Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сверхэкспрессия и очищение человека Cis -пренилтрансфераза в Escherichia coli

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

3 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Простой протокол для сверхэкспрессии и очистки оптимизированной кодоном, цис- пренилтрансферазы человека, в неденатурирующих условиях, от Escherichia Coli , а также анализ ферментативной активности. Этот протокол может быть обобщен для производства других цис- prenyltransferase белков в количестве и качестве пригодных для механистических исследований.

Аннотация

Пренилтрансферазы (ПТ) представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) посредством многочисленных реакций конденсации. DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- PT (образующий цис- двойные связи из реакции конденсации), который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP). DHDDS имеет биомедицинское значение, поскольку неконсервативная мутация (K42E) в ферменте приводит к пигментной ретиниту , что в конечном итоге приводит к слепоте. Поэтому настоящий протокол был разработан для получения большого количества очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований. Здесь использовалось использование белкового синтеза, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в цис- ПТ среди разных видов предполагает, что этот протокол может быть применен и для других эукариотических цис- ПТ, таких как те, которые участвуют в синтезе натурального каучука.

Введение

Пренилтрансферазы представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) с помощью многочисленных реакций конденсации 1 , 2 . Ферменты Z-типа катализируют образование цис- двойных связей из реакции конденсации, тогда как ферменты E-типа катализируют образование транс- двойной связи 3 . Цис- Пренилтрансферазы ( цис- PT, ферменты Z-типа) классифицируются классически по их длине цепи продукта в короткоцепочечные (C 15 ), среднецепочечные (C 50-55 ) и длинноцепочечные (C 70-120 ) 4 . DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- ПТ, который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP) 1, 5 , 6 . Это приводит к образованию дегидродолихилдифосфата, полифенилдифосфата C 55-100, служащего в качестве предшественника доличилпирофосфата, молекулы гликозильного носителя, участвующей в N-связанном гликозилировании белка 1 . Среди ашкеназских евреев миссенс-неконсервативная мутация (K42E) в DHDDS приводит к пигментной аутосомно-рецессивной ретинитации 7 , 8 . Поэтому настоящий протокол был разработан для получения очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований.

Escherichia coli считается наиболее удобным и экономически эффективным хозяином для экспрессии рекомбинантного белка и, следовательно, также является наиболее часто используемым хозяином. Однако, когда вы пытаетесь гетерологично сверхэкспрессировать белки в E.coli , необходимо учитывать специфичные для белка соображения. Получение правильно сложенных, активныхE рекомбинантных белков из E.coli , не является простым делом из-за различий в свойствах различных белков. Для преодоления этих препятствий были разработаны многочисленные подходы. Здесь использовалось использование белка, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в E. coli . Следует отметить, что предыдущая попытка сверхэкспрессировать дрожжи cis- PT без слияния белка оказалась неудачной из-за полной нерастворимости даже в присутствии детергента 12 . Описанный протокол прост, экономичен, экономит время и позволяет получать препараты DHDDS, подходящие для механистических исследований. Учитывая гомологию цис- ПТ среди разных видов, мы предлагаем, чтобы этот протокол можно было применять и для других эукариотических цис- ПТ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клонирование цис- PT для сверхэкспрессии в E. coli

  1. Получение вектора экспрессии рЕТ-32b, предназначенный для экспрессии и клонирования высокого уровня белковых последовательностей , слитых с белком 17 109aa тиоредоксина (TRX) и E.coli , кодон-оптимизированным 18 последовательностью полной длиной цисом -pt кодирования.
  2. Позаботьтесь , чтобы иметь TEV-протеазы (табак вируса травление протеазы) сайт расщепления (ENLYFQ / G, где «/» указывает точку расщепления) 9 с последующим коротким гибким линкером (SGSGSG, чтобы улучшить сайт расщепления доступности) вверх по течению цис -PT ( рисунок 1 A ). Кроме того, добавьте подходящие 5 'и 3' сайты рестрикции для клонирования.
  3. Клонировать синтезированную ДНК-конструкцию в вектор pET-32b с использованием стандартных методов лигирования 10 .

