Методическая статья

Развитие анализа высокое содержание количественной оценки совокупных формирования Sod1 Мутантный белок в живых клетках

DOI:

10.3791/56425

⸱

4 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Automation & Logistics Management, Screening Sciences & Novel Assay Technologies, Institut Pasteur Korea, 2School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, 3Technology Development Platform, Institut Pasteur Korea

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод количественного определения агрегации смятых протеинов. Наши детали протокола лентивирусные индуцированной стабильной клеток линии поколение, автоматизированных конфокальная томография и анализа изображений белка агрегатов. Как наглядные приложения мы изучали влияние малых молекул в продвижении SOD1 агрегата в зависимости от времени и дозы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Боковой амиотрофический склероз (ALS) является смертельным нейродегенеративных заболеваний, которые могут быть вызваны унаследованные мутации в гене кодирования медно цинковой супероксиддисмутаза 1 (SOD1). Структурная нестабильность SOD1 и обнаружение включений SOD1-позитивных больных семейная ALS поддерживает потенциальных причинную роль Протеолиз и/или агрегированных SOD1 ALS патологии. В этом исследовании мы описывают развитие на основе ячеек пробирного, разработанный высоким содержанием скрининг подходы для количественного определения динамики SOD1 агрегации в живых клетках. С помощью лентивирусные векторы, мы создали стабильных клеточных линий, выражая одичал типа и мутантов А4в SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок и обнаружил, что оба белки были выражены в цитозоле без каких-либо признаков агрегации. Интересно только SOD1 А4в стабильно выражена в ГЭС-293, но не в U2OS или SH-SY5Y клеточных линий, сформированы агрегаты на лечение ингибитором протеасом. Мы покажем, что это возможно для количественного определения агрегации, основанные на анализе различных ингибиторов протеасом доза реакция, а также отслеживать агрегат формирование кинетики, покадровой микроскопии. Наш подход предусматривает возможность количественной оценки эффект мутаций ALS на роль SOD1 в совокупных формирования, а также скрининга для малых молекул, которые мешают SOD1 А4в агрегации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Агрегации белков является биологический процесс, в котором денатурации белков группа вверх и может выступать в качестве возбудителей в нейродегенеративных заболеваний (амилоидоз). Характеризующие агрегации белка имеет важное значение в понимании роли агрегатов в клеточных дисфункции, также как и облегчение открытия новых факторов, которые влияют наступления патологии. Визуализация с тегами флуоресценции белков в живых клетках это мощный метод, который может помочь в развитии анализов, применимые к высоким содержанием скрининг (HCS)1,2,3,4.

Боковой амиотрофический склероз (ALS) рассматривается как proteopathic заболевания, вызванные наличием смятых протеинов с склонность к совокупности и накапливаются в двигательных нейронов в семье ALS (Фалс) и спорадические ALS (Салс)5,6 . Подмножество ~ 20% фалс случаев связаны с доминирующим мутации в гене кодирования цитозольной антиоксидантной фермента супероксиддисмутаза медно цинковой типа 17,(SOD1)8. Было предложено несколько возможных причин для этого генетически производных дисфункции, включая изменения в структуре и функции SOD1 вариантов, например аберрантных стабильности, увеличилась скорость развертки и склонность к совокупного9, 10. Примечательно свойство только проверенные и потенциально токсичных разделяют оба варианта связаны ALS SOD1 и SOD1 (WT) одичал тип является увеличение склонности агрегатов разобщенным белка или белковых включений11,12 . Протеолиз мутант SOD1, неизменно является polyubiquitinated и деградируют убиквитин протеасом системой. В результате низкий уровень ингибирование протеасом активности приводит к накоплению мутант, SOD1 объединяет13,14, какие формы аморфные структуры состоят из растворимых компонентов, которые могут обмениваться с растворимых мутант SOD1 в цитозоль15. В частности, SOD1 мутант А4в (аланина в кодон 4 изменено на валин) является наиболее распространенным ALS-вызывая мутации и приводит к быстрой нейродегенеративные с средний выживания время менее 2 лет после начала заболевания16. Биохимически SOD1 А4в имеет склонностях к monomerize, агрегировать и формируют амилоида поры; его поры, как агрегатов аналогичны амилоида поры других заболеваний, связанных мутантных форм, например α-synuclein и β-амилоида белка17. Для изучения динамики накопления SOD1-агрегат, методы мониторинга растворимых и нерастворимых SOD1 статистические формы по-прежнему разрабатываться.

