD (50 мл PBS-глицерин: забуференный фосфатом физиологический раствор, pH 7,4, дополненный 10% глицерином из 100% глицеринового сырья) и отфильтруйте его через мембрану 0,2 мкм для стерилизации.
  4. Подготовьте каждый раствор гликанов в 10 мМ в DIW. Проверьте концентрации сиалилированного гликана с помощью флуоресцентного детектирования на жидкофазной хроматографии высокого давления с обращенной фазой 18 .
  5. Разбавляют каждый гликан до 100 мкМ в общем объеме 100 мкл буфера для печати гликановВ микроцентрифужных пробирках.
  6. Подготовьте первичный амин, содержащий флуоресцентный краситель. Солюбилизируйте Alexa 555-гидразид до 1 мг / мл с помощью маркерного буфера, а затем разбавьте до 1 мкг / мл в общем объеме 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Любой другой первичный аминосодержащий краситель можно использовать с соответствующей длиной волны в соответствии со сканером слайдов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пункты маркера облегчают выравнивание сетки в каждом блоке во время анализа.
  7. Подготовьте разведения кривой IgG человека IgG: подготовьте 0,5 мл исходного раствора человеческого IgG при 160 нг / мкл в буфере для кривой STD. Серийно разбавляйте запас 1: 1 шесть раз, чтобы получить 80, 40, 20, 10, 5 и 2,5 нг / мкл, все в буфере для кривой STD при общем объеме 200 мкл каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Другие изотипы Ig могут быть использованы, если они подходят для эксперимента ( например, IgA человека, IgM, IgE или Ig другого организма).
  8. Поместите 384-луночный планшет на лед. Используя электронную мультипипетку, аликвоту 7 мкл каждого глюкана, маркера и STD-кривой IgG-4 повторяютС каждого из них - в соответствии с табличкой ( дополнительный чертеж 1С ). Для лучшей точности загружайте 35 мкл каждого образца и аликвоте 7 мкл в каждую из четырех лунок образца. Поместите оставшиеся 7 мкл каждого гликана обратно в их исходную трубку.
  9. Накройте пластину парафильмом и отпустите на 2 минуты при 250 г и 12 ° C. Поместите пластину при комнатной температуре (RT), защищенной от света. Не открывайте плиту до того, как влажность в помещении достигнет 60-70%.

3. Программирование Nano-принтера

  1. Откройте программное обеспечение «Microarray Manager». Используйте окно «Свойства метода».
  2. Настройте раскладку рабочей таблицы: выберите «56 слайд-конфигурации».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это предопределенная конфигурация, которая позволяет печатать 56 слайдов. Откалибруйте для каждого типа пластин, контактов и формата печати ( дополнительный рисунок 2 , шаг 1).
  3. Выберите «Конфигурация контактов»| «Pin Tool 1x4 9 мм».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это предопределенная конфигурация для использования четырех контактов ( дополнительный рисунок 2 , шаг 2).
  4. Определите тип «Pin». Вычислите и создайте тип штыря, подходящий для печати.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг определяет количество пятен, которые будет печатать штырь, перед повторным погружением в образец 384 скважины и должен быть оптимизирован для разных типов штифтов и химии поверхности скольжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании контактов 946MP3 рассмотрите два важных вопроса: 1) каждый штырь может печатать до 140 однородных пятен и 2) предварительное определение пятен необходимо для слива избыточной жидкости с кончика штифта перед печатью на слайдах. Поэтому запрограммируйте каждый вывод для печати 20 предварительных пятен на блоке предварительной печати (оптимизированный для контактов 946MP3 на слайдах с эпоксидным покрытием).
    1. Рассчитайте общее количество отпечатанных пятен на образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь каждый вывод печатает 4 точки на каждый поддиапазон (блок); В общей сложности 4 суб-массива на слайды = 16 точек / слязь. После 7 слайдов каждый вывод печатает 16 х 7 = 112 точек. Кроме того, 20 предварительных пятен перед печатью дают 132 пятна / провал. Поэтому тип штифта определяется как «946MP3-132 пятна» (4 пятна на образец на блок x 4 блока x 7 слайдов + 20 предустановок = 132).
