Методическая статья

Очистка вирусной ДНК для идентификации связанных вирусных и клеточных белков

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

31 августа 2017 г.

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Цель настоящего Протокола заключается в специально тег и выборочно изолировать вирусной ДНК от инфицированных клеток для характеризации вирусного генома связанных белков.

Аннотация

Целью настоящего Протокола является изолировать вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) ДНК от инфицированных клеток для идентификации связанных вирусных и клеточных белков, Массовое спектрометрирование. Хотя белки, которые взаимодействуют с вирусных геномов играют важную роль в определении результатов инфекции, всесторонний анализ вирусного генома связанных белков нецелесообразно ранее. Здесь мы показываем, метод, который позволяет прямое очистки геномов HSV-1 от инфицированных клеток. Репликации вирусных ДНК выборочно помечены модифицированных нуклеотидов, которые содержат алкины функциональной группы. Приклеенные этикетку ДНК затем специально и необратимо маркирован через ковалентных вложение биотина азид через меди (I)-катализатором реакции циклоприсоединения или нажмите азид алкины. Биотин тегами ДНК очищается на стрептавидина покрытием бусины и связанные протеины этого eluted и определены по масс-спектрометрии. Этот метод позволяет избирательного отношения и изоляции HSV-1 репликации вилки или весь геном из сложных биологических сред. Кроме того адаптации этого подхода позволит для расследования различных аспектов герпетический инфекции, а также изучение геномов других ДНК вирусов.

Введение

Вирусы имеют ограниченные возможности для выполнения основных функций и поэтому зависят от факторов хост для облегчения критических аспектов инфекции, включая экспрессии вирусных генов, репликации, ремонт, рекомбинации и транспорта. Деятельность этих факторов хост часто дополнены вирусно закодированные белков. Кроме того вирусы должны избежать обнаружения и вмешательства, клеточных реакций к вирусной инфекции. Таким образом вирус хост взаимодействия диктовать результаты инфекции. Первостепенное значение является понимание того, как вирусы изменяют клеточной среды адаптировать клеточными для облегчения вирусных процессов. Особый интерес является определение, какие факторы и процессы действуют на вирусных геномов инфекционных цикла.

Вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) — двойной многожильный ДНК вируса, который заражает значительную долю населения. В течение первого часа инфекции вирусного генома проникает в ядро, где упорядоченный Каскад экспрессии вирусных генов наступает в координации с вирусной репликации ДНК (vDNA)1. В ядре геномы подлежат эпигеномные регулирование, пройти ремонт и рекомбинации и упакованы в capsids, таким образом, что первый вирионы потомства производятся в течение менее шести часов. Всеобъемлющую оценку вирусного генома связанных белков на протяжении инфекции заложит основу для изучения молекулярных детали процессов, которые действуют на вирусных геномов и даст понимание вирусных и клеточные факторы участвуют в различных стадиях инфекции.

Предыдущие методы расследования принимающей факторов в вирусной инфекции включают очищение сродства вирусных белков для анализа связанных клеточных белков2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. Эти анализы сыграли для выявления клеточных факторов в принимающих противовирусное ответы, а также модификация вирусный хроматина, экспрессии генов, и ремонт ДНК. Однако трудно определить ли взаимодействия зависят от ассоциации с vDNA, и протеомики только обеспечить понимание взаимодействия, которые происходят в зависимости от конкретного вирусного фактор. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был использован для определения, где конкретные вирусных и клеточных белков связывать вирусных геномов10,11,12,13,14 , 15 и флуоресцентной гибридизации in situ (рыбы) в сочетании с immunocytochemistry позволило визуализации клеточных факторов, которые colocalize с vDNA16,,1718, 19 , 20. Эти анализы позволяют для пространственного и временнóго анализа. Однако ограничения включают потребность в весьма специфических антител, ограниченной чувствительности и потребность в предыдущих понимание взаимодействия узла вирус. Поэтому мы разработали метод, основанный на iPOND (изоляция белков на зарождающейся ДНК)21 и22 aniPOND (ускоренное родной iPOND) избирательно этикетки и очистить vDNA от инфицированных клеток для объективной идентификации вирусного генома связанные белки по масс-спектрометрии. iPOND играет важную роль для исследования динамики вилка сотовой репликации.

