Всеобъемлющий протокол выборки и процесс костного мозга для измерения поддающихся оценке остаточной болезни и лейкозных клеток острой миелоидной лейкемией

Summary

Обнаружение минимальной или поддающихся оценке остаточной болезни (моб) является важным прогностическим biomarker для совершенствования оценки рисков и прогнозирования рецидивов в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Эти всеобъемлющие руководящие принципы и рекомендации с передовой практикой для последовательной и точной идентификации и выявления моб, может помочь в принятии эффективных решений лечения бод.

Abstract

Ответ критерии в острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) недавно было восстановлено, с морфологической экспертизы, используются для определения, является ли пациенты достигли полной ремиссии (CR). Примерно половина взрослых пациентов, кто вступил CR будет рецидивов в течение 12 месяцев из-за нарост остаточного ПФТ клеток в костном мозге. Количественный этих оставшихся лейкозных клеток, известный как минимальным или поддающихся оценке остаточной болезни (моб), может быть надежной biomarker для прогнозирования этих рецидивы. Кроме того ретроспективный анализ нескольких исследований показал, что наличие моб в костном мозге пациентов ПФТ коррелирует с бедными выживания. Это не только лейкозных населения, отражение клетки укрывательство лейкемии связанные иммунной фенотип (LAIP), связанные с клинических исходов, но так незрелых низкой частоты субпопуляция стволовых клеток лейкемии (LSC), оба из которых может быть мониторинг через проточной цитометрии моб или моб подобных подходов. Наличие чувствительных анализы, позволяющие обнаружения остаточных лейкемии (стебель) клеток на основе конкретных заболеваний или болезней, связанных функций (аномальные молекулярных маркеров или аномальным иммунофенотипа) имеют радикально усовершенствовать оценку MRD в борьбе с отмыванием денег. Однако учитывая присущие неоднородность и сложность ПФТ болезнь, методы отбора проб костного мозга и моб и LSC анализа должны быть согласованы когда это возможно. В этой рукописи, мы описываем подробная методология для адекватного костного аспирата выборки транспорт, образец обработки для оптимального потока многоцветные цитометрии оценки и стробирования стратегий для оценки MRD и СОП для помощи в терапевтических решений для борьбы с отмыванием денег пациентов.

Introduction

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) есть злокачественность костного мозга характеризуется дефекты в программе созревания, с ненормальным распространения и накопления клеток миелоидного progenitor, ингибирование нормального кроветворения, и в конечном итоге провал костного мозга . Эта болезнь является весьма неоднородной, в отношении морфологии, иммунофенотип, цитогенетика, молекулярные аберраций и ген выражение подписей, а также для лечения и лечения результат^1,2. Текущее управление включает в себя индукционной химиотерапии с целью достижения полной ремиссии (CR), следуют после ремиссии лечение, которое во многом ориентируется на результаты молекулярных, цитогенетическое и иммунофенотипических исследования и состоит из либо несколько курсов дополнительной химиотерапии или трансплантации стволовых клеток (аутологичных и аллогенных)³. Несмотря на высокий ремиссии курсы после интенсивной химиотерапии до 90%, 5-летняя выживаемость взрослых только около 30% - 40%, преимущественно за счет развития рецидивов, которые часто устойчивы к химиотерапии и тем самым очень трудно поддается лечению. Результат в детей лучше, хотя также рецидив приблизительно одну треть. Таким образом раннее обнаружение неминуемой эскалации будет заполнить неудовлетворенных потребностей в медицинских и может направлять терапии после ремиссии⁴.

Остаточного заболевания после терапии может отражать сумму всех диагностики и сопротивления после диагностики механизмов/факторов; Поэтому его измерения может быть прогнозные и инструментальные для направления лечения. Возможность ключевом остаточной болезни (ранее назывался минимальной остаточной болезни и теперь именуется как поддающиеся оценке остаточной болезни или MRD) намного ниже морфологический критерий 5% Доменная клеток меняется ландшафт классификация риска. В настоящее время методами в основном используется для обнаружения MRD являются два потока цитометрии-на основе и молекулярной, последний оценивается путем обратной транскриптазы ПЦР (RT-ПЦР)⁵ или, хотя в преждевременной стадии, следующего поколения виртуализации (НГС). Многие исследования у взрослых, а также как и дети уже продемонстрировал, что различные подходы MRD обеспечивают сильный прогностическую информацию в AML как после индукции и консолидации терапии^6,7и новое определение бремени болезней ( превосходит морфологических CR) в настоящее время становится⁸. Это предполагает, что MRD оценены потока и/или молекулярных методов должно стать и фактически уже становятся, стандартные в каждом клинических испытаний в борьбе с отмыванием денег.

Эта рукопись обсуждается процедура цитометрии подробные потока получить точные и воспроизводимые иммунофенотипических характеристика моб в образцах костного мозга, включая костного выборки и обработки процедур предшествующих проточной цитометрии. Наличие хорошего качества костного образцов в диагностике и последующие решающее значение для успеха этого измерения различных клинических баз и клинических испытаний. В самом деле эти предварительно аналитические соображения являются также жизненно важное значение для молекулярной (ПЦР и NGS) MRD подходов. Для характеризации иммунофенотипических моб они выразили маркеры в сочетании с нормальной миелоидного и прародитель маркеры, чтобы идентифицировать связанные лейкемии иммунофенотип (LAIP)⁹. MRD меры результирующей многих факторов, влияющих на ответа на терапию, например встроенные или приобретенных лейкемии лекарственной устойчивости, фармакодинамики и кинетика терапии, иммунной наблюдения и обеспечения соблюдения. Таким образом очень сильный пост диагностики прогностические параметр связанные с клинических исходов при делят на пороговый уровень, определяется приемника-рабочая характеристика (ROC) анализ является моб. Для нашего взрослого AML когорты HOVON 42а учиться, пороговый уровень установлен на 0.1% LAIP позитивных клеток/всего белых кровяных клеток. Используя этот критерий для определения отрицательных против позитивные MRD статуса, можно определить группа пациентов, которые имеют значительно хуже случаев рецидива, рецидивов свободно и общей выживаемости⁶. Кроме того мы описываем измерения незрелых, лекарственной устойчивостью лейкозных клеток с стволовых клеток подобные функции (CD34 + CD38-лейкоз стволовые клетки, или LSC), который предлагает сильный предиктор пациента исход¹⁰. Вместе LAIP и LSC подходов к форме потока гранулярных MRD подход. LAIP подход подходит для примерно 90% больных, в то время как LSC подход может быть применен в примерно 80% больных. Вместе над 95% из пациентов может быть оценена для одного параметра или оба.