    2. Создайте «Тип контакта» ( дополнительный рисунок 2 , шаг 3). Нажмите «Настройка» (левая панель программного обеспечения) | «Микропленки» | «Новое имя» (946MP3-132 точек). Определите количество пятен на провал (132), диаметр пятна (100 мкм), поглощение (0,25 мкл), доставку (0,7 нЛ) и минимальное расстояние между пятнами (100 мкм). Нажмите «ОК» | "ОК."
    3. В окне «Свойства метода» выберите созданный тип вывода: «946MP3-132 точки».
  5. Определите условия стирки. Установите «Wash before start» и «Wash after Finishing» на «Normal wash» ( Дополнительный рисунок 2 , шаг 4).
  6. Определите «Список пластин».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это образец выборки из пластины (порядок провалов из 384-луночного планшета) в соответствии с планировкой пластины. Чтобы загрузить пластину в список пластин, настройте шаблон выборки пластин.
    1. Создайте планку «Выборка». Перейдите в раздел «Шаблоны» ( дополнительный рисунок 3 ) | «Шаблоны выборки». Дайте новое имя ( например, массив JoVE) и выберите «Вставить» | «Заполнить верхнюю часть» | «Pin Tool 1 x4 9 мм». Выберите порядок отбора скважин в соответствии с заранее определенной табличкой ( дополнительный рисунок 1A ). Нажмите «ОК» | "ОК."
    2. Загрузите образец пробоотборной пластины. Нажмите правую сторону ячейки «Список пластин» ( дополнительный рисунок 3 ) | «Добавить пластину» и выберите правильный шаблон выборки планшета («массив JoVE», описанный в шаге 3.6.1.). Выберите «Обычная стирка». Нажмите«ОК» | "ОК."
  7. Перейдите к «Sample Plates» и измените смещение позиции на 1 (что определяет, где находится пластина на палубе решетки).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Положение смещения 0 ближе к ванне с ультразвуком.
  8. Определите «Microarray Print Design». Вычислите расстояния между блоками и интервалы.
    1. Рассмотрим размеры проявляющего инструмента, который делит слайд на 16 ячеек 7 x 7 мм, с 2-миллиметровыми промежутками между субмассивами (всего 9 мм между блоками, дополнительный рисунок 4 ).
    2. Рассмотрим размеры подматрицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Расстояние между точками составляет 0,275 мм, а в этом печатном дизайне - 12 колонн и 18 рядов; Общие размеры: ширина (11 x 0.275 мм = 3.025 мм) и высота (17 x 0.275 мм = 4.675 мм). Вычислите горизонтальное расстояние: 9 мм - (11 0,275) = 5,97 мм. Вычислите вертикальный интервал: 9 мм - (17 x 0,275) = 4,325 мм. Вычислить dС левой стороны ползуна: 4,43 мм + 1,07 мм = 5,5 мм. Вычислите расстояние от верхней стороны слайда: 2,95 мм + 0,55 мм = 3,5 мм ( дополнительный рисунок 4 ).
    3. Определите «Print Designs» ( Дополнительный рисунок 5 ). Выберите «Шаблоны» | «Печатные проекты» | «Новый».
      1. Выберите «Настройка контактов» | «Pin Tool 1 x 4 9 mm» | «Pin - 946MP3-132 пятна». На вкладке «Общие» измените «Имя печати микрочипа» ( т. Е. «Массив JoVE»). Выберите «Spot Speed» | «Повторить номер» (4) | «Высота сенсорной точки» (0 мм) | «Высота мягкого касания» (3 мм) | «Печать на все доступные позиции» ( дополнительная диаграмма 5A ).
      2. На вкладке «Microarray» выберите горизонтальное и вертикальное расстояние (5,9 мм и 4,325 мм от шага 3.8.2) и количество горизонтальных и вертикальных микрочипов (2). Выберите «Печать»Microarray Horizontally "|" Print Duplicate Microarray "( Дополнительный рисунок 5B ).
      3. На вкладке sub-array выберите максимальное количество столбцов (12), максимальное количество строк (18) и расстояние между столбцами и строками (275 мкм) ( дополнительный рисунок 5C ).