2. OverexpreSsion DHDDS человека в E. coli

  1. Transform E. coli T7 экспрессирует компетентные клетки с TRX-гибридной конструкцией DHDDS в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Платируйте трансформированные клетки в соответствии с инструкциями изготовителя на LB-агаре в условиях селективности ампициллина (200 мг / л).
  3. Инокулировать выбранные колонии в 100 мл среды LB в 250 мл колбах стартовых культур с 100 мг / л ампициллина и инкубировать в течение ночи при 37 ° С с постоянным встряхиванием при 200 об / мин.
  4. Инокулируют 80 мл культуры в две 5-литровые колбы (40 мл на колбу), каждая из которых содержит 1,5 л среды 2x YT (16 г / л триптона, 10 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / л NaCl) со 100 мг / L ампициллин.
  5. Инкубируйте культуру при 37 ° C с постоянным встряхиванием при 180 об / мин до достижения OD 600 нм = 0,5.
  6. Снижают температуру до 16 ° C и индуцируют клетки путем добавления 0,5 мМ изопропил -D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). ПротивКолючую инкубацию при таком же условии в течение 16-20 ч для экспрессии белка.
  7. Убирают клетки центрифугированием (10 000 x g в течение 10 мин).
    Примечание: протокол может быть приостановлен здесь; Гранулы клеток следует хранить при -80 ° С до очистки.

3. Очистка DHDDS человека

  1. Ресуспендируют клетки в буфере А (25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 мМ β-меркаптоэтанола), 1 мкг / мл ДНКазы I и смесь ингибиторов протеазы.
  2. Гомогенизируют клетки, используя стекло-тефлоновский гомогенизатор.
  3. Нарушать клетки с использованием микрофлюидизатора или эквивалента при 12000-15000 фунтов на квадратный дюйм 11 .
  4. Центрифугируют клеточный лизат при 40 000 мкг в течение 45 мин при 4 ° С. Восстановить супернатант, содержащий растворимую фракцию.
  5. Нагрузка супернатантов на 5 с - 10 мл кобальта иммобилизованным металлом аффинной хроматографии (Со 2+ -IMAC) 12 колонки с 10ММ имидазола с последующей тщательной промывкой буфером А и 10 мМ имидазолом для уменьшения неспецифического связывания белка.
  6. Элюируйте сверхэкспрессированные белки буфером А, дополненным 250 мМ имидазолом.
  7. Удалите имидазол, используя 53 мл препаративной колонны обессоливания, уравновешенной буфером А.
  8. Добавить 6xHis-tagged TEV-протеазу (протеин на 1 мг TEV на 50 мг белка) в элюированные белки для удаления их 6xHis-меченного слитого белка TRX при 4 ° C в течение ночи.
  9. Загрузите расщепленные белки на колонку Co 2+ -IMAC, уравновешенную буфером А, дополненным 5 мМ имидазолом, для удаления расщепленного 6x His-меченного слитого белка TRX и протеиназы TEV.
  10. Собирают поток и концентрируют до 3-4 мл, используя центробежный фильтр с молекулярной массой 30 кДа.
  11. Загрузите концентрированный белок в колонку с эксклюзионной хроматографией размера Superdex-200, уравновешенную буфером А для окончательной очистки. Белок элюируется как димер (~ 76 кДа).
  12. Выберите соответствующие фракции, сравнив профиль элюирования с кривой калибровки столбца.
  13. Оцените чистоту препарата с использованием SDS-PAGE.
  14. Определите концентрацию белка, необходимую для последующих экспериментов и флеш-замораживающих аликвот очищенных концентрированных белков в жидком азоте и хранить при -80 ° C до использования.

4. Аналитическая гамма-хроматография (SEC)

  1. Чтобы обеспечить способность белка выдержать циклы замораживания-оттаивания, оттереть аликвоту замороженных белков и центрифугировать при 21000 × g в течение 10 минут для удаления нерастворимых агрегатов. Соберите супернатант.
  2. Загрузите белки в аналитическую колонку Superdex-200, предварительно уравновешенную 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 мМ β-меркаптоэтанола, используя ультраэффективную жидкостную хроматографическую систему 13 , 14 .
  3. Монитор триптофанового гриппа(Λ ex = 280 нм, λ em = 350 нм) для выявления элюирующего профиля элюирования белков. Убедитесь, что у вас есть допустимая калибровочная кривая для оценки молекулярной массы - такие кривые доступны через производителей столбцов SEC.