Для выборочной очистки вирусных геномов от инфицированных клеток тиражирование vDNA помечены ethynyl изменение нуклеозидов, 5-ethynyl-2´ дезоксиуридина (EdU) или 5-ethynyl-2´ Дезоксицитидин (EdC) (рис. 1), следуют ковалентных Спряжение биотина азид через нажмите химии для облегчения очистки одного шага вирусных геномов и связанных белков на четках стрептавидина покрытием (рис. 2B). Важно отметить, что инфекции осуществляется в стационарных клетках, которые не участвуют в клеточном репликации ДНК для включения конкретных маркировки vDNA. Кроме того инфекции HSV-1 вызывает арест клеточного цикла и подавляет клеточной ДНК репликации23,-24. Вирус может быть prelabeled до инфекции для анализа белков, связанные с входящей вирусных геномов (рис. 1A) или помечены в ходе репликации ДНК для анализа белков, связанные с недавно синтезированных vDNA (рис. 1B) 25. Кроме того, пульс Чейз анализ может использоваться для изучения природы белков, связанные с вирусной репликации вилки (рис. 1 c)26. Кроме того изменение ethynyl vDNA можно ковалентно конъюгированных к Флюорофор для пространственного исследования динамики белков (рисунок 2A и рис. 3). Изображений позволяет для прямого визуализации vDNA и представляет собой бесплатный подход для проверки vDNA белковых взаимодействий и может быть адаптирована для отслеживания вирусных геномов течение инфекции. Мы ожидаем, что эти подходы далее может быть изменена для изучения любого аспекта герпетический инфекции, включая задержку и оживление и изучить другие ДНК вирусов. Кроме того маркировки с уридина 5-ethynyl (ЕС) может позволить для анализа РНК вирусных геномов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. культуру клеток, вирусные инфекции и EdC маркировки ( рис. 1)

следующий протокол включает в себя работу с вирусами. Обратитесь к вашим учреждением ' s био безопасности протоколов относительно безопасного обращения вирусов и других биологических агентов. Этот протокол был одобрен институциональных Наблюдательный Совет Университета Питтсбурга.

