Методическая статья

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

DOI:

10.3791/56418

⸱

10 ноября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Experimental Therapeutics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает использование центробежных сцеживания для разделения клетки первичной острый лимфобластный лейкоз на фазы различных клеточного цикла.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность синхронизации клеток был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла. Общие методы, используемые включают лишение сыворотки; химические вещества, которые аресту клеток в разных клеточного цикла этапов; или использование митотическая трясти-Off которая эксплуатирует их снижение присоединения. Однако все из них имеют недостатки. Например голод сыворотки работает хорошо для нормальных клеток, но менее хорошо для опухолевых клеток с нарушенной клеточного цикла контрольно-пропускных пунктах из-за потери подавитель онкогена активации или опухоли. Аналогичным образом химически обработанную клеточных популяций может гавани наркотиков индуцированного повреждения и показать изменения, связанные со стрессом. Техника, которая обходит эти проблемы — противотоком центробежные сцеживания (КЦВ), где клетки подвергаются два противостоящих сил, центробежная сила и скорость жидкости, которая приводит к разделение ячеек на основе размера и плотности. Поскольку клетки продвижения через цикл обычно увеличить, КЦВ может использоваться для разделения клетки на фазы различных клеточного цикла. Здесь мы применяем этот метод к клеткам первичных острый лимфобластный лейкоз. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М можно получить отличные урожайности. Эти популяции клеток идеально подходят для изучения механизмов клеточного цикла зависимые действия противоопухолевых препаратов и других приложений. Мы также показать, как изменения стандартной процедуры может привести к неоптимальной производительности и обсудить недостатки метода. Подробная методология представлена должно облегчить применение и разведки технику для других типов клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культивируемых клеток обычно растут асинхронно и отдельные клетки присутствуют в различных стадиях клеточного цикла. Некоторые организмы демонстрируют естественно синхронных клеток циклов или могут быть синхронизированы с конкретных физиологических раздражителей. Например ядра в гигантских плазмодия миксомицеты Physarum polycephalum разделить в весьма синхронных моды1и клетки зелёных водорослей, которые Desmodesmus quadricauda могут быть синхронизированы с чередующихся светлых и темных периоды2. Хотя такие организмы предлагают уникальные экспериментальные атрибуты, они недостаточно модель сложности mammalian клеток. Возможность искусственно синхронизации клеток млекопитающих населения был центральным для продвижения нашего понимания регуляции клеточного цикла и молекулярные основы клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов. Распространенные методы включают лишение сыворотки, химических блока и выпуска или эксплуатации физические характеристики3,4. Снятие сыворотки часто вызывает клетки ввести покоя, и повторное добавление сыворотки способствует повторный клеточный цикл в фазе G15. Химические ингибиторы включают агентов, таких как избыток тимидина или гидроксимочевина, который блокирует клетки на границе G1/S или микротрубочек ингибиторов, которые обычно арест клетки в M фазы3,4. Подходы, которые эксплуатируют физические характеристики включают митотическая трясти офф который может использоваться для обогащения для митотическая клетки так как они являются менее адэрентных чем межфазной клетки6. Однако все эти методы имеют потенциальные недостатки. Например не все типы клеток поддерживать жизнеспособность в отсутствии сыворотки или наличие химических ингибиторов, а доходность клеток после митотическая трясти офф ограничено без предварительного синхронизации с митотическая ингибиторов.

За исключением ранних эмбриональных клеток циклов, где клетки постепенно уменьшаться в размерах, как они делят7, большинство клеток, продвижения через цикл прохождения фаз роста и стать больше. Это свойство используется в технике противоточные центробежные сцеживания (КЦВ), который может использоваться для разделения клетки, различающихся по размеру и следовательно в клеточный цикл фазы8,9. Во время КЦВ, клетки находятся под влиянием двух противостоящих сил: центробежные силы, которые побуждают клетки от оси вращения и жидкости скорости (противоток), который управляет клетки к оси вращения (рис. 1). Клетки в зале сцеживания достичь равновесия, где эти силы равны. Ключевыми факторами, диктуя положения равновесия являются диаметр ячеек и плотности. Как поток увеличивается скорость буферного раствора и силы сопротивления противоточные перевешивает центробежной силы, устанавливается новое равновесие, вызывая изменения в положении клеток внутри камеры. Все клетки смещается в сторону выхода камеры, результате поменьше, оставляя камеры сначала, тогда как более крупные клетки остаться внутри камеры до тех пор, пока противоточные ставка увеличивается недостаточно для содействия их выхода. Клетки, спасаясь сцеживания камеры с подряд увеличение темпов противоточные могут быть собраны в определенных фракций и каждая часть содержит клетки последовательно увеличения размеров. Вместо проведения сцеживания с прирост темпов противоточные, последовательно уменьшается в центробежных сил, уменьшив скорость центрифугирования достигнет того же результата. Процесс сцеживания требует оптимизации в зависимости от типа клеток, сцеживания буфер занятых и конкретные используемые приборы. Скорость оседания клеток в этих условиях лучше всего описал закон Стокса: SV = [d2(ρp- ρм) / 18η] .ω2r, где SV = скорость седиментации; d = диаметр частицы; P ρ = плотность частиц; M ρ = плотность буфера; Η = вязкость буфера; Ω = угловой скорости ротора; и r = радиальный позиция частицы. Таким образом SV пропорциональна диаметр ячеек и плотности, и так как диаметр, возведенное в степень второго, он способствует более значительно, чем плотность, которая обычно постоянна через клеточного цикла.

Важным преимуществом КЦВ, что клетки не подвергаются суровым условиям химической обработки или недостатке питания и могут быть восстановлены в отличную доходность по существу невозмущенной. Требованием является, что в вопросе клетки проходят значительное увеличение в диаметре, по крайней мере 30%, как они пересекают клеточного цикла. Основным недостатком является стоимость специализированных центрифуги, ротора и аксессуары. Тем не менее возможность готовить клетки, обогащенная КЦВ в конкретных клеточного цикла этапов значительно облегчило исследования клеточного цикла в организмах из дрожжевых клеток млекопитающих9,10. Кроме того последние достижения расширяют использует для разделения клетки от здоровых против раковой ткани, разделение различных типов клеток в гетерогенных смесей, а также производства конкретных клеток видов иммунотерапии9.

Наш основной интерес был в понимании механизма действия ориентации агенты (MTA), такие как алкалоиды барвинка и таксаны микротрубочек. Считается, что эти препараты были действовать исключительно в митозе, блокировка шпинделя микротрубочек функции11,12, однако последние данные свидетельствуют о том, что они могут также нацелены на межфазной микротрубочек13,14. Мы недавно сообщили, что первичный острый лимфобластный лейкоз (все) клетки проходят смерти в любой фазе G1 или в М фазы при обработке винкристин и других MTA в обнаруживавшие клеточного цикла15. Возможность разделить все клетки различных клеточный цикл фазы КЦВ сыграл важную роль в достижении этот вывод. В этой статье мы описать технические детали и предлагают практические советы для применения КЦВ в подготовке первичного все клетки в разных клеточного цикла этапов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,


Примечание: этот протокол был оптимизирован для первичного B-все клетки которые колебаются в диаметре приблизительно 8 мкм (G1 фазе) до 13 мкм (фазы G2/М). Таким образом конкретные центрифугирования скорости и расхода насоса не могут быть применимы к клеткам с разные типоразмеры. Тем не менее соответствующие сцеживания параметров может быть оценена с помощью уравнения скорость седиментации. Клетки культивируемых в определенной среде сыворотки бесплатно как описано 16 на оптимальной плотности 1-3 х 10 6 клеток/мл. За исключением коллекции фракций, который проводится на 4 ° C, с помощью льда охлаждением трубы, все шаги проводятся при комнатной температуре и центрифуги на 20 ° C максимум 24 ° с.