5. Кинетика фермента - зависящая от времени активность 15 , 16 , 17

  1. Чтобы обеспечить активность очищенного белка, смешайте 5 мкМ очищенного DHDDS с 10 мкМ FPP и 50 мкМ 14 C-IPP, чтобы инициировать реакцию в буфере A с 0,5 мМ MgCl 2 при 22-30 ° C.
    Примечание. Точные условия реакции могут варьироваться в зависимости от препаратов цис- ПТ, отличных от DHDDS. Более того, активность DHDDS также зависит от температуры и [Mg 2+ ].
    Осторожно: 14 C-IPP является радиоактивным и должен использоваться в соответствии с местными правилами радиационной безопасности.
  2. Извлеките 15 мкл образцов из реакции в течение 0, 2, 4 и 6 часов после немедленного гашения реакции добавлением 15 мкл буфера А, дополненного 20 мМ ЭДТА (до конечной концентрации 10 мМ ЭДТА).
  3. Добавьте 1 мл H 2 O-насыщенного 1-бутанола и вихря тщательно, чтобы получить продукты реакции.
    Примечание. Протокол можно остановить здесь, и образцы можно сохранить для последующего чтения.
  4. Добавить сцинтилляционный коктейль к образцам и, используя сцинтилляционный счетчик, количественно обработать продукты реакции в бутанольной фазе, охватывающей 14 С, вместе с радиоактивностью 15 мкл из реакционной смеси, представляющей полную радиоактивность.
  5. Вычтите отсчеты фона, измеренные с использованием отсчетов 0 h с каждой временной точки, и рассчитайте процент использования 14 C-IPP.
  6. Вычислить сетевое включение 14 C-IPP в каждый момент времени путем вычисления процента, используемого из общего количества 14 C-IPP, и график результатов в зависимости от времени. Ожидается увеличение количества включений 14 C-IPP со временем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий обзор используемой здесь конструкции и процесса очистки показан на рисунке 1 . Образцы, полученные на каждой стадии очистки, показаны на фиг. 2 . Этот анализ SDS-PAGE показывает ступенчатую очистку DHDDS, в результате чего получают высокоочищенный продукт. На рисунке 3 показаны результаты аналитической SEC очищенного фермента, показывающие, что этот белок наблюдается только как гомодимер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь для очистки функциональных человеческих DHDDS в клетках E. coli, прост и эффективен, что позволяет сверхэкспрессировать и очищать белок через 3-4 дня после того, как имеется подходящая конструкция. Такие протоколы для очистки белка имеют особое значение, учитывая прорывы в секвенировании генома, которые предоставляют множество информации о генетике многих заболеваний 18 , тем самым требуя разработки высокопроизводительных методов для характеристики патогенных ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Центром научно-исследовательского совершенства Израиля (I-CORE) в области структурной клеточной биологии (1775/12), а Научный фонд Израиля предоставил 1721/16 и 2338/16 (YH) и 825/14 (DK ). Поддержка Фонда Fields Estate DK высоко ценится. Эта работа была выполнена Иланом Эдри и Михалом Голденбергом в частичном выполнении требований МД на медицинском факультете Саклера Тель-Авивского университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express  lysY  Компетентный  E. coli  (Высокая эффективность)NEBC3010I
cOmplete, коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТАRoche11873580001
смолой TALON-superflowGE Healthcare28-9574-99
HiPrep 26/10 обессоливающая колонна GE Healthcare17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Healthcare28989335
superdex-200 увеличивают 5/150 GL GE Healthcare28990945
14C-изопентенилпирофосфатPerkin-ElmerNEC773050UC 
транс,транс-фарнезилпирофосфатSigma44270-10MG

Ссылки

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

DHDDSSDS PAGE
Сверхэкспрессия и очищение человека Cis -пренилтрансфераза в Escherichia coli
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.