Наконец эта публикация содержит подробное описание оперативной оценки MRD подачей cytometry. Это включает в себя: 1) согласование и стандартизация процедур отбора проб костного мозга, 2) образца Транспорт Руководство 3) подробное описание обнаружения лейкозных клеток с СУИМ, используя несколько панелей антитела, включая одну ячейку трубки подходы характеризовать LSC, 4) создание СУИМ машины для стандартных измерений, 5) аналитические программы для моб измерений и 6) аналитические программы для обнаружения LSC.

Мы стремимся показать все аспекты процедуры, в том числе подготовки пробы, поскольку это редко обсуждаются в то время как это является важным вопросом для качества конечный результат. Клинических процедур, используемых для оценки гемопоэтических клеток в костном костного аспирации и биопсии. Они выполняются вместе с полный анализ крови (CBC) и мазок крови. Оптимальный метод для аспирации костного имеет решающее значение для точной диагностики и контроля для моб измерения. Кроме того успешные костного аспирата должен содержать достаточное количество клеток для выполнения LAIP и LSC анализа потока (по крайней мере 10 миллионов жизнеспособных клеток). Здесь мы описываем метод для выполнения костного аспирации и руководящие принципы, которые должны привести к адекватной ячейки выборки (и предел потенциал для гемодилюции) необходимые для точной диагностики и дополнительных исследований. Эти предварительно аналитические соображения являются также жизненно важное значение для молекулярной (ПЦР и NGS) MRD подходов. Все образцы для Иммунофенотипирование должны обрабатываться преференциально в течение 24 h коллекции. Хотя не рекомендуется, костного мозга и периферической крови можно все еще обрабатываются и анализируются при хранении до 72 ч при комнатной температуре. Кроме того все расправы с материалом должно выполняться в стерильных условиях, для того чтобы криоконсервирования стерильных клеток для последующего исследования и качества оценки и т.д.

Protocol

Протокол следует руководящими принципами Кодекса исследований и Комитет по этике исследований медицинского центра университета VU.

1. костного аспирации и образца подготовка

1. Подготовка пациента и материала
   1. Заполните одно или два 10 мл-шприцы с 1% лидокаина, с помощью иглы 16-го калибра. Замените иглу для 21-иглы.
   2. Положите две капли 5% ЭДТА на часы стекло.
   3. Настройка стеклянных скольжениях (n = 15 с последовательной нумерации пациента и дата) в подготовке мазком.
   4. Место пациента в положении боковой пролежни. Найдите улучшенный задний подвздошный позвоночника и Марк с ручкой.
      Примечание: В общем, задняя превосходной подвздошной кости позвоночника является расположен одной стороны ширина дистальнее подвздошный гребень и одной стороны ширина сбоку от средней линии. В женщин фактическое позвоночника может быть немного более боковые, у некоторых мужчин немного более медиальной.
   5. Дезинфекция кожи с хлоргексидином 0,5-1% этанола из области предполагаемого биопсии наружу в кругах.
   6. Открыть пакет стерильных перчаток, надел стерильные перчатки и сложить пакет в таблице для создания поля, стерильный. Открыть пакет с аспирационная игла и поместите его на поле стерильным.
   7. Проникнуть в кожу и подкожную ткань и, наконец, надкостницы. В надкостнице администрировать лидокаина таким образом, что области 1 см в диаметре был наркозом.
      Примечание: Надлежащего отправления лидокаина в надкостнице является одним из наиболее важных факторов для комфорта пациента. Тест ли надкостницы был адекватно под наркозом, нажав месте предполагаемого биопсии с введенной иглы и спросить, если пациент чувствует боль. Примечания: дети полностью под наркозом во время всей процедуры.
   8. Держите аспирационная игла (15 га x 2.8") с проксимального конца в ладони и указательный палец против стороны игла металлическая ось недалеко от оконечности; Эта позиция позволяет лучше контролировать.
   9. Ввести иглу с вращающимся движением (быстро чередующихся pronating/supinating движения) через кожу к подвздошной кости позвоночника и принесите иглы контакт с задней подвздошной кости позвоночника.
   10. Это убедиться, что игла вводится в область наркотизированных надкостницы; пациент должен чувствовать только давление и никакой боли. Если пациент чувствует боль, переместить иглу, либо управлять более лидокаина.
   11. Использование давления нежно, но твердо, заранее иглу при вращении в чередуя движения по часовой стрелке счетчик по часовой стрелке. Вход в полость костного мозга обычно обнаруживается снижение сопротивления.
   12. Удаление стилет из иглы. Прикрепите пустой шприц 10 мл с иглой.
   13. Приложите отрицательное давление, сняв поршень шприца с нежным тянуть. Предупредите пациента, что они могут чувствовать боль и судороги ощущения, когда время наддува костного мозга. Если не хватает костного спикулы выпускаются, другой стремление должны быть выполнены с одной быстрой ничьей. Большинство Спикулы будет в первые 1-2 мл, полученные из первоначального тянуть. Аспирационная только 1-2 мл чтобы избежать разбавления образца.
       Примечание: Разбавление приведет к гемодилюции и может посрамить MRD результаты).
   14. Выньте шприц и замените стилет в стремление иглу. Извлечь часть мозга в часы стекло, а остальные в 8 мл, покрытые гепарина.
       Примечание: Инвертируйте каждая трубка сразу же после размещения аспирата костного мозга в пробирку образца для обеспечения адекватного антикоагуляционную. Коагуляции костного часто является причиной ненадлежащего материала. Дополнительные костного мозга могут быть атмосферный из того же места, но предпочтительно, игла продвигается 5-10 мм до получения новой аспирата. Желательно не более чем 2 ничьих за уровень вставки должны быть приняты. Убедитесь в том отметить трубы с увеличением числа, представляющий первый, второй и/или последовательных рисует. Это общее правило использовать первый розыгрыш для наиболее актуальных диагностического анализа.
   15. Кроме того отказаться от места вставки иглы и вновь ввести его в полость костного мозга в несколько миллиметров от первоначального места вставки и повторите процедуру.
       Примечание: Не аспирационная более чем 1-2 мл на тянуть, чтобы избежать загрязнения значительных крови.
   16. Повторяйте так часто, как материал необходим. Когда придыханием достаточного материала для конкретного клинического исследования протокол удалите иглу костного мозга.
       Примечание: В случае медленного или иначе трудно костного чаяния использование шприцев, которые были предварительно промыть с антикоагулянтами может быть полезным. В случае сухой краном выполните трепаном биопсии, который выходит за рамки этой рукописи.
2. Подготовка мазков для морфологической экспертизы
   1. Для оптимального морфологической оценки забрать спикулы (например, используя пластиковый шпатель) от аспирата в часы стекло и разместить их на стеклянное скольжение.
   2. Осторожно поместите другой стеклянное скольжение на слайд с костного мозга и аккуратно сдвиньте; Избегайте любого давления.
      Примечание: Только в случае очень больших костного спикулы незначительные может быть давление, для уменьшения толщины распространения клеток. Преимущества процедуры помощь от помощника, который может обрабатывать трубы образца. Точной маркировки труб с пациентом номер и количество последовательных костного розыгрыша имеет решающее значение.
   3. Тщательно высушите слайд, а затем выполните может Гимза Grünwald окрашивание (см. таблицу материалов). Изучения под микроскопом света для морфологии (см. Рисунок 1).
      Примечание: На рисунке 1A показывает мазков здорового костного мозга, состоящий из различных функциональных типов клеток во время Рисунок 1B AML пациента с преимущественно лейкозных взрывов. Чтобы лучше определить остаточную лейкозных бремя, иммунофенотипирование необходимо выполнить.