  1. Trypsinize колбу культуры ткани вырожденная 150 см 2 МРК-5 клеток и передачи клетки к пластине культуры ткани 2 600 см, содержащие 100 мл DMEM плюс 10% FBS. Инкубируйте при 37 ° C в присутствии 5% CO 2 для 3-4 дней, чтобы достичь confluency и стационарной фазы. Вырожденная 600 см блюдо 2 содержит ~ 7 x 10 7 клеток. Подготовка 1 пластина для каждого условия и 1 пластина для каждого соответствующего элемента управления негативные.
    Примечание: Клетки должны достичь стационарной фазы для ингибирования клеточной репликации ДНК обеспечить, что только vDNA помечены и очищенный в последующих шагах.
    Примечание: Каждый образец требует бесплатные без маркировки отрицательного контроля, подготовленных с использованием же инфекции условия и момент времени без добавления EdC.
    Примечание: A сократили версии этого эксперимента должны осуществляться в тандеме, чтобы проверить для маркировки клеточной ДНК, изображений, используя сопоставимые клеточный рост, инфекции, EdC маркировки условия и времени точки (см. шаг 2).
  2. 7 х 10 8 PFU HSV-1 в 7 мл разбавляют холодной Tris-Buffered солевой (TBS). Удалите средство роста и хранить при температуре 37 ° C. Заразить, добавьте 7 мл разбавленной вирус MRC-5 клеток и рок за 1 ч при комнатной температуре. После адсорбции удалите посевным материалом, смойте комнатной температуре 50 мл TBS и заменить оригинальный среднего роста. Инкубируйте при 37 ° C в присутствии 5% CO 2. Этот шаг должен осуществляться для каждой экспериментальной состояния и отрицательного контроля.
    Примечание: Увеличение EdC маркировки можно добиться, используя HSV-1 мутантов дефектных для экспрессии вирусных dUTPase (UL50 ген) и/или урацила glycosylase (UL2 гена). HSV-1 dUTPase имеет низкий субстратная специфичность и может уменьшить активации нескольких Нуклеозидные аналоги 25 ,- 27.
  3. Label вирусных геномов с EdC. Следуйте инструкциям на этикетке входящих геномов (1.3.1.), репликация геномов (1.3.2.), или вирусной репликации вилки (1.3.3.).
    Примечание: Только шаг 1.3.3, 1.3.1 и 1.3.2 должна осуществляться в зависимости от ли входящие геномов, реплицируемых геномов или репликации вилки должны быть проанализированы в последующие шаги, соответственно.
    Примечание: EdU или f Ара EdU можно заменить EdC. Токсичность аналогов нуклеозидов должны контролироваться и свести к минимуму. Prelabeled
    1. использования запасов для выполнения инфекции в 1.2 шаг и перейдите к шагу 2 или 3 в течение 4 ч после инфекции (hpi) расследовать нереплицированные vDNA ( рис. 1A).
      Примечание: Подготовка prelabeled вирус запасов, используя ранее описанные протокол 25. Запасы вирус должен быть передан через столбец G-25 для удаления любых остаточных EdC.
    2. Этикетка репликации vDNA путем добавления 5-25 мкм EdC носитель культуры клеток зараженных клеток для 2-4 ч ( рис. 1B). Перед добавлением, разбавить EdC в 1 мл среднего роста.
    3. Для обозначения вилок вирусной репликации, после начала репликации vDNA (≥ 4 hpi), пульс метка репликации vDNA с 5-25 мкм EdC для 5-20 мин. Погони, 3 x промыть Чейз среде, содержащей 25-100 мкм 2´deoxycytidine (deoxyC) и затем инкубировать присутствии Чейз среднего для дополнительных 20-40 мин ( рис. 1 c).
      Примечание: Пульс и Чейз среднего должно быть достижение равновесного уровня до 37 ° C и 5% CO 2 перед использованием.
      Примечание: Для импульса Чейз экспериментов, важно рассмотреть количество времени, необходимое для нуклеозидов войти в камеру и быть фосфорилированных прежде, чем они могут быть включены в репликации ДНК. Это должно быть определено эпирически.
      Примечание: Чтобы определить резолюции пульс Чейз экспериментов, Рассчитайте уровень вирусной репликации в экспериментальных условиях используется. Это может быть определено путем количественного PCR вирусных геномов в течение одного шага роста времени курс 26.
      Примечание: Для изображений вирусных геномов перейдите к шагу 2 и для очистки вирусных геномов, перейдите к шагу 3.

2. Визуализация EdC помечены ДНК ( рисунок 2A)

Примечание: это полезно для выполнения визуализации в тандеме с методом очистки вирусного генома для проверки, что клеточной ДНК не обозначена в экспериментах. Изображения также может использоваться для визуализации характер помечены vDNA и для проверки данных протеомики. На рисунке 3 показаны примеры сотовой и вирусной ДНК, окрашивание узоры.

  1. Проводят инфекций и EdC маркировки, как указано в шаге 1, за исключением использования сократили условия на coverslips в 12-ну тканевые культуры блюдо, содержащие 1 мл среднего роста.
  2. Исправление клетки с 3,7% 1 мл параформальдегида в однократном ПБС 15 мин на RT. После фиксации, промойте клетки 2 x с 1 мл 3% BSA в PBS.
    Предупреждение: Параформальдегида может привести к серьезным травмам или к постоянным. Выполните меры предосторожности.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и coverslips можно хранить при 4 ° C во время второй стирки на срок до 3 дней.
  3. Разрушения клеток с 1 мл permeabilization буфера [см. Таблицу материалы] 20 мин при комнатной температуре во время раскачивания.
  4. Промыть с 1 мл раствора БСА 3%, а затем блок с 1 мл 3% BSA в PBS на 30 минут при комнатной температуре во время раскачивания.
  5. Добавить 1 мл коктейль реакции нажмите [см. Таблицу материалы] coverslips ковалентно конъюгат Alexa Fluor 488 азид для EdC пометил ДНК. Инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин при качания. Аспирационная и промыть два раза с 1 мл раствора PBS.
  6. Пятно клеточной ДНК с 1 мл раствора стоматологов разрежения Hoechst в PBS на 30 минут при комнатной температуре во время раскачивания. Аспирационная и промыть два раза с 1 мл раствора PBS.
  7. Пятно с первичных и вторичных антител согласно стандарту непрямой иммунофлюоресценции протоколы 25.
    Примечание: Помечены vDNA colocalizes с ICP8, ICP4 или UL42 и помечены клеточной ДНК colocalizes с Hoechst пятно.
  8. Горы coverslips на слайды и изображения клетки под микроскопом флуоресцирования.
    Примечание: При температуре 4 ° C в течение нескольких недель можно хранить слайды.