Мы ранее показали, с использованием клеток и клеток ГЭС-293 временно transfected с флуоресцентный протеин тегами SOD1, ALS-связанные мутации ухудшить SOD1 димеризации и агрегации11. Хотя системы переходных выражения может дать полезную информацию о биологических результаты краткосрочных гиперэкспрессия генов, методы, обеспечивая стабильную интеграцию желаемого генов может быть предпочтительным для анализа развития. Таким образом лентивирусные векторы предлагают возможность придать экспрессии генов долгосрочный и регулируемых на клетки млекопитающих 18. В этом исследовании мы сосредоточены на создание стабильных клеточных линий, преобразованы с рекомбинантным человека, учитывая WT и мутант SOD1 отмеченных желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП). Использование изображений микроскопия живой клетки и автоматизированных количественной оценки SOD1 агрегации, мы вызвали и количественно SOD1 агрегации событий на ингибирование протеасом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. производство Лентивирусы

Примечание: производство и манипуляции лентивирусные векторы была проведена согласно национальных институтов здравоохранения (НИЗ) руководящие принципы для исследований с участием рекомбинантного ДНК. Плазмиды кодировку одичал типа и мутантов А4в SOD1 отмеченных расширение рекламы ЯФП (SOD1WT-рекламы ЯФП и SOD1A4V-рекламы ЯФП) описаны в Ким и др. 11 оба гена фьюжн продукты были усилены с помощью пары праймера PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′ и 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ и вставляется в pTRIP Дельта U3 ЦМВ плазмиды 19 с использованием XhoI и BsrGI места ограничения. В предыдущих экспериментах ГЭС 293T клетки были разделены в соотношении 1:4 до 1:6 каждые два дня. Недопущение более чем 20 ходов и поддержания клеток на менее 60% confluency помогает обеспечить хороший трансфекции эффективность.

  1. На 1 день, разбить ячейки ГЭС 293T в 30-40% слияния в пластине культуры ткани диаметром 10 см (3 х 10 6 клеток/блюдо) в 10 мл клеток питательной среды (DMEM высокой глюкозы с 10% FBS и 4 мм L-глютамин) для производства вирус.
  2. Держите культуры ткани диаметром 10 см пластины в инкубатор CO 2 (37 ° C, 5% CO 2) на ночь.
  3. На 2 день, приготовляют раствор трансфекции ДНК, содержащие 10 мкг лентивирусные векторы (pTRIP Дельта U3 ЦМВ - SOD1WT-рекламы ЯФП или - SOD1A4V-рекламы ЯФП) вместе с лентивирусные упаковка (плазмид (5 мкг pVSVg; 10 мкг pCMV-dR8.71) рисунок 2A) 20. 125 мкл CaCl 1 М 2 и отрегулировать громкость до 500 мкл, с использованием дистиллированной воды. Аккуратно добавить 500 мкл 0,05 М HEPES в смесь и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
  4. Средний с 10 мл подогретым свежей питательной среды антибиотик бесплатно смешивают с 1 мл раствора ДНК transfection клетки и инкубировать на ночь при 37 ° C, 5% CO 2 заменить ГЭС 293T и.
  5. На 3 день, замените ячейки супернатанта свежей питательной среды.
  6. На 4 день, урожай супернатант в 15 мл трубки и центрифуги для 5 мин на 500 g x, чтобы удалить отмершие клетки и мусора. Далее очищают супернатанта, проходя через фильтр 0,45 мкм с помощью большой 60 мл шприца. Сразу же обойтись в одноразовых аликвоты (300 мкл) и хранить при температуре-80 ° C. Для поддержания максимальной продукт деятельности, избежать цикла замораживания оттаивания.