2. транспорт материала для дальнейшей обработки

1. Подготовка образцов для транспорта
   1. Для того, чтобы убедиться, что материал не будет течь и трубы не сломает, обеспечению правильной упаковки (см. Рисунок 2).
      Примечание: От нашего и другие опыты жизнеспособность клеток лучше всего сохранилась при костном хранится при комнатной температуре. Для долгосрочной транспорта это лучше всего достигается с помощью комнатной температуре «гель Пак» для помощи в стабильность температуры во время транзита.
   2. Ярлык пакеты и добавить правильные формы, чтобы избежать потери пакета, длительное транспорта или переключении пациентов.
      Примечание: Это по крайней мере должна содержать: данные пациента (форма 1). Это должно включать исследование номер и обычно «Дата рождения». Для правой обработки материала после прибытия в принимающем лаборатории, важно четкое заявление о конкретно запрошенные лабораторный анализ (молекулярной диагностики, иммунофенотипирование, моб и т.д.) в этой форме. (Форма 2) Адрес и номер телефона контактного лица, и, при необходимости, документы для таможни. Чтобы избежать потери пакетов в почте, отправка Лаборатория всегда уведомляет принимающей лаборатории, что образец был отправлен. Рекомендуется использовать «отслеживание и контроль».
2. Получение образцов из других институтов
   1. Убедитесь, что подходящие логистики на месте в институте для получения образцов в лаборатории, как только он доставляется в институте.
      Примечание: Для оптимальной организации материально-технического обеспечения желательно Центральной лаборатории требуется, который получает и собирает все материалы от местной клинике и от внешних больниц. В частности назначение протоколы для распределения и четкие связи с исполнительной лаборатории имеет важное значение.
   2. После получения образцов, точно Обратите внимание соответствующей нумерации в печатной формах и защищенной базы данных, содержащей важные поля например MRD идентификационный номер, суд конкретный идентификатор, больница регистрационный номер, отправка институт, Дата рождения, материал тип (периферической крови или костного мозга), белых кровяных телец (Лейкоцитов), Дата костного аспирации, дата измерения образца и любые соответствующие замечания за качество измерения.
      Примечание: Желательно, эта база данных также оснащен содержат дополнительные данные (или быть связана с другими базами данных) результаты анализа, и далее пациента данных таких последующих данных.

