Одной молекулы Магнитные пинцеты платформу для манипулирования G-quadruplexes сообщается, что позволяет для изучения G4 стабильность и регулирование различных белков.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одноместный молекула манипуляции G-quadruplexes, Магнитные пинцеты
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Non канонические нуклеиновой кислоты вторичная структура, которую G-quadruplexes (G4) участвуют в различных клеточных процессах, таких как репликация ДНК, транскрипция, обработки РНК и удлинение теломер. В ходе этих процессов различные белки связывают и разрешить G4 структуры для выполнения их функций. Как функция G4 часто зависит от стабильности ее складчатые структуры, важно исследовать, как белки, связывающие G4 регулировать стабильности G4. Эта работа представляет метод для обработки одной молекулы G4, используя Магнитные пинцеты, который позволяет исследования регулирования G4 связывания белков на одной молекулы G4 в режиме реального времени. В общем этот метод подходит для широкий спектр применений в исследованиях для взаимодействия белков/лигандов и правил на различных вторичных структур ДНК или РНК.
Введение
Четыре мель ДНК или РНК G4 структуры играют решающую роль в многих важных биологических процессов1. Многие белки участвуют в привязке G4 и регулирования, включая белки, связывающие теломер (теломеразы, РПА, TEBPs, Аппл1, TRF2)1,2, факторы транскрипции (nucleolin, PARP1)3, РНК, белков (hnRNP А1, обработки hnRNP A2)4, Хеликазы (BLM, FANCJ, RHAU, предупреждение, Dna2, Pif1)5и репликацию ДНК, связанных белков (Rif1, Rev. 1, PrimPolymerase)6. Связывание с белками может стабилизировать или дестабил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка G4 ДНК для одной молекулы растяжение
- подготовить 5 '-тиоловых помечены и 5 '-биотин, помечены dsDNA ручки методом ПЦР с помощью DDNA полимеразы на шаблоне ДНК фага лямбда, используя 5 '-тиоловых и 5 '-биотин Праймеры 14 ( рис. 1). Обе ручки dsDNA имеют высокое содержание GC (> 60%) для предотвращения ДНК плавления когда ДНК проводится на высокой силы или во время распыления ДНК перехода 15.
- Продукты PCR, очищают с помощью комплекта коммерческой очистки и дайджест с BstXI энзима ограничения по заявлению производителя ' протокол s.
- Перевязать G4 ф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Настройки эксперимента для растяжения одной молекулы G4 показан на рисунке 4. Последовательность формирования G4 одноцепочечной интервале между двумя ручками dsDNA был привязанный между coverslip и парамагнитными шарик. Чтобы найти шарик привязанный единый dsDNA overstretching assay была выполнена путем увеличения силы по ставкам постоянной загрузки. Три вида измерений часто использовались для изучения складывания и раскладывания биомолекул: (i) постоянной си.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Как описано выше, платформу для изучения механическая стабильность G4 ДНК и взаимодействий протеина G4 с помощью одной молекулы Магнитные пинцеты сообщается. Сопроводительных платформа, разработаны высокоэффективные протоколы нахождения G4 ДНК троса и измерение динамики складной разворачивается и стабильность структуры G4 с нанометров специальной резолюции. Фокальной плоскости блокировки позволяет высокостабильных анти дрейф элемент управления, который имеет важное значение для обнаружения небольшой структуры переходного.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы благодарят Meng Pan за корректуру рукопись. Эта работа поддерживается, Сингапур министерства от образования академических исследований Фонд Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) до Д.Ю; Национальный исследовательский фонд через Сингапур Mechanobiology института для Д.Ю; Национальный исследовательский фонд, офис премьер-министра, Сингапур, в рамках своей программы Investigatorship СР (СР № Investigatorship премии СР-NRFI2016-03 для Д.Ю; Фонд фундаментальных исследований университетов Центральной H. Y (2017KFYXJJ153).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ДНК ПЦР праймеры | IDT | препараты ДНК | |
| ДНК ПЦР химикаты | NEB | препараты ДНК | |
| рестрикция BstXI | NEB | R0113S | препараты ДНК |
| покровные стекла (#1,5, 22*32 мм и 20*20 мм) | BMH. BIOMEDIA | 72204 | препарат проточного канала |
| Decon90 | Decon Laboratories Препарат ограниченного | проточного канала | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | препарат проточного канала |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | препарат проточного канала |
| M-280, парамганетические шарики,стрептавидин | ThermoFisher Scientific | 11205D | Подготовка проточного канала |
| Аминомикросферы из полибида 3.00 μ m | Polysciences, Inc | 17145-5 | подготовка проточного канала |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma | M6250-250ML | подготовка проточного |
| канала Olympus Микроскопы IX71 | Olympus | IX71 | Установка магнитного пинцета |
| Piezo-Z Stage P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Установка магнитного пинцета |
| Olympus Объективная линза MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Настройка магнитного пинцета |
| CCD/CMOS камера | AVT | Pike F-032B | Настройка магнитного пинцета |
| Трансляция линейного столика | Physik Instrumente | MoCo DC | Настройка магнитных пинцетов |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Настройка магнитных пинцетов |
| Кубические магниты | Supermagnete | Настройка | |
| магнитных пинцетовLabview | National Instruments | Настройка магнитного пинцета | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Анализ данных |
Ссылки
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