3. Очистка vDNA и связанных белков

Примечание: некоторые аспекты этого протокола были адаптированы из Лэн et al. 22
Примечание: все буферы и реагенты должны быть охлажденным на льду перед использованием и все шаги должны осуществляться на льду если не указано иное.

  1. Урожай ядер.
    Примечание: Перед изоляции ядер, формальдегид может использоваться чтобы crosslink белки ДНК. Более жесткие условия стирки может затем использоваться во время очистки ДНК на стрептавидина покрытием бусины. Для crosslinking и стирка условий см Сырбу и др. 21.
    1. заменить среднего роста с 20 мл буферной ядер (нос) и проинкубируйте втечение 20 мин при 4 ° C с иногда тряся. Ядер станет видимым в микроскопе.
    2. Скрип ядра от пластину с помощью скребка клетки и передать 50 мл Конические трубки. Центрифуги для 10 мин на 2500 x g при 4 ° C до Пелле ядер, удалить супернатант.
      Примечание: Трипановый синий пятнать может использоваться для проверки изоляции ядра от клеток.
    3. Аккуратно выбить ядерной гранулы в 10 мл PBS, передача 15 мл Конические трубки и Пелле центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить PBS.
      Примечание: Ядра могут быть заморожены и протокол может быть приостановлена на данный момент. Чтобы сделать это, нежно ресуспензируйте ядерной Пелле в 500 мкл замораживания буфера и инкубировать трубки в ванне этанола/сухого льда. Хранить замороженные ядер при температуре-80 ° C. Перед использованием оттепель ядер при комнатной температуре, быстро передать льда, добавляют 10 мл PBS, рок мягко смешать, Пелле центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C и полностью удалить PBS. Замораживание ядра может привести к сокращению урожайности.
  2. Ковалентно конъюгата биотин азид для EdC помечены vDNA.
    1. Ресуспензируйте ядерной гранулы в 10 мл нажмите реакции mix [см. Таблицу материалы] нежно закупорить вверх и вниз 5 раз с 10 мл накапайте.
      Примечание: Важно, что реагенты, включенные в смеси реакции нажмите добавляются в указанном порядке.
    2. Вращаться в течение 1 ч при 4 ° C. При вращении подготовить и холод буферы B1, B2 и B3 [см. Таблицу материалов].
    3. Пелле ядер центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить нажмите реакция смеси и помыть лепешка осторожно resuspending в 10 мл PBS и центрифугирование 10 мин на 2500 x g на 4 ° C.
    4. Нежно ресуспензируйте ядерной Пелле в 1 мл PBS и передачи с помощью кончика пипетки большой диаметр трубки отцентрифугировать 1,5 мл. Пелле ядер центрифугированием 10 мин на 2500 x g при 4 ° C. полностью удалить PBS и флэш-замораживание в жидком азоте.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и замороженных ядер может храниться на-80 ° C. Замораживание оттепель помогает с последующим лизиса, поэтому рекомендуется, что ядра быть заморожен даже тогда, когда мы перейдем к шагу 3.3 в тот же день.
  3. Лизируют ядер и фрагмент ДНК.
    1. Оттепель ядер на льду и Ресуспензируйте в 500 мкл буфера B1, закупорить вверх и вниз. Инкубируйте на льду для 45 мин
    2. Sonicate образцы 6 раз за 30 s каждый на 40% амплитуды с помощью зонда microtip 3 мм. Поместите образцы на льду для 30 s между импульсами. После sonication, образцы должны появиться четкие, не ясно.
      Примечание: Sonication условия должны быть оптимизированы для отдельных sonicators. Подробные инструкции о том, как оптимизировать sonication условия относятся к Леунг и др. 22.
    3. Пелле мусора клетки центрифугированием в 14.000 x g 10 мин при 4 ° C. Следует значительно уменьшить размер гранул. Через 100 мкм ячейки фильтра фильтр супернатант и сохранить поток через.
    4. Добавить 500 мкл буфера B2 для отфильтрованных супернатант. 900 мкл в этом примере будет использоваться на шаге 3.4.2.