3. потока цитометр установки

Примечание: Этот раздел основан на Euroflow инструкции. ¹¹

1. Настройка фотоэлектронный умножитель (ПЛТ) напряжений для флуоресценции каналы и параметров FCS SSC
   1. Параметры для FCS SSC вскакивать проточный цитометр и выполнять «цитометр установки и отслеживания (КНТ)» на проточный цитометр КНТ бисером (см. таблицу материалов). Лизируйте клетки крови здоровых доноров (описано в разделе 4.1).
      1. Создайте новый эксперимент (в меню: эксперимент, новый эксперимент, выберите пустой эксперимент) с использованием производителя программного обеспечения (см. таблицу материалов) с рассеянием вперед (FSC) против сбоку (SSC) точка точечной настройки параметров FSC и SSC. Назовите этот эксперимент ПЛТ FSC/SCC с датой. Сначала использовать текущие параметры цитометр (щелкните правой кнопкой мыши: «применить текущий КНТ»). Эти параметры были созданы с проверкой производительности КНТ, используя КНТ калибровки бусины (см. таблицу материалов). Отрегулируйте FSC и SSC визуализировать лимфоцитов в «настройках Глобальный эксперимент». Примечание: в нашем проточный цитометр это 285 V и 400 V соответственно. Отметьте «Включить компенсации»: инспектор/инструмент настройки/компенсации.
      2. Оценить размер клеток (FSC) и детализации (SSC) старт измерения немеченого лизированы клеток периферической крови функцией «приобретать клетки». Gate лимфоцитов и отрегулировать/тонкий-подстройка FSC и SSC напряжений достичь следующие средние целевые показатели для населения закрытом лимфоцитов: FSC: 100 000 (диапазон 95000-105000); SSC: 15000 (диапазон 13000-17000).
      3. Приобретать и записывать данные путем измерения по меньшей мере 10000 событий. Проверьте означает FSC и SSC целевые значения для закрытого лимфоцитов и заново отрегулировать при необходимости.
   2. Для настройки целевой флуоресценции каналы ПЛТ напряжений использовать 8-пик Радуга бисера Калибровка частиц (см. таблицу материалов).
      1. Создайте новый эксперимент на СУИМ для 7-пиков. Создание листа «Целевой средней интенсивности флуоресценции (MFI)» с все необходимые точки участков (n = 2; FSC по сравнению SSC, FITC против PE), гистограммы (n = 8; одна гистограмма для каждого детектор флуоресценции) и статистические данные, показывающие ссылка пиковые значения (МРИ и коэффициент вариации (CV)) для каждого канала флуоресценции.
      2. Подготовьте свежего раствора, содержащего 1 капля (± 60 мкл) Радуга бисера в 1 мл dH₂O. нежно вихря смешать бусины в растворе.
      3. Используйте параметры ПЛТ FSC/SSC напряжений от выше и начать измерения флуоресценции Радуга бисера, используя функцию «приобрести» (без записи) по курсу «Низкого» потока с порогом, равным 5000. Используйте кнопку «прямоугольная ворота» ворота синглетно бусины населения P1 FSC по сравнению SSC точка сюжет. Ворота 7^й пик - P2 населения в FITC против PE точка сюжет.
      4. Продолжить на приобретение 7-пики Радуга бисера подвеска и отрегулировать/тонкий-подстройка ПЛТ напряжения во всех каналах флуоресценции для достижения целевых значений МФО согласно аннотированной МФО каналы в соответствии с бисером.
      5. Используйте «Запись» для сбора данных около 10000 событий и проверьте МФО для 7^й пик бусины. При необходимости исправьте ПЛТ напряжений. Однажды достигли МФО целевого значения для 7^й пик, записи/перезаписи файла для окончательного значения ПЛТ.
      6. Конечные значения ПЛТ имя и сохраните файл установки ПЛТ с датой, которая будет сохранять в каталоге производителя программного обеспечения. Используйте этот ПЛТ установки для исправления разлива над для каждого Люминесцентная краска.
2. Параметры компенсации флуоресцирования
   1. Этикетке трубки для каждого флюрохром конъюгированных антител и безупречная управления (см. таблицу S1 для используемых флуорохромов). Пипетка 100 мкл буфера в каждую пробирку.
   2. Вихревой флакон бусины разноцветные компенсации (см. таблицу материалов) тщательно и затем добавить 1 полное падение (± 60 мкл) этих бусин в каждую пробирку.
      Примечание: Избегайте капель бусины вниз стороне трубки при добавлении их в каждую пробирку. Это может привести к низкой бисера концентрации и может повлиять на результаты компенсации матрицы.
   3. Пипетки, соответствующий объем рассчитывается для одного теста достаточно флюрохром конъюгированных антител (который будет достаточно для пятно 10⁶ клеток) в соответствующие трубки и вихревой тщательно. Не добавляйте антитела к трубе неокрашенных управления. Инкубируйте 15-30 мин в темноте при комнатной температуре (RT).
   4. Добавить 4 мл буфера мытья (фосфат амортизированное saline (PBS)/0.05% azide-0.1% человеческого сывороточного альбумина (HSA) (см. таблицу материалов)) к каждой трубе. Центрифуга трубы на 300g , 10 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте шарик Пелле путем добавления 0,2 мл буфера мытья к каждой трубе. Вихревой трубы тщательно.
   5. Откройте производителя программного обеспечения для анализа (см. таблицу материалов) и создайте новый эксперимент (в меню: эксперимент, новый эксперимент, выберите пустой эксперимента) и переименовать как компенсации файлов с текущей датой.
   6. Перейдите в «настройки цитометр» и используйте параметр ПЛТ раздел 3.1. Убедитесь, что порог в FSC 5000 и компенсации значения всех используемых флуорохромов равны нулю.
   7. Создайте элементы управления компенсации, включая этикетки конкретных трубки, по мере необходимости. Не забудьте включить элемент неокрашенных. Выберите в меню: эксперимент, компенсация установки, создайте компенсации управления.
   8. Загрузить трубки неокрашенных управления и отрегулировать P1 ворот вокруг населения шарик синглетно и убедитесь, что P1 ворота содержит только синглетно бусины.
   9. Щелкните правой кнопкой мыши P1 ворота и выберите «Применить для всех компенсации элементов управления». Запись данных для всех один помечены флуоресцентным трубок. Убедитесь, что ворота P2 охватывает положительные население на каждой гистограммы флуоресценции. При необходимости отрегулируйте ворот.
   10. Расчет компенсации. Выберите эксперимент, установки компенсации, рассчитать компенсацию.
   11. Если расчет компенсации не выполнена, отображается сообщение об ошибке. Внесите необходимые изменения и пересчет. Когда расчет компенсации выполнена успешно, появится диалоговое окно запроса имени для установки компенсации.
   12. Введите имя (например, YY-MM-DD 8 цвет настройки) и нажмите, ссылку и сохранить. Установки компенсации будут также сохранены в каталоге установки компенсации.
       Примечание: Те же параметры могут использоваться для всех экспериментов с использованием же флуорофоров.