1. Подготовка сцеживания буфер и материалы

  1. для того чтобы уменьшить глыба ячеек, подготовить буфером сцеживания Хэнк ' s сбалансированный солевой раствор (HBSS) с красным фенола, дополнена плода бычьим сывороточным (2% FBS), чтобы защитить клетки от механических напряжений в процессе сцеживания и 1,6 г/Л 2-Нафтол-6,8-дисульфокислоты кислоты калия соли (НДА), который оказывает клетки снаружи отрицательно заряженные и уменьшает слипания.
    1. Добавить 1.6 g NDA в 50 мл Конические трубки.
    2. В стерильных условиях, добавить 35 мл HBSS из бутылки 1 Л конические Тюбик 50 мл, содержащие НКО. Вихревой трубе, пока не растворится НКО.
    3. С помощью фильтра 0,2 мкм, переноса растворенных НКО в новых стерильных 50 мл Конические трубки. Затем добавьте НКО для остальных 1 Л HBSS.
    4. Наконец, добавить 21 мл FBS в HBSS для получения окончательного концентрации 2% (v/v).
      Примечание: В буфер сцеживания могут быть подготовлены и хранятся при температуре 4 ° C до окончания срока на HBSS или до тех пор, пока есть значительные изменения в рН, как указано пожелтение краски индикатора.
  2. Ярлык 50 мл конические трубы для сбора фракций, так что есть помечены трубы мыть фракциях (W1 и W2), 1 и 2 1-20 (F1 - F20) и остановить.
    1. Предварительно охладить эти трубы на льду до сбора фракций.

2. Монтаж системы сцеживания

  1. во-первых, установить сборку строб в центрифуге, таким образом, чтобы шнур питания поступает из камеры через порт на левой стороне. Убедитесь, что строб вспышки лампы в передней части камеры, так он будут выстраиваться с окном просмотра, когда закрыт центрифуги.
    1. Secure Ассамблеей в место, сначала затянув два крестообразной головкой в два отверстия в верхней части каждого кронштейна и затем, затянув винты с накатанной головкой в нижней части каждого кронштейна.
    2. Подключите шнур питания к порту строб задней центрифуги.
  2. Далее, установите ротор прямо вниз на hub привода центрифуг и закрепите с помощью T-ручка шестигранника.
    Примечание: Если центрифуги не требуется для целей не сцеживания, строб Ассамблеи и ротора может храниться в центрифуге между запусками.
  3. , Закрепив ротора, место быстро релиз сборку, содержащую сцеживания палаты, Счетчик баланс, Вращающиеся уплотнения Ассамблеи и монтажной в ротор.
    1. Опустите равномерно с одной стороны на камере сцеживания и с другой стороны на счетчик баланс до болтов в ротор оснастки в отверстия кронштейна.
    2. Наконец, присоедините кабель якорь, поместив PIN-код на одной стороне кабеля в отверстие в вращающейся печать Ассамблеи и обеспечения смотровой глазок на другой стороне кабеля с одним из крестообразной головкой (упомянутых в 2.1.1) на скобу на левой стороне o f камеры.
  4. Затем собрать системе потока, с помощью переменной скоростью насоса и шланг насоса буфер в сцеживания камеры и собирать буфера, как это вытекает из камеры сцеживания.
    1. Вставки, размер 16 входных труб из переменной скоростью насоса через порт в верхней левой центрифуги камеры так, что он входит в камеру.
    2. Прикрепить штуцер к свободному концу входной трубы и фитинга вставьте входное отверстие на стороне вращающейся Ассамблеи печать.
    3. Вставки размер 16 выходной трубопровод через порт и приложите его к передаче трубки в верхней части вращающейся печать Ассамблеи.
      Примечание: Система потока также может оставаться собраны между запусками сцеживания.
  5. Наконец, включите центрифуги и характеристики необходимые для эксперимента.
    1. Смена ротора идентификатор.
    2. Если центрифуги требует ввода времени, установить 2 h, который является более чем достаточным для завершения сцеживания запустить.
    3. Задания температуры до 20 ° C Макс температура 24 ° с.
    4. Установите ускорение для Макс и замедление для медленно.
    5. Наконец установите скорость 867 x g.

3. Грунтовка сцеживания системы

  1. сначала для того, чтобы стерилизовать системе сцеживания, поместите резервуар трубопровод в пластиковая бутылка 500 мл, содержащие отбеливатель 5% и место вывода труб в пустую пластиковую бутылку отходов 1 Л.
    1. Включите насос и установите скорость на 25 мл/мин и разрешить отбеливатель 5% для потока весь путь через систему сцеживания, до тех пор, пока он закачивается из трубки вывода в отходов бутылку.
    2. Включите центрифуги и позволить ему прийти к максимально обозначено скорость (867 x g) для того чтобы выпустить пузырьки и противодавления.
    3. Остановка центрифуги. Когда ротор перестанет вращаться, откройте крышку и осмотрите камеры для любых утечек.
    4. Если есть нет утечки, пусть раствор отбеливателя поток через систему для по крайней мере 5 минут
  2. Затем промыть систему газобетона водой как отбеливатель может привести к образованию осадка от сцеживания буфера, который может привести к глыба ячеек, а также повредить клетки.
    1. Место водохранилище труб в 1 Л бутылку газобетона воды и дайте ему флеш через по крайней мере 10 мин.
  3. После промывки водой, ввести сцеживания буфера в систему. Используйте 150 мл стеклянной бутылке, которая была газобетона для создания водохранилища для сцеживания буфер и клетки.
    1. Добавить 100 мл сцеживания буфера к бутылке и перемещения труб водохранилище в стеклянной бутылке так, чтобы трубка находится в самом низу.
    2. Начать центрифуги и позволяют буфера потока через систему для промывки воды.
    3. Как только бутылка водохранилища почти пуст и вода полностью очищается из системы, переместите вывода труб из отходов бутылки в водохранилище, что буфер перерабатывается в настоящее время через систему.
  4. Наконец, настроить в окне просмотра, чтобы Палата сцеживания можно увидеть на текущую скорость.
    1. Пресс Строб лампа кнопки на внешней стороне центрифуги питания так, что лампа горит. Поверните сцеживания kНоб также на внешней стороне центрифуги вплоть до левой.
    2. Хотя глядя через окно просмотра, медленно поверните ручку вправо до тех пор, пока Палата сцеживания вступает в представлении и вспышки света находится в времени с частотой вращения ротора.
      Примечание: Система сцеживания может остаться в этом состоянии до тех пор, пока клетки нацелен.

4. Подготовка образца клеток

  1. количество клеток и аликвота 300 до 400 миллионов человек в рост среднего на несколько 50 мл конические трубы. Спин вниз клетки в 1210 x g на 3 мин
  2. Аспирата роста средств массовой информации и Ресуспензируйте клетки в 25 мл буфера сцеживания, закупорить вверх и вниз осторожно.
  3. Для того чтобы уменьшить ячеек слипания, клетки пройти дважды через 25 манометра.
    1. С использованием шприц 10 мл составить клетки и затем присоединить 25 иглы и передайте клетки через на внутренней стене стерильные 50 мл Конические трубки. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока все 25 мл прошло через иглу.
    2. Получить новые игл и шприцев и повторите процесс выше раз.
      Предупреждение: Иглы для шприцов должны быть помещены в контейнерах Шарпс.
      Примечание: Очень важно, что клетки передаются через иглу непосредственно до введения их в системе сцеживания Чтобы сохранить клетки слипания до минимума.

5. Введение ячейки выборки в сцеживания системы и сбора фракций

  1. ввести образец клеток в системе сцеживания, поливая образец клеток в бачок, который имеет оставшиеся сцеживания буфера рециркуляции через .
    1. Пусть клетки войти в систему и достичь равновесия в зале сцеживания.
      Примечание: Этот процесс займет около 5 минут и прогресс могут быть отслежены, наблюдая клетки, как они входят камеры через окна просмотра. Чтобы гарантировать все клетки в камере, принимать капли элюента, место на слайде стекла и посмотреть под микроскопом. Если образец бесплатно нетронутым клеток, это подтверждает их сохранение в камере.
  2. Начать сбор фракций, когда все клетки вступили в камеру и имеется собственный граница в самой широкой части камеры, в которой клетки находятся в равновесии.
    1. Бегин, перемещая трубку вывода 50 мл Конические трубки помечены W1. Соберите 50 мл сцеживания буфера для этой фракции, убедившись в том держать глаз на бачок и пополнить с буфером сцеживания при необходимости.
      Примечание: Для того, чтобы убедиться, что все клетки введены в систему, позволяют бачок стать почти пуст перед заправкой водохранилища в первый раз. После первого пополнения не потребуется ждать водохранилище стать почти пуст. Кроме того, не всегда позволяют танк стать пустым, как это будет создавать пузыри и давления в системе.
    2. После того, как были собраны 50 мл для W1, одновременно изменить скорость 821 x g и переместить выходной трубки Конические трубки помечены W2 и собирать 50 мл больше на этой скорости.
    3. Продолжают изменять скорость и сбора фракций, как указано в таблице 1. Убедитесь, есть средства массовой информации в водохранилище танк и держать конические трубы на льду во все времена. Наконец, настройте в окне просмотра, медленно поворачивая ручку вправо, как скорость уменьшается.
    4. После того, как все 20 фракции были собраны, остановить центрифуги и собирать 50 мл в конической трубки помечены стоп.

6. Промывка системы сцеживания

  1. после центрифуги перестал полностью заподлицо системы, поставив трубку водохранилище в 1 Л бутыль из воды и трубки вывода обратно в бутылку отходов.
    1. Поверните скорость насоса до 50 мл/мин и разрешить воды для запуска через систему до тех пор, пока она истощается.
  2. Включите насос, удалите входной и выходной шланг от Ассамблеи быстро релиз и вытащить pin от крепления кабеля.
    1. Удалить быстро релиз Ассамблеи от ротора.
      Примечание: В зависимости от чего центрифуги будет использоваться, система сцеживания можно теперь оставить как есть. В противном случае вся Ассамблея может приниматься в обратном порядке как описано выше. Сцеживания палата можно из быстро релиз сборки удалены и очищены между запусками, с использованием ультразвуковой водяной бане. Это удаляет мусор и загрязняющих веществ из стенке камеры, которые могут негативно повлиять на более поздних бежит.

7. Анализ фракций и сбор G1 или G2/М бассейны.

Примечание: для того, чтобы продемонстрировать эффективность сцеживания, каждая фракция анализируется для клеток, диаметр ячеек и содержание ДНК, и пулы создаются клеток в G1 или G2/M этапы immunoblot анализов, как описано в Представитель результаты. Этот протокол секция опишу, как создать эти бассейны и подготовить их для экспериментального использования.

  1. Спин каждой фракции в 2000 x g 5 мин при 4 ° C и аспирата от сцеживания буфера.
  2. Фракции объединить вместе, чтобы получить пул фазы G1 и G2/М бассейн фаз.
    1. Для G1 фазе бассейн, Ресуспензируйте фракций, которые были собраны в диапазоне скоростей 788 x g до 661 x g (F1 - F5) в общей сложности 1 мл раствора фосфатного буфера солевой раствор (PBS) и передачи в 15 мл Конические трубки. Для пула фазы G2/M, Ресуспензируйте фракций, которые были собраны в диапазоне скоростей 387 x g и 333 x g (F17 - F20).
    2. Спина вниз клетки на 2000 x g 5 мин при 4 ° C и аспирата от PBS.
  3. Ресуспензируйте клетки в 10 мл средства роста и взять число ячеек.
  4. Алиготе от каждого пула для анализа ДНК контента через окрашиванию пропидий йодидом и потока гранулярных анализа 15.
    Примечание: Остальная часть каждого пула может быть использован для дальнейших экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная все клетки (3-4 x 108) были подвергнуты центробежные сцеживания и собраны в две мыть фракциях и двадцать основных фракций, как описано в протоколе. Таблица 1 показывает репрезентативных данных, где представлены общее количество клеток в каждой фракции, а также соответствующую скорость ротора. Общая доходность составила обычно более 80%. Измерение диаметра клеток в отдельных фракций подтвердил, что диаметр ячеек увеличилось с продвижением сцеживания (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали метод получения первичной все клетки в различных стадиях клеточного цикла, используя КЦВ. При оптимальных условиях по существу чисто населения клеток в фазе G1 и высокообогащенного популяция клеток в фазы G2/М могут легко быть получены отличные урожайности, и клеток в S фазе высокообогащенного также можно получить при желании. Представленные здесь результаты были получены с помощью один первичный, которые были получены все культуры (в частности, все-5) и по существу идентичные результаты с независимой культуры...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANISHA Котари в настоящее время в Департаменте клеточной и молекулярной биологии исследований больницы St. Jude Children.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана низ CA109821 (для TCC). Мы благодарим Beckman Coulter, щедро предоставляет средства для покрытия расходов на публикации и для оказания технической помощи в настройке и эксплуатации системы сцеживания. Мы благодарим д-р Фред Фалкенбург за предоставление первоначального начальных всех культур.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сбалансированный солевой раствор ХэнксаLonza10-508Q1 л флакон
Фетал плюс бычья сывороткаAtlas BiologicalsFP-0500-A500 мл флакон
2-наптол-6,8-дисульфоновая кислота дикалийная сольAcros Organics212-672-4100 г порошка
50 мл консиальные пробиркиDenville ScientificsC1062-P500/кейс
PES Мембрана 0,22 &микро; m фильтрующий блокMilliporeSLGP033RB250/пак
Avanti J-26S XPI с Elut. Без IVD - 50/60 Гц, 200/208/240 ВBeckman CoulterB14544центрифуга совместима с системой элютриации
JE 5.0 элютриатор роторкомплект Beckman Coulter356900комплект ротора, который включает в себя ротор, шестигранный ключ с Т-образной рукояткой, быстросъемный узел (без элютриационной камеры), анкерный кабель и стробоскоп в сборе Камера
, стандартный, 4 мл, "A"Beckman Coulter356943Стандартная элютриационная камера 
Насосная головка Masterflex L/S Easy-LoadCole-ParmerEW-07518-10
Masterflex L/S Частотно-регулируемый приводCole-ParmerEW-07528-10
Masterflex BioPharm Трубка для насоса из платинового отверждения, L/S 16Cole-ParmerEW-96420-16
25 G x 1,5 Игла прецизионного скольженияBD305127стерильная, одноразовая игла
10 мл Luer-Lok шприцBD309604стерильный, одноразовый шприц
Vi-Cell XRBeckman Coulter383556
буфер для окрашивания PI/RNазыBD Pharmingen550825пропидия йодида/РНКазы окрашивающий буфер
циклин B1 (GNS1) мышиный моноклональный антитело IgGSanta Cruz Biotechnologysc-245
циклин D1 (DCS-6) мышиный моноклональный антитело IgGSanta Cruz Biotechnologysc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR моноклональное антитело кроликаТехнология клеточной сигнализации8516s
GAPDH (14C10) моноклональное антитело кроликаТехнология клеточной сигнализации2118s
козье антимышиное IgG (H+L)-HRP конъюгатBioRad170-6516
козье антикроличьи антитела IgG (H+L)-HRP конъюгатBioRad170-6515

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al. Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda. FEBS letters. 587, 743-748 (2013).
  3. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat protoc. 8, 602-626 (2013).
  4. Banfalvi, G. Overview of cell synchronization. Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).
  5. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation. Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).
  6. Dulla, K., Margalef, A. S. Large-Scale Mitotic Cell Synchronization. Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).
  7. Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species. Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).
  8. Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat protoc. 3, 663-673 (2008).
  9. Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments. Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).
  10. Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. Synchronization of Yeast. Meth mol. 1524, 215-242 (2017).
  11. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).
  12. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell death diff. 19, 369-377 (2012).
  13. Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors. Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).
  14. Furst, R., Vollmar, A. M. A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment. Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).
  15. Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells. Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).
  16. Nijmeijer, B. A., et al. Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors. Exp hematol. 37, 376-385 (2009).
  17. Knudsen, E. S., Wang, J. Y. Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation. Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).
  18. Malumbres, M., Barbacid, M. Mammalian cyclin-dependent kinases. Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).
  19. Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1. Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).
  20. Sen, S., et al. Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).
  21. Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells. eLife. 4, (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

G1G2 M

Похожие статьи