    5. Взять Алиготе каждого условия для изоляции ДНК (50 мкл или объем 1/20) и добавьте 50 мкл 2 x SDS-bicarb решение [см. Таблицу материалов]. Перейти к Протокол изоляции ДНК (шаг 3,6).
    6. Взять Алиготе каждого условия для ввода белка (50 мкл или объем 1/20) и добавьте 50 мкл 2 x буфер Лэмли образца, замораживание в жидком азоте и хранить на -80 ° C. использование в шаге 3.5.6.
  4. Биотинилированным ДНК bind для стрептавидина покрытием бусины.
    1. Подготовить стрептавидина T1 магнитные бусы путем передачи 300 мкл суспензии из бисера 1,5 мл отцентрифугировать. Подготовка одной трубы бусы на сэмпл. Мыть бисер 3 x с 1 мл буфера B2, vortexing Ресуспензируйте, применяя магнитом отделить бисер и аспирационных мыть буфера.
      Примечание: Оптимизированный обязательного условия приводят к максимальной урожайности и минимальным фон привязки. Экспериментально было установлено, что стрептавидина T1 магнитной бусины имеют значительно больше возможности привязки агарозы бусин, а также другие стрептавидина бусы и меньше фон привязки чем стрептавидина C1 бисер ( Рисунок 4A ).
    2. Добавить 900 мкл пример из шага 3.3.4. промывают бисером и поворот на ночь на 4 ° C.
      Примечание: Сделать не вихревой бусы после того, как образец добавляется к им.
      Примечание: Если значительное количество ДНК или белка изолированы в неподписанном отрицательный контроль, этот шаг может быть сокращено с ночи до 4 ч. для уменьшения фона привязка.
  5. Мыть бусины и элюировать связанных белков и vDNA.
    Примечание: Рекомендуется использовать фильтр советы для оставшихся шагов.
    1. Место образцы в стойку трубки магнитного отцентрифугировать, удалить супернатант, нежно ресуспензируйте в 1 мл буфера B2, поворот на 4 ° C за 5 мин.
    2. Три раза повторить шаг 3.5.1.
    3. Поместите образцы в стойку трубки магнитного отцентрифугировать, удалить супернатант, нежно ресуспензируйте в 1 мл буфера B3 и повернуть на 4 ° C за 5 мин
    4. Передачи 100 мкл шарик смесь (1/10 й объем) к новой трубки для привязанных изоляции ДНК. Применить эту трубку к магниту, удалить супернатант, Ресуспензируйте бусины в 100 мкл 1 x SDS-bicarb решение и приступить к Протокол изоляции ДНК (шаг 3,6).
    5. Применить трубка, содержащая оставшиеся 900 мкл шарик смесь из шага 3.5.3. к магниту, удалить супернатант и Ресуспензируйте бусины в 50 мкл 2 x буфер Лэмли образца для элюировать белков и ДНК белковых комплексов.
    6. Образцы кипения на 95 ° C в течение 15 мин, вихря, быстро вращаться в отцентрифугировать и применять магнит. Передача элюата новой трубки, вспышки заморозить и хранить на -80 ° C.
      Примечание: Использование колпачок блокировки для обеспечения, что трубы не поп открыть при кипячении.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент и образцы можно хранить при температуре-80 ° C в течение нескольких недель.
    7. Анализ образцы протеина Кумасси синим окрашивание, Западный blotting или масс-спектрометрии, стандартные процедуры 25. Представитель результаты показаны на рисунке 4 и Рисунок 5.
      Примечание: Для определения, является ли достаточным для масс-спектрометрии белков урожайность, 7,5 мкл каждого образца используется для анализа Кумасси синим окрашивание и 7,5 мкл для западный blotting представитель вирусного генома связанные белком (ICP4, ICP8 или UL42). Такой же объем лизатов из шага 3.3.6. запускаются вместе с для контроля уровня входного белка. Оставшиеся выборки (35 мкл) затем анализируется по массе спектрометрии, как описано ранее 25.
  6. Изоляции ДНК
    1. Проинкубируйте образцы из шагов 3.3.5. и 3.5.4. при 65 ° C для 4-16 h. удалить выборки из магнитных шариков, в случае необходимости.
    2. Извлекать образцы с 150 мкл рабочего раствора фенола: хлороформ: изоамилового спирта (PCI) и передачи водной фазе к новой пробке.