4. поток цитометрии оценки (LAIP и LSC)

Примечание: Здесь мы описываем основная процедура лизис до окрашивания, которая позволяет пятно предпочтительным концентрацию лейкоцитов. Большинство протоколов MRD использовать этот подход, хотя некоторые успешно использовали другие варианты, например окрашивания перед lysis. Всего костного окрашивания перед лизис минимизирует преференциальных ячейка потерь¹², но имеет недостаток концентрации непредсказуемым, слишком низкой сотовый.

1. Основная lysis клеток
   Примечание: Держите unmanipulated образцы горизонтально на RT, когда приобретение cytrometric потока не может быть выполнена тот же день для того чтобы начать всю процедуру на следующий день.
   1. Ресуспензируйте антикоагулянтом образца костного мозга до однородности, инвертирование образец несколько раз. Определить концентрацию клеток костного мозга (белых кровяных телец (Лейкоцитов)) с использованием клеток подсчета камеры с ячейкой, окрашивание Тюрк решение (см. таблицу материалов).
   2. Накапайте необходимый объем костного мозга в отдельном 15 мл трубку. Количество клеток зависит количество отдельных окрашивание трубок; для одного окрашивания (одна трубка) используйте примерно 2 х 10⁶ белых клеток крови для LAIP измерений и 8 х 10⁶ белых клеток крови для измерения LSC трубки.
   3. Лизировать красных кровяных клеток, добавив лизировать решения (см. таблицу материалов). Необходимый объем лизировать решение должно быть 10 раз превышает объем суспензии клеток.
   4. Смешайте нежно, путем инверсии и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. Центрифуга для 7 мин 800g в RT. Discard супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера). Ресуспензируйте Пелле клеток в фосфат амортизированное saline (PBS)/0.05% azide-0.1% человеческого сывороточного альбумина (HSA) (см. таблицу материалов) на RT. использования максимальной громкости трубки.
   5. Центрифуги для 7 мин 800 г на RT. удалить супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера). Вновь приостановить Пелле клеток в PBS/0.05% azide-0.1% HSA к концентрации клеток 100 х 10⁶ WBC/мл и разделить на количество предполагаемых трубок.
2. Окрашивание клеток для проточной цитометрии
   1. Накапайте моноклональных антител (Моава) коктейль решение смешать в соответствующей ячейке флуоресценции активированный сортировщик (FACS) трубы и проинкубируйте с клетки лизированных костного 15 мин в темноте.
      Примечание: Это очень важно, когда тандем красители используются. Например увидите смеси панели, стандартно используемые в нашей лаборатории (таблица S1).
   2. Вымыть клетки с 3 мл PBS/0.05% azide-0.1% имеет. Центрифуга клетки для 5 мин на 400g. Отбросить супернатант (например с вакуумный насос или пипетка Пастера) и Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
   3. Для измерения LSC: Ресуспензируйте Пелле клеток в 400 мкл PBS/0.05% azide-0.1% HSA и 4 мкл пустых бусины (например Spherotech, см. таблицу материалов) для использования в качестве отрицательного контроля населения в анализе.
   4. Откройте моб или LSC эксперимент планировка на СУИМ (см. таблицу материалов) и меру для моб по крайней мере 100.000 WBC закрытого события для измерения ПФТ пациентов образцов на диагноз и 1 X 10⁶ WBC ПФТ образцов в последующей деятельности. Для LSC эксперименты измерения по меньшей мере 4 х 10⁶ WBC в диагностики и последующей деятельности для получения надежного результата LSC.
   5. Сохраните данные с помощью стандартизированных соответствующий имя файла для анализа результатов. Составить перечень различных измеряемых маркеров на клетки бод и ПФТ стволовые клетки (положительный, отрицательный, над/под выражение) и хранить эти данные в лаборатории журнала.
   6. В случае, если есть мера не диагноз LAIP доступны, все 4 трубы на последующих мер для обеспечения того, чтобы любые возможные измеримые LAIP могут быть определены разные от нормальный подход.
   7. Выбрать наиболее надежным LAIP(s)¹³ на диагноз и получить как много событий как можно скорее, но > минимального числа определены.

5. выявление иммуно-фенотипы связанные лейкемия (LAIP): анализ различных клеточных популяций

Примечание: ФТС файлы могут быть проанализированы с несколькими программного обеспечения для оптимальной визуализации различных клеточных популяций (см. таблицу материалов).

1. Белые клетки крови населения
   1. Ворота CD45 позитивные клетки и жизнеспособной появляясь клетки, оставляя низкой FSC (нежизнеспособных клеток, эритроидных клеток) в пределах участка FSC/СЮЮ; они содержат ТПН (Рисунок 3Ая). Показать WBC и использовать один из примитивных маркеров (например, CD34; Рисунок 3Aii) чтобы помочь выяснить окончательную позицию взрывов в районе де CD45dim (Рисунок 3Аiii).
   2. Ворота CD45dim клеток и обратно строба клетки в сюжет FSC/SSC (рисунок 3Bя). Удаление CD34 ворота (Рисунок 3Bii) сообщая % клеток в эти ворота как % взрывов в дереве населения в программе. Показать взрывы в SSC/CD34 сюжет и строба CD34 позитивные клетки (Figure3Biii).
2. Лимфоциты
   1. Используйте лимфоцитов как внутренний контроль: миелоидного населения как отрицательный контроль и лимфоидных населения как позитивный элемент управления.
   2. Начать от населения белых кровяных клеток (рис. 4A). Ворота лимфоцитов как^{CD45 /SSCнизкой численности населения (рис. 4В)}.
   3. Убедитесь, что есть нет миелоидных клеток в ворота, используя CD34, CD117, CD13 или CD33 и ворота для CD13 негатив/CD33 отрицательные клетки (рис. 4C-E). Вызовите это население «лимфоцитов» в дереве населения (Рисунок 4F).
3. LAIP в диагностике
   1. Ворота взрывов и впоследствии CD34 позитивные клетки SSC/CD34 сюжет и вызывать эти «примитивных маркер» в дереве населения.
   2. Участок примитивные клетки, в этом случае CD34 положительными и лимфоцитов в новый участок с лимфоидных маркер (CD7) против миелоидного маркер (CD33). Ворота аберрантных населения (см. для указания дополнительного файла 1) и называть их «LAIP положительным» в дереве населения.
      Примечание: Финал, выбрали LAIP сообщается как % LAIP на население взрыва. Чувствительность, специфичность и стабильность LAIPs может устанавливаться только законным персонала с большим опытом в MRD измерения. В общей сложности этих параметров определяет качество LAIP. В рисунке 5 A-Dприводятся примеры оценок четырех различных LAIP в диагностике.
   3. Определить выражение LAIPs (% от взрывов) и сохранять эти данные в базу данных или файл excel.
   4. Сделайте сообщения о анализ СУИМ и ноты LAIPs, которые должны использоваться при измерениях моб.
      Примечание: Определение LAIPs разрешается в команде экспертов, поскольку он является важным элементом для точных измерений MRD на последующие вверх.
4. MRD на последующие
   1. Ворота взрывов, как описано в разделе 5.1, но в зависимости от времени точки после терапии; Правильная оценка этих ворот может быть сложным. Фокус на LAIP фенотип, которая была учреждена на диагноз и ворота незрелыми населения.
   2. Как описано в разделе 5.1. найти правильный взрыва ворота на основе определенных aberrancy и быть осведомлены о регенерации костного мозга и нормальной выражения для того, чтобы их ворота
   3. Повторите то же самое стробирования стратегии на всех последующих пунктов и определить MRD как процент LAIP клеток в населенности всего белых кровяных клеток. Смотрите примеры Рисунок 6A и 6B.
   4. Доклад MRD позитивности, когда % MRD ≥ 0,1% белых кровяных клеток. Печать анализируемых данных в стандартном формате обсудить каждую неделю с командой моб. Регистрировать результаты после того, как будет достигнут консенсус. Пусть результаты санкционироваться руководителем до ознакомления с результатами клиницисты.

6. анализ стволовых клеток MRD (LSC однотрубные)¹⁴

1. Анализ LSC в диагностике и последующая деятельность
   1. Ворота взрыва клетки, как описано в разделе 5.1.
   2. Как потенциальные негативные управления CD38-ворота эритроцитов фракция (т.е. оставшиеся эритроцитов после лизиса, характеризуется как SSC^низкой/FSC^низкой и CD45^{негативных}). При необходимости, мертвые клетки и фрагменты клеток могут быть исключены дополнительных ворота в этот участок.
   3. Определите в ворота лейкозных взрыва субпопуляция с выражением CD34. Выберите в этой популяции CD34⁺ CD38^– клетки (использовать как отсечения: Верхняя граница пустой калибровки Бусины для определения порога (см. таблицу материалов), красный фракция или использования 10³ как пороговой). Вызовите это население «CD38^низкой прародителями» (Рисунок 7).
      Примечание: Увидеть дополнительный файл 1 для получения более подробной информации о параметре CD38-отрезными вне уровней.
   4. Определить в рамках этой CD38^{малочисленностью} населения истинный CD34 + CD38^{очень низкой} стволовых клеток населения, используя медиану Красной фракции, Нижняя граница пустой калибровки бусины или выбрать 10² как пороговой (Рисунок 7 ). Просмотреть дополнительные файл 1 для получения более подробной информации о настройке CD38-отрезными вне уровней.
   5. В рамках обеих групп населения, ворота лейкозных стволовые клетки против нормальной гемопоэтических стволовых клеток (LSC против HSC), анализируя каждый лейкозных маркер в панели (т.е. CD45RA, комби-6 (CLEC12A, Тим-3, CD7, CD11b, CD22 и CD56 все в PE), CD123, CD33 и CD44).
   6. Участок стволовых клеток маркер интерес по сравнению с другими стволовых клеток маркер Сравнение позитивности негативности с позитивности негативности других маркеров и корректировать LSC против HSC частоты.
   7. Отчет процент незрелых взрывов, лимфоцитов, CD34 + клеток. Для всех отдельных маркеров список общее количество CD38^низкой и CD38^verylow и количество CD38^низкой и CD38^verylow , маркер позитивные (и таким образом опухолевой).
   8. Выберите для маркера, лучше всего отличает нормальные гемопоэтические стволовые клетки против лейкозных стволовых клеток для дальнейшего анализа. Рассчитайте процент LSC и HSC как процент от общей WBC.
      Примечание: Доля LSC ≥ 0,004% сообщается как LSC положительный диагноз, а отключения-0,0001% на последующие. Аберрантное стволовые клетки, стробирование в последующих пробах похож на анализ как диагноз, однако, число клеток в популяции стволовых клеток может быть очень небольшим. Отсюда необходимость приобретения достаточно события.

Results

В 90% ПФТ пациентов могут быть определены по крайней мере один LAIP. Чтобы создать точные проценты LAIP + клеток примитивные клетки взрыва на диагноз, соответствующий параметр Доменная ворот имеет решающее значение и требует проверки, как визуализировать на Figure 3. Пример каждого пациента, укрывательство определенного типа aberrancy на CD34 + примитивные клетки визуализированы на рисунке 5. Для измерения MRD на последующих вверх, ранее определенных LAIP + клетки воротами и определяется как процент LAIP + клеток ТПН. Поэтому установление этой ворот имеет решающее значение для достижения правильные результаты моб. На рисунке 6 показан после второго цикла индукционной терапии пациент, который остается в полной ремиссии и пациента, что рецидивы после того MRD положительные результаты (≥ 0,1%).

Текущий протокол пригоден только для определения стволовых клеток в CD34 + клеток, поскольку тщательный характеристика этот отсек показал, что CD38-население испытывает наиболее мощным стволовых клеток как часть. Для того чтобы отделить LSC от HSC в этой фракции, используются дополнительные маркеры. Чаще всего отдельные маркеры, чтобы отличить LSC являются CD45RA и combi канал, укрывательство 6 конкретных LSC маркеры, помечены PE. На основе дальнейшей клинической оценки, пороговый уровень ≥ 0,004% был определен как LSC-позитивных и был связан с хуже выживания в диагностике, в то время как пороговый уровень 0,0001% был использован в кокон до¹⁰.

Рисунок 1 : Костный мозг мазка. A) здорового донора и пациента B) бод (FAB 5 подтип). Гимзе показано на 100 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Правильно упаковочного материала для биологических жидкостях. Более подробную информацию о правилах и правилах транспортировки биологических жидкостей можно найти на веб-сайте¹⁵ центров по контролю и профилактике заболеваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Стробирования стратегии для определения взрыва клетки. A) стробирование CD45dim, B) стробирование CD34 + взрывов.

Рисунок 4 : Стробирования лимфоцитов. A) синие клетки являются WBC, показано в FSC/SSC сюжет, B) зеленые клетки являются лимфоциты характеризуются CD45^{высокой}/SSC^низко, C) в показаны примеры отрицательность CD34, D) отрицательность CD117 и E) негатива для CD13, F различных типов клеток Обзор населения дерево. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : LAIPs диагноз AML. A) LAIP на основе крест линии aberrancy (CD7 на CD33 выражая клетки), Б) LAIP на основе асинхронной дифференциации (CD11b на CD13 выражая клетки), C) LAIP на основании Гиперэкспрессия по сравнению с нормальной клетки (CD34^{очень высокий} на CD13 выражая клетки), D). LAIP на основе underexpression, по сравнению с нормальной клетки (HLA-DR^низкой на CD33 выражая клетки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : LAIP, а затем во время терапии. Определение A) LAIP в диагностике (CD34 +/ CD13 +/ CD33-) и потеря LAIP во время последующего у пациентов, которые остались в непрерывной полной ремиссии, определение B) LAIP в диагностике (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) и сохранение LAIP во время последующего у пациента ВОЗ рецидив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Стволовых клеток стробирования. ) Gating различных CD34 +/ CD38 населения на основе бусины (CD38^низким – ниже верхней границы бусы, а CD38^{очень низкой} определяются как истинный отрицательные клетки, представляющие LSC и расположены ниже медианы бисер), B) два примеры пациентов с отличием между HSC и LSC в последующей деятельности на основе CD45RA^neg и CD45RA^pos выражение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.

Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.

Дополнительного файла 3. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы downoad этот файл.

Discussion

Множество данных, доступных, которые показывают доказательства для моб позитивности, связанный с бедными выживания, и поэтому MRD оценки может улучшить пациента исход, предоставляя дополнительную прогностическую информацию, на которой клинические решения могут быть сделаны. Следовательно последовательного и согласованного метода иммуно фенотипического оценки MRD важно в конечном итоге улучшить пациента терапии. Это также имеет важное значение при сравнении клинических исследований различных клинических сайтов, и может в конечном итоге помощь в клинической решение приготовления и сервировки качестве суррогатной клинических конечной точки для общего выживания. Понятие, что твердые руководящие принципы необходимы для точной и последовательной MRD измерений привело к согласованным действиям Европейской сети лейкемии (АНО) разработать современные руководящие принципы. Этот всеобъемлющий документ будет опубликовано поздно-2017 и будет играть важную роль для многих исследовательских групп и лабораторий, двигаться вперед.

Важнейшие шаги в рамках протокола

Важным и часто упускается из виду аспектом MRD анализа является влияние качества образца на точное определение моб. Это более очевидной, когда материал должен перевозиться в других институтов глобальной клинических испытаний, учитывая дополнительные оперативные соображения, которые должны приниматься во внимание в этой обстановке. Чтобы уменьшить риск смешивая пациента информацией и своевременную доставку образцов адекватного управления имеет решающее значение. Опять же на данном этапе транспорта правильной формы и/или импорт в Электронная больница систем с четких назначений запрошенного анализа не требуется. Отмечая на сцену в терапии MRD выборки также имеет решающее значение, так как это может быть актуально для клинических решений (например, после второго курса терапии) и поэтому должны быть четко определены. Использование фиктивных данных (таких как к примеру 1 января в год рождения) увеличивает риск смешивая пациентов или анализа. Если требуется по закону, следует использовать альтернативный способ анонимной идентификации.

Все образцы для Иммунофенотипирование должны обрабатываться преференциально в течение 24 h коллекции. Хотя не рекомендуется, костного мозга и периферической крови можно все еще обрабатываются и анализируются при хранении до 72 ч при комнатной температуре. Кроме того, все расправы с материалом можно наилучшим образом выполнить в стерильных условиях, поэтому дальнейшие криоконсервирования клеток в биобанках (местных) остается актуальным: многие клинические исследования имеют дополнительные анализы для дальнейшего изучения лейкоз клетки с уважение к молекулярной, иммуно Фенотипические и функциональные особенности, выполняться на более позднем этапе. Однако подробная информация о biobanking не входят в сферу этой рукописи.

Использование MRD как диагностический инструмент подразумевает, что она нуждается аккредитованная лаборатория, не только для проточной цитометрии, но и относительно контроля качества MRD оценки. Это может потребовать распространение образцов конкретные справочные лаборатории или (перерегистрации) анализ потока файлов с измерениями MRD Справочник команд.

Эта статья описывает наиболее важные действия из коллекции аспирата костного мозга для определения моб в клинических образцах - требующие вся команда экспертов с конкретными задачами, обязанности и с частыми коммуникации для эффективного Характеристика и анализ. Поскольку каждая задача имеет решающее значение для процедуры, рекомендуется иметь звук логистики, включая протоколы в каждой лаборатории и достаточно резервного персонала, которые были специально подготовлены для выполнения этой задачи. Кроме того поскольку есть некоторые относительно субъективных шаги в части процедур (особенно LAIP и LSC аберрантных маркер идентификации), важно иметь обсуждений о окончательный результат команды, и окончательный доклад уполномоченных команда Супервайзеры. Нынешние усилия преследуют создание компьютерного программного обеспечения, который поможет стандартизировать MRD анализ (LAIP и LSC).

Модификация и устранение неполадок

Каждая лаборатория может иметь свой собственный набор антител, которые могут использоваться для определения различных субпопуляций, хотя наличие стандартизированных позвоночника маркеров имеет важное значение для сопоставимые результаты, изложенные в руководящих принципах состояние искусства АНО MRD измерений документа упомянутые выше. Независимо от выбранной маркеров, что есть некоторые вопросы, которые могут затруднить анализ результатов и должны приниматься во внимание.

Ограничения метода

Выявление LAIP и LSC аберрантных маркер выражения сначала начисленных на диагноз и наблюдение за время (во время и после терапии) для точной характеристики MRD фенотип. В то время как более 95% из пациентов может оцениваться через LAIP или LSC (или оба), все еще некоторые пациенты не определено LAIPs или не CD34 + CD38-LSCs представить с CD34 негативные взрывов или отсутствует пример диагностики. В таких случаях, это все еще стоит попытаться измерить MRD с группой антител, как широкие, как количество доступных ячеек позволяет и выберите наиболее надежным (давая сильнейшие различия лейкозных клеток) LAIP. Учитывая, что доля пациентов, которые в конечном итоге рецидив не напоминают полностью диагноз иммунофенотип, вследствие неоднородности ПФТ болезнь, измерения широкий группа антител на моб рекомендуется в любом случае. Эти сдвиги иммунофенотипических включают взрыв клетки и LSCs и было показано во время терапии¹⁶ и измеримых болезни могут быть основаны на этих так называемых предстоящих населения. В это время однако, она не была определена ли все иммунофенотипических подгрупп населения приведет к рецидиву болезни, и поэтому не общепринятой практикой доклад с учетом MRD-терапия основана на эти клетки в клинических испытаниях. Важно отметить, что риск отсутствует LSC вследствие перемещения населения уменьшается подход одной трубки, в которой наиболее важных aberrancy определение маркеров находятся в одном проточной цитометрии (PE) канал¹⁴.

Значение в отношении существующих методов

Метод, описанный в настоящем Протоколе опирается на определение одной или более LAIPs, ячейки, которые выполняются во время терапии. Недостатком этого метода является, что он был недавно показал, что LAIP может измениться во время терапии. Таким образом некоторые предстоящих населения с различными аберрантных маркеры могут быть пропущены. Чтобы обойти это, было бы лучше измерить все аберрантных маркеры, а не только те, нашли в диагностике. Тогда это будет похож на «отличается от обычных» подход, который используется в нескольких лабораториях¹⁷.

Будущие приложения

Недавно моб получил дополнительное внимание Роман клинических судебного дизайн. В эпоху специализированного лечения и целевых лекарственной терапии использование MRD как результат мера позволит сократить время, необходимое для установления клинической эффективности Роман лечения, в конечном счете позволит быстрее введение срочно терапевтических параметры в клинику. Значение соответствующего материально-технического и практического выполнения согласованной оценки MRD имеют решающее значение для будущего успеха лечения ПФТ, как FDA в настоящее время изучает возможности использования MRD качестве суррогатной конечной точки вместо общей выживаемости меры¹⁸.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
	BD Biosciences	120995496,060996589 и 013729	FACS Canto II
	BD Biosciences	555360	CD7 FITC
	DAKO	F076701	CD2 FITC
	Sanquin	M1613	CD36 FITC
	BD Biosciences	332778	CD15 FITC
	BD Biosciences	335039	CD45RA FITC
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345785	CD14 PE
	Miltenyi Biotec	130-080-801	CD133 PE
	BD Biosciences	562566	Clec12a PE
	BD Biosciences	565568	Tim-3 PE
	BD Biosciences	332774	CD7 PE
	BD Biosciences	333142	CD11b PE
	BD Biosciences	337899	CD22 PE
	BD Biosciences	345810	CD56 PE
	BD Biosciences	347222	CD34 PERCP-CY5.5
	BD Biosciences	558714	CD123 PERCP-CY5.5
	Beckman Coulter	B49221	CD117 PE-CY7
	BD Biosciences	562854	CD33 BV421
	BD Biosciences	345791	CD19 APC
	BD Biosciences	333143	CD11b APC
	BD Biosciences	345800	CD33 APC
	BD Biosciences	345807	CD38 APC
	BD Biosciences	641411	HLA-DR APC-H7
	BD Biosciences	560532	CD44 APC-H7
	BD Biosciences	562596	CD13 BV421
	BD Biosciences	348811	CD34 PE-CY7
	Beckman Coulter	A96416	CD45 Krome Orange
	BD Biosciences	655873	CD45 HV500c
	BD Biosciences	655051	CST бусины
	BD Biosciences	555899	Раствор для лизинга
	Pharm BD Biosciences	644204	Multicolor CompBeads
	BD Biosciences	655051	CST бусины
	BD Biosciences		FACSDiva программное обеспечение
	Cytognos		Infinicyt
	Spherotech	Euroflow RCP-30-5a
	Sigma-Aldrich		Tuerk solution
	Spherotech	BCP-100-5	Заготовка калибровочных частиц Бусины
			HSA
			Азид
			ddH2O