      4. На вкладке измерений выберите расстояние от левой стороны слайда (5,5 мм), расстояние от верхней части слайда (3,5 мм, рассчитанное на шаге 3.8.2), ширину слайда для печати (25 мм) , И высоту печатного слайда (75 мм) ( дополнительный рисунок 5D ). Нажмите «ОК» | "ОК."
  9. Нажмите правую сторону ячейки «Microarray Print Designs» и выберите определенный дизайн («массив JoVE» с шага 3.8.3, дополнительный рисунок 6 ).
  10. Определите «Количество слайдов» (56) и измените «Смещение позиции» (0). Это определяетДля первого печатного листа, который будет напечатан на палубе решетки ( дополнительный рисунок 6 ).
  11. Определите «Предпечатный дизайн Microarray» ( Дополнительный рисунок 6 ). Выберите «Стеклянный блок» | «Предварительная печать 1 x 4 мм контактного инструмента».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эта настройка расстояния между точками позволяет 46,464 предустановок (для всех 4 контактов) на стеклянном блоке, таким образом, 46,464 / 4 = 11,616 предварительных пятен на штырь. Когда пространство в блоке предварительной печати было исчерпано, принтер остановится, и блок нужно будет перевернуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы вычислить, сколько выборок заполняет блок предварительной печати, рассмотрите следующее: каждый образец будет сделан 8-ти пин-провалами в 384-луночном планшете для завершения 56 слайдов (7 слайдов на провал), и каждый провал Имеет дополнительные 20 предварительных пятен, что дает в общей сложности 160 предварительных пятен на образец. Поэтому 11 616/160 = 72,6 образцов. Таким образом, перед печатью необходимо будет перевернуть блок предварительного прессования стекла, чтобы оценить время листания, измерить hТребуется, чтобы один образец завершил полный запуск на 56 слайдах, а затем умножился на 72).
  12. Выберите «Использовать PrePrint Design» | «Да» | «Сканирование штрих-кодов» (нет) | «Печать одиночного реплицирования» (Нет) ( дополнительная диаграмма 6 ).
  13. Нажмите «Подтвердить» ( дополнительный рисунок 6 ).
  14. Нажмите «Сохранить» и сохраните этот метод в качестве файла arr ( например, «JoVE array.arr», дополнительный рисунок 6 ).

4. Печать готовых массивов

ПРИМЕЧАНИЕ. Все шаги должны выполняться в чистой комнате с влажностью 60-70% и с соответствующими перчатками и одеждой для защиты

  1. Включите устройство для нанесения наносителя и увлажнитель.
  2. Для промывочного буфера и увлажнения заполните водой DI. Опорожните бутылку для стирки (слив) и увлажнитель увлажнителя ( дополнительный рисунок 7A ).
  3. Установите увлажнительВлажность 70% и начало увлажнения.
  4. Перед печатью очистите все контакты. Подготовьте 50 мл горячего (65 ° C) чистящего раствора для пин-концов (15 г чистящего реагента для пин-концов и 50 мл воды 65 ° C, тщательно перемешайте до полного растворения твердого реагента).
    1. Нанесите очищающий раствор на каждый наконечник кончика, опустив щетку (тонкую) штифтового наконечника в раствор для чистки наконечников и чистив поверхность каждого наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Очищающий раствор с контактным наконечником является коррозионным и токсичным. При использовании этого решения всегда надевайте перчатки и защитные очки. Замачивание штифтов в чистящем растворе пин-кончика в течение более нескольких минут может привести к постоянному повреждению штифта.
    2. Заполните ультразвуковую ванну 1 л дистиллированной воды и поместите штифты в стойку для чистки поплавкового штифта в ванне. Сонатируйте в течение 5 минут и удалите штифты. Дайте высохнуть и аккуратно протрите специальными салфетками для чистых помещений.
  5. Откройте печать «Microarray Manager»Er программное обеспечение; После подключения индикатор питания загорится (красный / зеленый). Нажмите «Стоп» | «Очистить» | «Init» ( дополнительный рисунок 7B , шаги 1-3); Затем головка печатной головки перезагружает установки X, Y, Z.