    3. Извлечение оставшихся PCI с 100 мкл трис-ЭДТА (TE) и добавить водяной участок к новой пробке.
    4. Экстракт образцы с 200 мкл хлороформ: изоамиловый спирт (24:1).
    5. Очистки водной фазе, используя комплект для очистки ПЦР по заявлению производителя ' протокол s.
      Примечание: Индикатор пэ-аша в буфер PB будет становятся пурпурными при добавлении к образцу. Добавить 10 & #181; L 3M NaOAc рН 5,0 для снижения pH образца.
    6. Концентрация определить ДНК с помощью флуориметр.
      Примечание: Этот протокол обычно дает 100-400 нг шарик прыгните ДНК. ДНК не должно быть обнаружено в элюата отрицательного контроля, в котором EdC не была добавлена в шаге 1.3.
    7. ДНК может храниться в привязке низкой ДНК трубки на 4 или - 20 ° C и может использоваться для ПЦР в реальном времени или высокой пропускной способностью последовательности анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Использование нажмите химии для очистки дна от клеток проводилась впервые метод iPOND21. IPOND предназначен для очистки сотовой репликации вилки для идентификации связанных белков. Мы адаптировали этот метод специально изучать взаимодействия протеина vDNA во время инфекции. Манипуляция подхода к этикетке вирусных геномов с EdC (рис. 1), в сочетании с синхронизированной инфекций, позволило для селективного изоляции и расследования отдел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол включает в себя несколько шагов, которые, если не соблюдены тщательно, может привести к значительно более белка урожая или загрязнения с клеточной ДНК. Важно, что стационарные клетки используются для всех экспериментов для обеспечения не помечены и очищенного клеточной ДНК. Это может быть подтверждено отсутствие клеточной ДНК полимеразы в образец протеина потому что HSV-1 не используют для синтеза генома клеточной ДНК-полимеразы. Во время EdC маркировки и ядер, уборка шаги образцы следует поэтапно обеспечит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы признаем Ханна Fox за помощь в подготовке этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант R01AI030612.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MRC-5 клеткиATCCCCL-171
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Gibco26140-179
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082Замещена 10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 12 mM  (для выращивания в колбах) или 30 мМ (для выращивания в чашках) бикарбинат натрия
600 см<суп>2 чашка для культуры тканейThermo Fisher Scientific166508
Трис Буферизованный физиологический раствор (TBS), pH 7,4137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 491 мМ MgCl, 680 мМ CaCl, 25,1 мМ Трицин
HSV-1 стоковыйзапас с титрами более 1x109 PFU/мл лучше всего подходит
Сефадекс G-25  колонка (PD-10 Колонна для обессоливания )GE Healthcare17085101
Диметилсульфоксид (ДМСО)Fisher ScientificD128-1
5-этинил-2´-дезоксицитидин (EdC)Sigma-AldrichT511307растворить в ДМСО для получения 40 мМ бульона, аликвоты, и хранить при -20 °°; С 
2-дезоксицитидин (дезоксиC)Sigma-AldrichD3897Растворить в воде для приготовления 40 мМ бульона, аликвоты, и хранить при -20°С; С 
Ядерный экстракционный буфер (NEB)Приготовьте свежий (20 мМ Hepes pH 7,2, 50 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 300 мМ сахарозы, 0,5% Igepal)
Скребок для клетокBellco glass7731-22000Autoclave перед использованием
раствор трипанового синегоSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7,2 (10x)1,37 М NaCl, 27 мМ KCl, 100 мМ Na2HPO4, 18 мМ KH2PO4 (развести до 1x в стерильной воде перед использованием)
Пентагидрат сульфата меди (II) (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489Приготовьте 100 мМ бульон и храните при температуре 4° C на срок до 1 месяца