2. Лентивирусные трансдукции

  1. разделить ячейки линии, чтобы быть заражены при впадении в 60% (ГЭС-293 клетки и SH-SY5Y; 5 x 10 5 ячеек на колодец и U2OS; 1 х 10 5 ячеек на хорошо) в пластине 6-ну тканевой культуры в 2 мл DMEM СМИ дополнена 10% FBS.
  2. Держать пластину 6-ну тканевой культуры в инкубаторе 37 ° C на 5% CO 2 на ночь.
  3. Удалить замороженных человека из морозильной камеры-80 ° C и разморозить Алиготе на льду перед каждым использованием; не заморозить.
  4. В то время как вирус оттаивания, теплый клеток питательной среды, содержащий сыворотку, совместимый с линией клеток интерес. Как только вирус полностью разморозить, подготовить широкий спектр разведений (1:3, 1:10, 1:30 и 1: 100) в DMEM в свежий 1,5 мл отцентрифугировать.
  5. Воспитывать тома в тубах по 1 мл с сокращение сыворотке СМИ.
  6. Добавить 2 мкл Полибрен (в наличии 4 мкг/мкл) по 1 мл вирус/средства массовой информации. Смешайте хорошо закупорить и добавить 1 мл смеси в клетки. Инкубировать клетки с вирусом за 24 ч.
  7. Удалить вирус СМИ и заменить с нормальной среде DMEM СМИ с 10% FBS. Сохранить клетки при 37 ° C, 5% CO 2.
  8. Контролировать рост клеток и изменить культуру СМИ каждые два дня. В месте слияния, разверните 6-ну блюдо в плиту культуры ткани диаметром 10-см.
  9. После того, как клетки достаточно расширены, семя 1,5 х 10 4 клетки на скважину в 50 мкл DMEM СМИ на 384-ну пробирного пластины, чтобы проверить уровень экспрессии рекламы ЯФП меткой белка при микроскопии. Если рекламы ЯФП меткой выражение протеина клетки показывает отношение сигнал шум ≥ 3, подготовиться в соответствующей строке ячейки сотовый фондовой.

3. Время зависит от влияния ингибитором протеасом на агрегации белков

Примечание: выполнить получение изображения с помощью автоматизированных микроскопа (см. материалы).

  1. Лунки 0,25 мкл ингибитора ДМСО или протеасомы, растворенного в 100% ДМСО (ALLN, 2 мм) на 384-ну плоское дно тарелки.
  2. Вручную семян 1,5 х 10 4 клетки на скважину в 50 мкл DMEM СМИ на том же пробирного пластины. Конечная концентрация ингибитора (ALLN) протеасомы должно быть 10 мкм.
  3. Настроить блок экологического управления системы микроскопа до 37 ° C и 5% CO 2. Скриншот экспериментальной установки показана на рис. 3.
  4. Работают микроскопа в широком поле флуоресценции режиме, с использованием программного обеспечения со следующими параметрами: LWD 20 X цель, не конфокальная режим, 4 поля/Ну, с интервалом захвата час. В конце каждого запуска, захваченные изображения будут автоматически загружены на сервер.

4. Время перерыва изображений для рекламы ЯФП выражение в живых клетках и изображение анализа (одноканальный)

Примечание: следующие шаги описывают применение программного обеспечения (например, Колумб).

Алгоритм
  1. выбрать соответствующий сегмент первичных объектов (цитозоле и агрегатов). При необходимости, настроить параметры порога и контраст фона ( рис. 4).
  2. Количество клеток с помощью ' найти клетки ' с индивидуального порога 0,1 для рекламы ЯФП интенсивности канала. Определить агрегаты с использованием ' найти пятна ' алгоритм с относительной интенсивностью рекламы ЯФП пятно > 0,2 и разделения коэффициент 1.0.

5. Доза-ответ эффект ингибиторов протеасом на агрегации белков на живые клетки, витражи для их ядер (два канала)

Примечание: выполнить получение изображения с помощью автоматизированных микроскопа. Определить диапазон концентраций протеасом ингибиторы (ALLN, Epoxomicin и MG132), на основе ожидаемого значения 50 IC для обеспечения оптимальной кривой нужным.

  1. Подготовить серийных разведений соединений на 384-ну хранения полипропилена пластины в стандарте серии разбавления 1:3. Убедитесь в том смешать составные разведений хорошо для обеспечения правильности соединения концентрации.
  2. Лунки 0,25 мкл протеасом ингибиторов на пустой плоскодонные черный 384-ну пробирного пластины. Мы используем жидкие обработчик оснащен 384-капиллярная головкой, способный передавать томов.
  3. Семя 1,5 х 10 4 клетки на скважину в 50 мкл DMEM СМИ на пробирного пластины. Инкубировать пробирного пластин при 37 ° C и 5% CO 2 за 24 ч.
  4. 10 мкл DMEM СМИ (предварительно нагревают при 37 ° C) с окрашивание раствора (Hoechst 33342 на бирже 10 мг/мл) и инкубации при комнатной температуре за 10 мин.
  5. Запуск микроскопиипреодоления эксплуатации программного обеспечения. Скриншот экспериментальной установки показана на рисунке 6. Выберите " конфигурации " и выберите 20 X цель и правильный пластинчатого типа. Обеспечение " воротник " присваивается правильное значение на цели, позволяя надлежащего внимания с различными пластины типов.
  6. Выберите " Микроскоп " вкладка определение воздействия 1 как рекламы ЯФП (488 лазер) и воздействия 2 как Hoechst (405 лазер). Активируйте фильтр на обоих воздействия и назначить воздействия 1 камеры 1 и 2 подверженности камеры 2. Задать время экспозиции для ~ 800 мс для воздействия 1 и ~ 40 мс для экспозиции 2.
    7. Воздействие
  7. выберите 1. Задать высоту фокуса для 0 мкм. Выберите " фокус ". После того, как целенаправленной, разоблачить камеры 1. Отрегулируйте высоту фокус для оптимизации воздействия плоскости и нажмите на " взять высоту ". Измените время экспозиции и мощность дать максимальный пиксель интенсивности ~ 3000 лазера. Сохраните параметры экспозиции. Повторите эти действия для экспозиции 2.
  8. Выберите " эксперимент определение " вкладка Создание макета и sublayout. Перетащить соответствующий макет, экспозиции, эталонный образ, файл skewcrop и sublayout. Сохранить эксперимент.
  9. Выберите " автоматическая эксперимент " вкладке и приобрести изображений. В конце каждого запуска, захваченные изображения будут автоматически загружены на сервер.

6. Изображение анализ двух изображений канал

  1. выберите программный алгоритм для сегментирования первичных объектов (ядер, цитозоле и агрегатов) ( Рисунок 7).
  2. Выберите метод, который позволяет разбить ядер точно путем визуального осмотра сегментирована объектов. "Хёхст" окрашенных объектов в канале 1 (Ch1) будет использоваться для определения количества клеток. Пятнать рекламы ЯФП от мутантов, SOD1-А4в на канале 2 (Ch2) будет использоваться для определения количества агрегатов.
  3. Количество клеток с использованием ' найти ядер ' алгоритм как Hoechst окрашивание регионов > 20 мкм 2, с коэффициентом Сплит 7.0, индивидуальный порог 0,40 и контраст > 0.10.
  4. Создания таблицы данных и определить ЕС 50 для каждого из соединений, используя ' Non линейная регрессия ' уравнение графического программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание стабильной клеточной линии с помощью человека: Общая стратегия для мониторинга SOD1 белка агрегатов иллюстрируется на рисунке 1. В качестве первого шага мы создали вектор лентивирусные выражение для доставки стабильного гена SOD1 в клеточных линиях (шаг 1). Два лентивирусные векторы кодирования с тегами рекламы ЯФП WT SOD1 и SOD1 А4в (SOD1WT-рекламы ЯФП и SOD1A4V-рекламы ЯФП, соответственно) с упаковки и конверт плазмид были подготов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует два основных подхода для создания стабильных клеточных линий. Первый занимает несколько недель и требует переходных transfection и сопротивления выбор векторов геномной интегрированной плазмида ДНК. Второй занимает всего несколько часов с помощью Лентивирусы, что делает этот протокол поддаются эффективной выражения целевого белка в несколько клеточных линий с ограниченными усилиями. Путешествие-ЦМВ вектор19 был устойчивый вектор для использования, с эффективностью сохранены трансдукция ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов, финансируемая правительством Кореи (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) и Национальный фонд исследований Кореи (NRF) программы поддержки индивидуальных ученый (СР 2013M3A9B5076486/СР 2015R1D1A1A09057239).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ALLN (C20H37N3O4)Millipore208719
MG132 (C26H41N3O5)Sigma-AldrichC2211
Epoxomicin (C 28H50N4O7)Sigma-AldrichE3652
Hoechst 33342InvitrogenH-3570
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Opera EvoShell программное обеспечениеPerkin ElmerVer 1.8.1
OperettaPerkin ElmerOPRT1288
Harmony Imaging softwarePerkin ElmerVer 3.0.0
Columbus Image analysis softwarePerkin ElmerVer 2.3.2
CyBi Hummingwell для работы с жидкостямиCyBio AGOL 3387 3 0110

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
  2. Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  3. Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
  4. Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
  5. Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
  6. Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
  7. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
  8. Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
  9. Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
  10. Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
  11. Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
  12. Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
  13. Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
  14. Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
  15. Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
  16. Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
  17. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  18. de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
  19. Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
  20. Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
  21. Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
  22. Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
  23. Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
  24. Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SOD1HEK 293

Похожие статьи