  6. Чтобы загрузить контакты в печатающую головку, нажмите «Загрузить» ( Дополнительный рисунок 7B , шаг 4) и поместите контакты в печатающей головке в соответствии с определенной конфигурацией макета инструмента для печати / вывода ( дополнительный рисунок 7C ); Этот макет использует 4 контакта, каждый из которых печатает 4 подмассивы на каждом слайде, чтобы получить в общей сложности 16 подмассивов на слайд ( дополнительный рисунок 1A ). Поместив контакты, снова нажмите «Init».
  7. Соберите слайды на колодере массива. Откройте коробку слайдов и очистите каждый предмет слайда, продувая газ из сверхчистого азота. Поместите желаемое количество слайдов на платформу массива. Держите слайды двумя пальцами в нижних углах, а затем поместите слайд в свойдолжность. Удерживайте два правых угла и осторожно нажмите левые углы, пока ползун не войдет в свое положение. Аккуратно вставьте левый нижний угол, чтобы обеспечить плотную подгонку ( дополнительный рисунок 7D ).
  8. Очистите предварительно блочное стекло дистиллированной водой, 70% этанолом и 100% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе (используйте только специальные чистящие салфетки). Поместите предварительное стекло в свое положение на палубе.
  9. Заполните ванну с ультразвуком ( дополнительная фигура 7B ). Нажмите «Заполнить» в течение 55 секунд, затем нажмите «OK». Слейте звуковой сигнал, нажав «Drain» в течение 20 секунд, а затем нажмите «OK». Повторите заполнение и слив еще раз, а затем снова заполните его в течение 55 секунд.
  10. Наполните ванну для стирки ( дополнительный рисунок 7B ): нажмите «Prime» в течение 40 секунд, а затем нажмите «OK».
  11. Поместите 384-луночный планшет с аликвотными образцами в его расположение на палубе решетки и снимите крышку парафильма.
  12. Начните печать.
  13. Когда печать завершена, слейте сушильную ванну ( дополнительный рисунок 7B ) и выключите увлажнитель.
  14. Позвольте слайдам высохнуть на палубе решетки в течение 16-24 часов без увлажнения.
  15. Количество слайдов с маркером для маркировки спиртом / растворителем и хранить их в защищенной от вакуума коробке в темноте.

5. Обработка и разработка массивов

  1. Выньте слайд из вакуумно-герметичной коробки и поместите его в химический колпак в течение 5 минут, массив вверх, чтобы испарить избыток жидкости.
  2. Сканирование слайда с наивысшим коэффициентом усиления (950 PMT) для обеспечения печати всех пятен.
  3. Продолжить химическую блокировку эпоксидных групп на слайде
    1. Подготовьте 50 мл этаноламина, блокирующего раствор (0,1 М Трис-HCl, pH 8 и 0,05 М этаноламин). Смешать 140 мл ДИВ с 8,8 мл Трис-HCl (1,7 М, pH 8) и 0,45 мл этаноламина (16,6 М). Передача на 50-мл окрашивающей трубки ( фиг. 8А ) и нагревают до 50 ° С.
    2. Гидратируйте слайд. Поместите слайд в окрашивающую трубку, заполненную DIW, накройте ее фольгой и инкубируйте в течение 5 минут с медленным и нежным встряхиванием при комнатной температуре.
    3. Заблокируйте реактивные эпоксидные группы на слайде. Окуните слайд в 50-миллилитровую окрашивающую трубку, заполненную предварительно нагретым этаноламиновым блокирующим раствором, накройте фольгой и инкубируйте в течение 30 минут с медленным и осторожным встряхиванием при комнатной температуре.
    4. Отбросьте раствор, блокирующий этаноламин, в подходящую емкость для хранения биологических отходов и поместите слайд в новую, чистую окрашивающую трубку, наполненную 50 ° C DIW. Накрыть фольгой и инкубировать в течение 10 минут с медленным и нежным встряхиванием при комнатной температуре.
    5. Откажитесь от воды и переместите слайды на держатель для окрашивания стекла ( см. Рис. 8B ). Поместите держатель для окрашивания стекла в держатель поворотного планшета и центрифугу высушите слайд в течение 5 минут при 200 xg и RT.
  4. Настройте разделитель и продолжайте биологическую блокировку.
    1. Поместите слайд на 16-луночный разделитель ( дополнительный рисунок 8C ).
    2. Подготовьте раствор для промывки PBST: 50 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
    3. Подготовьте биологический блокирующий раствор (PBS-OVA): 5 мл PBS, pH 7,4 + 1% овальбумина курицы (10 мг / мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор блокирующего реагента имеет решающее значение для успеха обнаружения антител против Neu5Gc. Овальбумин производится у цыплят, которые, как и люди, не могут синтезировать Neu5Gc, вызывая отсутствие выраженности этой Sia. Для обнаружения Neu5Gc даже незначительные загрязняющие вещества могут значительно снизить чувствительность анализа, иногда даже не обнаруживая никакой реактивности против Neu5Gc. Например, наиболее часто используемый блокирующий реагент, бычий сывороточный альбумин (BSA), хотя сам по себе не гликозилированный, содержит бычьи IgG-примеси, которые несут Neu5Gc-фрагменты и, следовательно, конкурируют сС напечатанными гликанами при связывании с образцом с антителами против Neu5Gc 19 , 20 .
    4. Подготовьте колодцы. Используя мультипипетку, выделите 200 мкл PBST в слайд-лунки, поместите их в закрытую влажную камеру и встряхните в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Камера для влажности представляет собой стеклянный лоток с влажной бумагой для полотенец, покрытый нейлоновой пленкой и фольгой для защиты образцов от света.
    5. Удалите PBST, щелкнув и аккуратно постукивая по чистому бумажному полотенцу и аликвотируйте 200 мкл буфера для блокирования PBS-OVA в каждую лунку. Поместите во влажную камеру и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре с осторожным встряхиванием.
  5. Подготовьте первичное обнаружение, разведенное в буфер блокировки PBS-OVA, как указано в таблице 2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для оценки контроля качества этого сиалогликанного микрочипа для контроля качества (КК) используйте несколько связующих белков Sia: Sancucus nigra lectin (SNA), выделенный из коры бузины, ожидается, что Sia &# 945; 26; Ожидается, что Maackia Amurensis Lectin II (MALII) распознает Siaα23; И цыплят-анти-Neu5Gc IgY, как ожидается, распознают все сиалогликаны, содержащие Neu5Gc. Кроме того, используйте различные образцы сыворотки крови для профилирования IgG-ответа против Neu5Gc. Концентрация лектинов / антител / сывороток должна быть откалибрована экспериментально.
  6. Флик сухой буфер PBS-OVA и добавить 200 мкл первичного антитела на лунку (минимальный объем на лунку: 70 мкл), инкубировать во влажной камере в течение 2 часов.
  7. Флик сушат первичное обнаружение и промывают 4 раза PBST (между 3- й и 4- й промывкой, инкубируйте ползун в PBST в течение 5 мин во влажной камере). Мойте один раз PBS.
  8. Подготовьте вторичное антитело в PBS, как указано в таблице 2 .
  9. Флик сушат PBS и добавляют 200 мкл вторичного антитела. Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании.
  10. Флик высушить вторичное антитело и промыть четыре раза PBST (между 3Rd и 4- я промывка, инкубируйте слайд в PBST в течение 5 минут во влажной камере).
  11. Осторожно снимите раму и поместите слайды в 50-миллиметровую пробирку для окрашивания слайдов, заполненную PBS, и встряхните в течение 5 мин.
  12. Заполните две слайд-окрашивающие ванны ( дополнительный рисунок 8D ) с помощью DIW, поместите слайд в держатель слайда и окуните его в ванну. Быстро окунитесь 10 раз, а затем перейдите на вторую ванну и опустите еще 10 раз. Инкубируйте в течение 10 мин при комнатной температуре при встряхивании.
  13. Откажитесь от воды и переместите ползунок на стеклянный держатель для окрашивания ( см. Рис. 8B , дайте ползунку высохнуть на воздухе). Поместите держатель для окрашивания стекла в держатель качающейся пластины и центрифугу высушите слайд в течение 5 минут при 200 г и RT.
  14. Сканируйте слайд, а затем храните его в защищенной от вакуума коробке в темноте.

6. Сканирование массивов и анализ данных

  1. Откройте флюоресцентный слайд-сканер и дайте ему согреться в течение 5 мин. ОткройСканирование и анализ программного обеспечения.
  2. Задайте параметры сканирования ( дополнительный рисунок 9A ): сканирование со скоростью 532 нм и 100% с коэффициентом усиления 350 PMT с одной строкой и фокусным расстоянием 0 мкм. Используйте разрешение пикселей размером 10,0 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры сканирования можно настроить на различные типы слайдов, флуоресценцию и разрешение.
  3. Сканирование разработанного слайда. Откройте дверцу сканера и поместите слайд внутрь, массив вниз. Начать сканирование (зеленая кнопка «Воспроизвести» в меню навигационной панели программного обеспечения, Дополнительный рисунок 9B ).
  4. Сохраните сканированные слайды в виде файла tiff.
  5. Подготовьте слайд для анализа. Выберите «Загрузить список массива» и загрузите соответствующий файл GAL, который отображает массивы в каждом блоке на слайде ( дополнительный рисунок 9C ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Файл GAL содержит информацию об идентичности и местоположении (X, Y) каждого пятна на слайде. Этот файл может быть созданС помощью программного обеспечения принтера, экспортирующего текстовый файл с разделителями табуляции, основанный на идентификаторах образцов в 384-луночном исходном планшете и определенном дизайне печати.
  6. Задайте параметры выравнивания и анализа. Нажмите кнопку «Option» в меню панели навигации программного обеспечения ( см. Рис. 10 ).
  7. Определите параметры выравнивания. Найдите круговые функции, измените размеры объектов во время выравнивания на 50 - 350%, переместите движение максимума на максимальный сдвиг на 40 мкм, unflag-функции, которые не вызывают фонового порога (порог ИПЦ 0), оценивают обертывание и вращение при поиске блоков и автоматизируют регистрацию изображений (10 пикселей) ( дополнительный рисунок 10 ).
  8. Определите параметры анализа: отношение W1 / 532, нормальное стандартное отклонение, анализ отсутствующих признаков и вычитание фона. Нажмите «Выбрать», а затем «Локальная функция фонового медиана» и установите 2 пикселя для исключения и 3-пиксельную ширину фона. Нажмите «ОК». SeT уровень насыщенности сканера по умолчанию ( дополнительный рисунок 10 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Метод вычитания фона зависит от экспериментальной конструкции и может быть изменен в соответствии с конкретными потребностями.
  9. Совместите карты функций. Установите программу в режим блокировки (нажмите «B»), выберите все блоки (Ctrl + A), расположите решетки карт массива и выровняйте все блоки (Alt + Shift + F7) ( дополнительный рисунок 11 ).
  10. Уточните выравнивание функции в каждом блоке. Zoom (нажмите «Z», чтобы перейти в режим масштабирования) в верхний левый блок, снова нажмите «B» (режим блокировки) и нажмите сетку этого блока. Перемещайте сетку этого блока только до тех пор, пока он не будет идеально совмещен с пятнами блока и нажмите F5, чтобы выровнять объекты в этом выбранном блоке. Повторите движение сетки и выравнивание F5 до тех пор, пока пятна не будут полностью окружены. Сделайте то же самое для каждого из 16 блоков до тех пор, пока все сетки не будут установлены.
  11. Анализ и сохранение данных. Выберите все блоки (Crtl +A), а затем проанализировать данные (Alt + A). Сохраните результаты анализа (Ctrl + U) в виде файла .gpr.
  12. Откройте сохраненный файл .gpr в программе электронных таблиц и проанализируйте интенсивность каждого пятна на основе флуоресценции после локального вычитания фона (F532-B532).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Матричная печать, разработка и анализ:

Печать микроматрицы sialoglycan с несколькими образцами гликанов и кривыми STD человека IgG в 16 различных блоках требует тщательной калибровки, чтобы гарантировать, что все образцы будут напечатаны как можно более равномерно во всех 16 блоках на слайде и на всех слайдах в том же тираже. Поэтому перед определением конкретных параметров печати требуются многочисленные калибровочные эксперимен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное изготовление микрочипов из гликана требует тщательного планирования и включает несколько важных шагов в протоколе. К ним относятся: (1) планирование макетов блоков и таблиц, которые определяют все последующие параметры ( например, расстояния, расстояние, количество выборок и печать); (2) очистка штифтов и обеспечение целостности штифта, что имеет решающее значение для контроля однородности пятна; (3) поддержание высокой влажности во время печати, что крайне важно для предотвращения испарения образца во...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана премией за исследования в области развития карьеры в Израиле от Фонда исследований рака Израиля, грантом от израильской национальной инициативы по нанотехнологиям и благотворительным фондом Хелмсли в области фокусных технологий на наномицинах для персонализированных терапевтических средств (VP-K) и национальной Институты здравоохранения грант R01GM076360 (до XC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Первичный амин-содержащий сиалогликаныGlycohub, Inc., Davis, CA, США (http://www.glycohub.com/services)Свяжитесь info@glycohubusa.com для запросов на соединениеПечатные гликаны
Моногидрат фосфатанатрия SigmaS9638Компонент буфера
для печати Динатрийфосфат гептагидратSigmaS9390Компонент буфера для печати
Фосфат буферный физиологический растворHy-LabsBP-507/500DБуфер для печати/инкубации/промывки
Трис-основаниеSigmaT1503Реагент блокировки слайдов
ГлицеринSigmaG-7893Компонент буфера печати
ЭтаноламинThermo-Fisher Scientific0700/08Реактив блокировки слайдов
Овальбумин (Grade V)SigmaA5503Белок-блокировщик слайдов
Tween-20SigmaP7949Средство для стирки
слайдов Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPМаркер на матрице
ChromPure Human IgG, целая молекулаJackson Immunoresearch009-000-003Печатный компонент
Биотинилированный SNAVector LaboratoriesB-1305Растительный лектин – связывание Sia-alpha2– 6-связанный
биотинилированный MALIIVector LaboratoriesB-1265растительный лектин – связывающий Sia-alpha2– 3-сцепленный
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903первичное обнаружение
Cy3-стрептавидинJackson Immunoresearch016-160-0848Биотинсвязывающий
Cy3-анти IgG человекаJackson Immunoresearch109-165-088Вторичное обнаружение против человеческого IgG
Cy3-анти курицы IgYJackson Immunoresearch703-165-155Вторичный обнаружение против курицы IgY
Образцы сыворотки человекаИзраильский банкПервичное обнаружение
Сжатый азот (класс 5)Общий инструмент для опыления/сушки
Предметные стекла с эпоксидным покрытиемCorning40044Слайды Предметные
стекла с эпоксидным покрытиемPolyAn2D 104-00-221Слайды. В этом типе слайдов поверхность более гидрофобна (по сравнению с предметными стеклами с керном), поэтому в буфер для печати гликанов необходимо добавить 0,005% Tween-20 для получения 100 & микро; m размера пятен.
384-луночная микротитровальная пластинаGenetix2070Печатная форма
VWR лабораторный маркерVWR52877-310Маркировка слайдов
Окрашивание трубкиArrayItMSTИнструмент для проявки слайдов
Ванночка для окрашиванияVWR25608-904Инструмент для проявки
слайдов Слайды держатели для стеклаVWR631-9321Инструмент
для проявки слайдовСканер GenePixМолекулярные устройства4000BСканер слайдов
LM-60 НанопринтерArrayItLM-60Массив принтера
Контакты ArrayIt946MP3Печатные штифты
ProPlate Модуль GraceBio-LabsP37004Модуль проявки слайдов
Дистиллированная водаBio-Lab2321020500Требуется для массива и увлажнителя
Электронный Multi Pippete, 8 каналов, диапазон громкости 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pippete для распыления образца в 384-луночный планшет
крови LM-60

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
  2. Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
  3. Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
  4. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  5. Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
  6. Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
  7. Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
  8. Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
  9. Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
  10. Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
  11. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
  12. Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
  13. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  14. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
  15. Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
  16. Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
  17. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
  18. Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
  19. Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
  20. Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
  21. Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
  22. Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
  23. Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
  24. Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
  25. Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
  26. Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
  27. Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PBST

Похожие статьи