(+) L-аскорбат натрияSigma-AldrichA4034Свежий 100 мМ бульон и хранить на льду до использования
биотина азидИнвитрогенB10184Приготовьте 10 мМ бульон в ДМСО, аликвоте и храните при -20 °°; C на срок до 1 года 
Нажмите Reaction MixГотовьте непосредственно перед использованием, добавляя реагенты в указанном порядке (10 мл: 8,8 мл 1x PBS, 200 мл 100 мМ CuSO4, 25 мл 10 мМ биотина азида, 1 мл 100 мМ аскорбата натрия)   
Полный коктейль ингибиторов протеазыRoche11697498001растворить в 1 мл воды для приготовления 50-кратного бульона, можно хранить при температуре 4 и ниже; C в течение 1 недели или сразу добавьте 1 таблетку в буфер объемом 50 мл
для заморозкиПриготовьте свежий (7 мл 100% глицерина, 3 мл NEB, 200 мл; L 50x ингибитор протеазы)
Буфер B1Готовить свежим (25 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-HCl pH 8, 1% Игепал, 1х ингибитор протеазы)
Буфер В2Готовить свежим (150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-HCl pH 8, 0,5% Игепал, 1х ингибитор протеазы)
Буфер В3Готовить свежим (150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ Трис-HCl pH 8, 1x ингибитор протеазы)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer с 3 мм зондом с микронаконечникомSonicsVCX 130
Cell sitherFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Мини-трубка RotatorFisher Scientific260750F
2x Laemmli пробный буферСмешайте 400 мг SDS, 2 мл 100% глицерина, 1,25 мл 1 M Tris (pH 6,8) и 10 мг бромфенола синего в 8 мл воды. Магазин в 4  ° C на срок до 6 месяцев. Перед применением добавьте 1 М DTT до конечной концентрации 200 мМ.
Колпачковые замки для пробирки объемом 1,5 млFisher ScientificNC9679153
Стандартные вестерн-блоттинговые реактивы
NOVEX Colloidal Blue Staining KitInvitrogenLC6025
12-луночная чашка для культуры тканейCorning3513
CoverslipsFisher Scientific12-545-100Автоклав перед применением
Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific12-552-5
16% параформальдегидаЭлектронная микроскопия Sciences15710Разбавить до 3,7% в 1x PBS перед использованием
бычьего сывороточного альбумина (BSA)Fisher ScientificBP1605Приготовить 3% в 1x PBS
Пермеабилизационный буфер (0,5% Triton-X 100)Sigma-AldrichT8787Приготовить 0,5% Triton-X 100 в 1x PBS
Клик реакционный коктейль - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitМолекулярные зондыC10337Готовить согласно протоколу производителя
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399Готовить 10 мг/мл в воде, можно хранить при 4 °°; C в течение 1 года
Мышиное первичное антитело против ICP8Abcamab20194Используйте разведение 1:200 в 1x PBS
Mouse anti-UL42 первичное антитело (2H4)Abcamab19311Используйте разведение 1:200 в 1x PBS
Goat anti-mouse 594-конъюгированное вторичное антителоLife Technologiesa11005Используйте разведение 1:500 в 1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
2x SDS-бикарб раствор2% SDS, 200 мМ NaHCO3
Фенол:хлороформ:изоамиловый спиртСмесь 25:24:1 не менее чем за 1 день до использования, хранить при 4 &�°; C в темноте
хлороформ:изоамиловый спиртСмешать 24:1 не менее чем за 1 день до использования, хранить при комнатной температуре в темноте
10x Tris EDTA (TE), pH 8,0100 мМ Tris, 10 mM EDTA (разбавить до 1x перед использованием)
Qiaquick набор для очистки ПЦРQiagen28104
3 М ацетат натрия pH 5,2
Qubit 2,0 ФлуориметрInvitrogenQ32866
Набор для анализа кубита dsDNA HSInvitrogenQ32851
Пробирки для анализа кубитовInvitrogenQ32856
Флуоресцентный микроскоп, оснащенный программным обеспечением
Микроцентрифуга для пробирок
Настольная центрифуга для пробирок
Ячейка инкубатор
Шкаф
Термоблоки65° C и 95 ° С
Буфер для визуализацииобъемом 1,5 млобъемом 15 и 50 млдля культурбиобезопасности

Ссылки

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи