Method Article

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол к точно quantitate белки с Изобарический маркировки, обширные фракционирования, Биоинформатика инструменты и меры контроля качества в сочетании с жидкостной хроматографии, сопряжена с высоким разрешением масс-спектрометр.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие исключительные успехи в масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики, с конкретного технического прогресса в жидкостной хроматографии (LC) в сочетании с тандем масс-спектрометрия (LC-MS/MS) и изобарических маркировки мультиплексирования потенциала. Здесь мы представляем глубоко протеомики профилирования протокол, который сочетает в себе 10-plex тандем массового тег (ТМТ) маркировки с обширной платформой LC/LC-MS/MS и исправление после МС вычислительной вмешательства точно quantitate весь протеомов. Этот протокол включает следующие основные шаги: белка добычу и пищеварение, TMT маркировки, двухмерный (2D) LC, с высоким разрешением масс-спектрометрии и вычислительной обработки данных. Контроль качества шаги включены для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Более чем 10 000 белки в млекопитающих образцы можно уверенно предел с настоящим Протоколом. Этот протокол также может быть применен к количественный столб-поступательные изменения с незначительными изменениями. Этот мультиплексированных, надежный метод предоставляет мощный инструмент для протеомного анализа в различных сложных проб, включая культуру клеток, тканей животных и человека клинических образцов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в технологии секвенирование нового поколения привели к новый ландшафт для изучения биологических систем и болезни человека. Это позволило большое количество измерений генома, транскриптом, протеом, метаболом и других молекулярных систем станет ощутимым. Масс-спектрометрия (МС) является одним из наиболее чувствительных методов в аналитической химии, и его применение в протеомике быстро расширилась после секвенирования генома человека. В области протеомики за последние несколько лет были достигнуты крупные технические достижения в основе MS количественного анализа, включая Изобарический маркировки и мультиплексирования возможности в сочетании с обширной жидкостной хроматографии, помимо инструментария авансы, позволяя быстрее, более точные измерения с меньше материала образца требуется. Количественные протеомике стали основной подход для профилирования десятки тысяч белков и Посттрансляционная модификаций в весьма сложных биологических образцов1,2,3,4 , 5 , 6.

Мультиплексированных Изобарический обозначая методы, такие как Изобарический тег для относительной и абсолютной количественный (например, iTRAQ) и тандем массового тег (ТМТ) MS значительно улучшили образца пропускной способности и увеличил количество образцов, которые могут быть проанализированы в отдельном эксперимент1,6,,78. Наряду с другими на основе MS количественный методы например метка бесплатно количественный и стабильных изотопов, маркировки с аминокислоты в культуре клеток (например, SILAC), потенциал этих методов протеомики поле является значительным9 ,10,11. Например метод ТМТ позволяет 10 образцы протеина, чтобы быть проанализированы вместе в 1 эксперимент с использованием 10-plex реагентов. Эти структурно идентичны TMT теги имеют той же общей массы, но тяжелые изотопы распределяются дифференцировано на атомы углерода и азота, обусловило уникальный репортер Ион во время МС/МС фрагментации каждого тега, тем самым позволяя относительной количественный между 10 образцов. TMT стратегия обычно применяется для изучения биологических пути, прогрессирования заболевания и клеточных процессов12,,1314.

Значительные технические усовершенствования улучшили жидкостной хроматографии (LC)-MS/MS систем, как с точки зрения LC цветоделение и MS параметры, чтобы максимизировать идентификации белок без ущерба для точности количественный. Разделение первом измерении пептидов путем разделения технику с высоким ортогональности для второго измерения имеет решающее значение в этом типе метода протеомики ружье для достижения максимальных результатов20. Высоком рН обратная фаза жидкостной хроматографии (RPLC) обеспечивает лучшую производительность, чем обычных сильных катионообмен хроматографии20. При высоком рН RPLC сочетается с второго измерения низкого pH RPLC, аналитический динамический диапазон и белка охват улучшаются, результате способность определить основную часть выраженных белков при выполнении всего протеома анализы15 ,16,17,18. Другие технические достижения включают в себя мелкие частицы C18 (1.9 мкм) и продлил длинный столбец (~ 1 м)19. Кроме того другие заметные улучшения включают в себя новые версии масс-спектрометров с быстрого сканирования ставки, улучшена чувствительность и резолюции20и сложные биоинформатики трубопроводов для интеллектуального анализа данных MS21.

Здесь мы описываем подробный протокол, который включает в себя самые последние методики с изменениями для повышения чувствительности и пропускную способность, сосредоточив внимание на механизмы контроля качества на протяжении всего эксперимента. Протокол включает извлечения белков и пищеварение, TMT 10-plex маркировки, базовых pH и рН RPLC фракционирования, с высоким разрешением MS обнаружения и обработки данных MS (рис. 1). Кроме того мы осуществляем несколько этапов контроля качества для диагностики и оценки экспериментальной вариации. Этот подробный протокол призван помочь исследователям новые на местах регулярно выявлять и точно quantitate тысячи белков от lysate или ткани.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

внимание: перед использованием обратитесь все соответствующие паспорта безопасности (т.е., MSDS). Пожалуйста, используйте все практики безопасности при выполнении настоящего Протокола.

Примечание: в настоящем Протоколе для протеома количественный 10 образцов используется набор реагент Изобарический метка 10-plex TMT.

1. Подготовка клеток/тканей

Примечание: очень важно для сбора образцов в минимальное время при низких температурах держать белков в их исходном состоянии биологического.

  1. Мыть адэрентных клеток (например, клетки ГЭС 293) на 10 см пластины дважды с 10 мл льда холодной фосфат амортизированное saline (PBS). Скрип и собирать клетки (~ 2 x 10 6 клеток) в 1 мл ФСБ. Передача для 1.5 мл пробирок и удалить PBS после центрифугирования в 600 x g за 5 мин при 4 ° C. хранить клетки окатышей на-80 ° C до лизис.
    Примечание: Часто эксперимент выполняется для изучения белков урожайности. Примерно в 1 мг белков может быть извлечено от 10 х 10 6 клеток млекопитающих или от 15 см пластины с 80% слияния.
  2. В качестве альтернативы, лизируют адэрентных клеток на их пластине, добавив буфера lysis непосредственно к плите после стирки. Собирать лизатов в 1,5 мл пробирок и использовать описание протокола на шаге 2.5.
  3. Сбор подвеска клетки в 15 мл пробирок, мыть дважды с 10 мл холодного льда PBS, перевести в 1,5 мл пробирок и центрифуги на 600 x g для удаления PBS. Удалите из мыть шаги полностью поддерживать нужную концентрацию ингредиентов буфера lysis PBS. Хранить клетки окатышей на-80 ° C до лизис.
  4. Собирать и весят тканей быстро. Держите ткани в жидком азоте сразу после вскрытия и хранить на -80 ° C.
    Примечание: Урожайность белка тканей-примерно 5% до 10% массы ткани
  5. использовать размеры однородных тканей и анатомических областей для 10 образцов для уменьшения образца неоднородности. Удалять загрязнение крови промыв образцы дважды с 1 мл раствора лед холодной PBS избежать белки очень обильные крови белка количественный и данных анализа.

2. Извлечения белков, контроля качества западный Blotting, пищеварение в решение и обессоливания пептида

Примечание: обработка каждого из 10 образцов так же на любом этапе до объединения TMT-меченых образцов имеет важное значение для уменьшения Вариация.

  1. Сделать литического буфера (50 мм HEPES [рН 8,5], мочевина 8 М и 0,5% Дезоксихолат натрия) в день эксперимента.
    Примечание: Денатурации белков частично во время выборки лизис влияет на эффективность переваривания белка.
  2. Добавить лизис буфера так, что отношение буфера объем образца составляет 10:1 и ~ 20% от окончательного объема стеклянных шариков (диаметром 0.5 мм) гранулы клеток или тканей (например, соотношение 10: 1 объем буфера и образцы) для достижения окончательного белка концентрацию 5 до 10 мг/мл. Держите все 10 образцов такой же концентрации, учитывая количество ячеек, которые используются или ткани вес каждого образца.
  3. Поддерживать концентрацию мочевины на 8 М, добавив твердой мочевины в образце. Не забудьте рассмотреть объем Пелле клетки или ткани, при расчете размера твердых мочевины для добавления образца для достижения концентрации 8 М.
    Примечание: ООН свежие мочевины буфер можно ввести искусственные химические модификации (то есть, белок carbamylation) и негативно влияет на количество выявленных пептидов. Мочевина занимает значительный объем (100 мг мочевины занимает ~ 73 мкл в растворе).
  4. Держать нерастворимых мусора в lysate разрешить пищеварение нерастворимые белки 23.
  5. Лизируйте образцы в блендер на 4 ° C на скорости 8 для 30 s, остальные 5 s, и повторите 5 раз или до тех пор, пока гомогенизированных образцов. Образцы также могут быть лизированы, vortexing для 30 s при комнатной температуре (RT) с 30 s, охлаждение период на льду для ~ 10 циклов. Отрегулируйте лизис условий в случае необходимости, в зависимости от типа образца.
  6. Смесь lysate хорошо без центрифугирования и сделать 2 малых аликвоты (~ 15 мкл). Используйте 1 Алиготе для измерения концентрации протеина и 1 Алиготе для выполнения проверки позитивного управления, выполняя Западный анализ помаркой. Храните остальные большие Алиготе для анализа протеомики.
  7. Измерения концентрации протеина assay количественный стандарт протеина или окрашенных Кумасси короткие натрия Додециловый сульфат геля полиакриламида (10%) 22 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) как стандарт. Используйте стандартный BSA с высокой степенью точности известной концентрации. Для достижения высокого уровня точности, выполнить анализ аминокислоты стандарта BSA.
    Примечание: Другие точные стандарты могут быть доступны. Концентрация белка также может быть оценена путем числа клеток или тканей весов. Хотя рекомендуется 1 мг белка (100 мкг/образец), анализ может выполняться с как 100 мкг белка (10 мкг/образец).
  8. Добавить 100% Ацетонитрил (ACN) для достижения конечной концентрации 10% АКС и LysC протеазы на фермент субстрат соотношение 1: 100 (w/w) переваривать белки под высоко денатурации условий в РТ за 2 ч 1. Добавить Дитиотреитол (DTT) до конечной концентрации 1 мм для уменьшения дисульфидными облигаций в белках и инкубировать 1 h. выполняют LysC пищеварение в конечной концентрации мочевины 7,2 М.
  9. Разбавления проб до 2 М мочевины с 50-мм HEPES (рН 8,5) и далее дайджест с трипсина на RT 3 часа или на ночь на трипсина белка соотношение 1:50 (w/w). Использование примерно 2 мкг трипсина 100 мкг белка и концентрация трипсина приблизительно 10 нг/мкл.
    Примечание: Факторы, которые могут привести к неэффективной трипсина пищеварение являются вопросы рН, неактивные трипсина или использование ненадлежащее отношение фермента в субстрат.
  10. Добавить DTT дают 1 мм и дальнейшему сокращению пептиды для 2 ч на RT.
  11. Добавить iodoacetamide (IAA) для достижения 10 мм. Инкубируйте 30 мин в темноте, чтобы алкилата Cys содержащих пептидов на RT.
  12. Утолить непрореагировавшего IAA, добавив DTT до достижения 30 мм и Инкубируйте 30 мин на RT.
  13. Проверить эффективность Пищеварение трипсина путем изучения небольших Алиготе каждого образца. Опреснения с помощью кончика пипетки 10 мкл хроматографии СМИ, встроенных в Мертвое пространство, по словам производителя ' протокол s. Анализировать каждый образец, LC-MS/г-жа LC-MS/MS параметры такие же, как в шаге 5, за исключением, что градиент составляет 10 мин 23.
  14. Выполнить поиск базы данных MS необработанных данных (см. более подробно в шаге 6) с помощью 4 пропущенных разобщенность как параметр поиска.
    Примечание: Если количество пропущенных разобщенность это > 10%, это может свидетельствовать о пищеварении трипсина неполной. Это отрицательно скажется на течению результаты. Это шаг критического контроля качества (QC).
  15. Дайджест образцы снова, если пропустил расщепление > 10% путем добавления дополнительных 10 мкл трипсина образцы.
  16. Подкисляет образцы, добавив trifluoroacetic кислоты (ТФК) для достижения концентрации 1%. Измерение pH с помощью РН газа. Убедитесь, что pH ставкимежду 2 и 3. Добавить больше TFA падение мудрым (1 мкл) при необходимости вплоть до достижения правильного pH.
  17. Центрифуг в 20000 x g в РТ за 10 мин и собирать супернатант.
  18. Мыть 0,5-60 мкг потенциала спин столбцов, содержащих C18 реверс фазы смолы с 0,25 мл метанола при использовании 100 мкг образцов. Вымойте 0,03 до 30 мкг потенциала спин столбцы с 0,25 мл 60% TFA ACN/0.1% при использовании 10 мкг образцов. Центрифуга спин столбцы в 500 g x 30 s.
  19. Сбалансировать столбцы с 0,5 мл 0,1% TFA и удалить центрифугированием на 500 x g 30 s.
  20. Загрузить образцы по столбцам и связывать столбцы образцов центрифугированием на 100 g x 3 мин, или до тех пор, пока все образца прошло через колонку.
  21. Добавить 0,5 мл 0,1% TFA столбцы и центрифуги на 500 x g 30 s.
  22. Добавить 125 мкл 60% TFA ACN/0.1% для каждого столбца и элюировать центрифугированием при 100 x g на 3 мин обеспечить, чтобы все решения прошло через колонку.
  23. Сухой eluents в вакуумной концентратор. Убедитесь, что образцы полностью сухой и не жидкость остается в трубах. Хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего анализа.

3. TMT маркировки пептиды

Примечание: очень важно обеспечить, что все образцы полностью обозначены TMT реагентов. TMT маркировки эффективности, который негативно повлияет все ниже по течению результаты могут влиять несколько факторов (например, количество TMT замотают, рН и точность белка количественный).

  1. Воссоздать каждый образец обессоленной пептида в 50 мкл буфера HEPES 50 мм (рН 8,5). Проверьте pH и убедитесь, что он находится между 7 и 8.
    Примечание: Образец может быть кислой, если не полностью высушить после опреснительной шаг, который будет влиять на эффективность маркировки.
  2. Держать ~ 1 мкг каждого немеченого образца для последующих TMT маркировки эффективности теста, как описано в шаге 3.3.
  3. Распустить TMT реагентов в безводный АКС и ярлык пептид образцы, следуя производитель ' s инструкции. Инкубировать реагентов в РТ за 1 ч.
  4. Тест КК TMT маркировки эффективности, опреснительные ~ 1 мкг каждого TMT-помечены и - неподписанных образца с помощью 10 мкл наконечники с встроенных хроматографии СМИ по данным производителя ' протокол s. Анализировать образцы TMT-меченых и немеченого по LC-MS/г-жа
    Примечание: LC-MS/MS параметры такие же, как и раздел 5, за исключением, что градиент — 10 мин
  5. Изучать необработанные данные, чтобы убедиться, что немеченого пептиды не обнаруживаются в обозначенные образцах, обеспечения полной эффективности маркировки ( рис. 2). Делайте это в течение 6-10 отдельные пептиды для проверки эффективности маркировки.
  6. Утолить реакции путем добавления 4 мкл рабочего раствора гидроксиламина 5% и Инкубируйте 15 мин
  7. Смесь Алиготе малого и равного объема (2 мкл) каждого TMT-меченых образца. Опреснения с помощью 10 мкл наконечники с встроенный хроматографии СМИ. Анализ образцов на LC-MS/MS, как описано в пункте 3.4. Использование программного обеспечения прыжок (открытым исходным кодом базы данных поиска алгоритм, который преобразует тандем MS raw файлов в список пептидов и белков) чтобы определить коэффициент относительной концентрации всех 10 образцов по интенсивности тег TMT всех выявленных пептиды.
    Примечание: Этот тест соотношение премикс КК полезно определить правильное соотношение равно смешивания до окончательного объединения, как дозирования ошибки могут произойти что будет меняться, концентрации и шаг количественный белка не всегда может быть точным. Это также лучший способ гарантировать, что количество каждого из 10 образцов, используемых для окончательного микса, все в равной пропорции, как описано в шаге 3.5.
  8. Повторять столько раз, сколько необходимо для достижения в соотношении 1:1 во всех 10 образцов.
  9. Одинаково смешать 10 образцов по результатам теста соотношение премикс. Используйте образец с низкой концентрацией как базовый для настройки томов 9 образцов.
  10. Удаление побочных продуктов тушения реакции пуле TMT-меченых образца, обессоливания.
  11. Мыть 1 мл твердофазный извлечения картриджи, содержащие 50 мг сорбента каждого столбца с 1 мл/0,25 мл метанола при использовании 100 мкг образцов. Мыть емкость 0,5 - 60 мкг C18 спин столбцы с 1 мл/0,25 мл 60% TFA ACN/0.1% при использовании 10 мкг образцов. Центрифуга для столбцов в 500 g x 30 s.
  12. Сбалансировать столбцы с 0,5 мл 0,1% TFA и удалить центрифугированием на 500 x g 30 s.
  13. Загрузить образцы по столбцам и привязать центрифугированием при 100 x g на 3 мин, или до тех пор, пока все образца прошло через колонку.
  14. Добавить 0,5 мл 0,1% TFA столбцы и центрифуги на 500 x g 30 s.
  15. Добавить 125 мкл 60% TFA ACN/0.1% для каждого столбца и элюировать центрифугированием на 100 g x 3 мин обеспечить, чтобы все решения прошло через колонку.
  16. Сухой eluents в вакуумной концентратор. Убедитесь, что образцы полностью сухой и не жидкость остается в трубах. Хранить при температуре-80 ° C до дальнейшего анализа.

4. Обширные с высоким разрешением, основные рН LC Prefractionation

  1. набор 2 подключенных C18 столбцы, содержащие частицы гибрид мостовой этилена (4,6 мм x 25 см, на общую сумму 50 см; 3,5 размер частиц мкм) и использовать микролитр потока насос высокой производительности LC для фракционирование.
    Примечание: Использование 2 колонок увеличивает загрузки пептидной и не обязательно улучшить хроматографии. Для образцов, содержащих ≤ 200 мкг пептидов, 1 колонка является достаточным.
  2. Мыть 100 мкл цикла с последующими дополнениями 300 мкл метанола, воды и буфера A (Формиат аммония 10 мм, pH 8.0).
  3. Вымойте столбцы с 100 мкл одинаково смешанные изопропаноле, метанол, АКС, и воды и сбалансировать столбца в буфере 95% для 2 h.
  4. Солюбилизировать последнего образца обессоленной пуле TMT-меченых пептида в 65 мкл буфера A. Убедитесь, что образец pH ~ 8.0. Если еще кислые, используйте Гидроксид аммония для регулировки рН 8.0.
  5. Fractionate образца, используя следующий градиент с буфером B (буфер плюс 90% ACN): 15% до 20% за 15 мин, 20% до 35% на 100 мин и 35% до 50% для 30 минут установить коллектор фракций для сбора фракций каждые 2 мин, включая время загрузки. Установите скорость потока до 0,4 мл/мин. Смотрите ссылку 29 и Рисунок 1 представитель хроматограммы.
  6. Собрать в общей сложности 80 фракций и сухая 40 фракций (каждый другой фракции) с вакуумной концентратор до полной сухости.
  7. Использовать 40 высушенные образцы для анализа LC-MS/MS.
  8. Анализировать все 80 фракций, LC-MS/MS для достижения охвата Ультра глубокое протеома.

5. LC-MS/MS подготовка и параметры

Примечание: на основе в TMT количественный, пептид ионы Изобарический и отображаются как 1 Масса в MS1 сканирования. Однако они являются предел по интенсивности репортер ионов (10 уникальных репортер ионов) в МС/МС сканирования после того, как Ион пептида были фрагментированы с более высокой энергии столкновения диссоциации (HCD). TMT репортер ионные коэффициенты могут быть подавлены от совместное Элюирующий TMT-обозначенных ионов 24. Сужение Ион изоляции окна 25, газовой фазы очистки 26, MultiNotch MS3 метод 27 или обширные фракционирование многомерные LC и длинные градиентов (4-8 ч) 28-альтернативные подходы.

  1. Пакет 75 мкм внутренний диаметр (ID) пустые столбцы с 1,9 мкм C18 смолы от 30 до 40 см длиной (~1.3 мкл кровать тома).
  2. Тепло столбцы при 65 ° C с утеплителем портфолио бабочка для уменьшения противодавления и предотвратить давление на ультра-высокого давления Жидкостная хроматография (UPLC) системы. Катушка столбце 2-3 раза в течение бабочка нагревательному прибору убедитесь, что длина постели весь столбец нагревается. Лента столбце внутри нагревателя, стараясь не ленту через датчик температуры внутри нагревателя.
    Примечание: Бабочка портфолио нагреватель установлен и выявляется на заказ кусок оргстекла, придает XYZ этап инструмента.
  3. Подготовка буфера (3% этанного сульфоксида и 0,2% муравьиной кислоты) и буфера B (буфер плюс 67% ACN) и мыть столбцы тщательно с буфером 95% B. Затем полностью сбалансировать столбцов в буфере 95% A (по крайней мере 3 колонки томов). Использовать скорость потока ~0.25 мкл/мин и противодавления бара 280-320
  4. Изучить качество системы LC-MS/MS, запустив 100 нг крыса мозга пептидов (или стандарт нашего выбора) дважды, прежде чем анализировать образцы TMT-меченых. Проверьте следующие параметры часто для обеспечения сбора качественных данных: обследование MS интенсивности сигнала (между e8 и e9 для базового пика интенсивности), качество МС/МС спектры (хорошее представление y и b ионов), ширина пик (12-22 сек), общее время хранения, Давление системы LC (повышение давления > 50 баров указывает грязные столбец или оконечности засорение эмиттера) и запуска к запуску изменчивости (должно быть идентичным пики < 30 s между запусками).
    Примечание: Для устранения вблизи Изобарический репортер ионов 10-plex TMT реагентов (6.32 mDa разница), в резолюции МС/МС должно быть присвоено по крайней мере 30.000 в 400 m/z. HCD обычно используется для TMT10-plex репортер Ион фрагментации, как это не могут быть одной трети правило, которое применяется для столкновения индуцированной диссоциации (CID) в документах ионная ловушка.
  5. Чистые и калибровки инструмента MS регулярно и использовать свежие LC буферов для улучшения производительности системы.
  6. Восстановить сушеные пептидов из разделения базовых pH в 5% TFA.
  7. Загрузить ~0.2 мкг на столбце а течет буфера 5% а.
  8. Elute с 15% до 45% буфера B в 150 мин. В качестве отправной точки, использовать следующий градиент: время 0, буфера B 5%; время 2, буфера B 15%; 135, 45% буфера B, в режиме 145, буфера B 70%; и времени 150, буфера B 95%. Настройте градиент слегка для раннего и позднего базовых pH RPLC фракции после изучения базовых пик хроматограммы.
  9. Работают масс-спектрометр в зависящих от данных режиме с обследования сканирования в анализаторе ионная ловушка массы (400-1600 m/z; 60000 резолюции; 1 x 10 6 автоматическая регулировка усиления (AGC) управления целевой; время максимальная Ион 50 мс; и тяжести режим). Выполнение 20 МС/МС с высоким разрешением сканирования (60000 резолюции, 1 х 10 5 СМЖЛ целевой, время максимальной Ион ~ 100 мс, 35 энергии столкновения HCD нормированный, 0.4 m/z изоляции окна и 20 s динамического исключения).
    Примечание: Электрона передачи диссоциации (ETD) не рекомендуется для TMT10-plex реагентов ETD расщепления сайтов отличаются от HCD, привело репортер Ион перекрытия. Кроме того, ETD не эффективна как HCD потому что tryptic пептидов обычно генерируют + 2 заряженном состоянии, и ETD является более эффективным в высокий заряд государства.

6. Анализ данных MS

Примечание: мы описываем анализ данных с помощью программы перехода. Однако, анализ данных может выполняться с другими коммерчески доступных или бесплатные программы.

  1. Процесс raw файлов от масс-спектрометр с совместной работы на основе тегов поиска двигатель прыжок 21, который сочетает в себе Поиск базы данных на основе шаблона и последовательности на основе тегов de novo для повышения чувствительности и специфичности.
  2. Преобразовать необработанные данные в mzXML формат и поиск спектров MS2 против базу человеческого UniProt цель манок (или другие соответствующие вегетационных базы данных), чтобы вычислить уровень ложных обнаружения (ДРД).
  3. Выполнять поиск с помощью массового терпимости 10 ppm для прекурсоров и фрагмент ионов. Установите другие параметры поиска полностью tryptic ограничения с 2 максимум пропущенных разобщенность, 3 Максимальная модификации сайтов за пептида и назначение , b и y ионов забить пептидов. Задать статические изменения TMT Теги на Lys остатков и N Термини (+229.162 Da) и carbamidomethylation остатки Cys (+57.021 Da). Установка динамического изменения включают встретил окисления (+15.994 Da), который является общий артефакт пептид с пробами.
  4. Фильтр данных следующие критерии: 7 аминокислоты минимум пептид длина, точность m/z (например, 5 ppm) и сопоставления ноты (J Оценка и deltaCn). Группа пептидов в зависимости от длины пептида, trypticity и зарядки состояние.
  5. Использовать дополнительный уровень фильтрации, сопоставляя результаты для уменьшения белка FDR для ниже 1%. Белки, выявленные одной спектральной игр требуют высокий показатель сопоставления.
  6. Для совместно несколькими членами семьи белков, пептидов кластера членов соответствующего белка в группу 1.
    Примечание: Согласно принципу экономичности, Группа представлена белка с наибольшим числом назначенных пептидов и другие белки, сопровождается уникальным пептидами 1.
  7. Quantitate белков путем суммирования репортер Ион пунктам во всех матчах спектра соответствует пептида (PSMs) с помощью программы встроены в набор программного обеспечения прыжок.
  8. Для каждого признаны PSM, извлекать и исправить TMT репортер Ион интенсивности согласно изотопного распределения маркировки реагентов и загрузки предвзятость, которая рассчитывается от глобальных данных количественный PSM. Фильтр PSMs с низкой интенсивности и высокий уровень шума с пользователем порогами во время quantitation.
  9. Расчет относительной сигнала между каждой репортер Ион и среднее всех 10 репортер ионов. Сумма относительной сигналы PSMs для определенных белков. Преобразовать эти относительные сигналы абсолютного сигналов путем умножения усредненной репортер Ион интенсивность PSMs Топ-3 в соответствующих белков.
  10. Использовать после МС вычислительной подход для устранения помех. Предполагая, что y 1 Ион интенсивность пропорциональна интенсивности Ион репортер, рассчитать линейную связь из чистого сканирования и получают уровень помех от зараженных y1ion интенсивности в шумной сканирует 23.
    Примечание: Для TMT-меченых tryptic пептидов, остатки K-ТМТ и R, 2 типа y 1 ионов (376.27574 да и 175.11895 Да, соответственно) в MS2 сканирования. Если только 1 y 1 Ион обнаруживается и в соответствии с выявленными пептид, мс2 считается чистой сканирования ( рис. 3A). Если оба y1ions обнаружены, мс2 считается шумной сканирования.
  11. Экспорта значений количественный белка в программу электронных таблиц программного обеспечения для дальнейшего анализа. Используйте попарных сравнений или дисперсионный анализ для определения белков, которые выражаются в дифференциально.

7. Проверка данных MS

Примечание: для оценки качества данных MS, по крайней мере 1 метод проверки должны выполняться перед длительным биологические эксперименты.

  1. Вручную изучить МС/МС спектры протеинов интереса для проверки последовательности пептида и ТМТ репортер Ион количественный.
  2. Использование известных белков количественный данные для подтверждения результатов MS.
  3. Проверить изменения протеина с подходы на основе антител (например, Уэстанализ помаркой и иммуногистохимии RN).
  4. Химически синтеза пептидов интерес и использовать их как внутренние стандарты для подтверждения идентификации нативных пептидов.
    Примечание: Их модели МС/МС и удержания время LC-MS/MS должны быть идентичны.
  5. Проверить изменения протеина с целенаправленный подход MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали сочетание ранее описанных кросс видов пептида систематически анализировать влияние коэффициента сжатия в 3 основных протокола шаги, включая pre-MS фракционирования, MS параметры и коррекции post-MS23. Фракционирование pre-MS оценены и оптимизированы с помощью комбинации базовых pH RPLC и кислой рН RPLC. Для post-MS анализа были рассмотрены только вегетационных пептиды. Мы использовали эту модель вмешательства для изучения ряда параметров в LC/LC-MS/...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем высок объём протокол для количественный белков с 10-plex Изобарический маркировки стратегию, которая была успешно внедрена в ряде публикаций12,13,14,32 . В этом протоколе мы можем анализировать до 10 различных белков биологических образцов в 1 эксперимент. Обычно мы можем определить и quantitate свыше 10 000 белки с высокой степенью уверенности. Хотя Изобарический маркировки являет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят всех других членов лаборатории и учреждения для полезной дискуссии. Эта работа частично была поддержана NI H предоставляет R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 и ALSAC. Был проведен анализ MS в St. Jude Children's исследований больницы протеомики, поддерживаемый, частично гранта NIH рака центр поддержки P30CA021765. Авторы благодарят Nisha Badders за помощь в редактировании рукопись.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Система 1220 LCAgilentG4288B
50% гидроксиламинThermo Scientific90115
АцетонитрилBurdick & JacksonAH015-4
Пуле-блендерNext AdvanceBB24-AU
Нагреватель портфеля бабочекPhoenix S& TPST-BPH-20
C18наконечники Harvard Apparatus74-4607
Дитиотрейтол (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
Муравьиная кислотаSigma94318
Сборник фракцийGilsonFC203B
Стеклянные бусиныNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
Йодоацетамид (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
МетанолBurdick & JacksonAH230-4
Набор для анализа белка Pierce BCA Масс-спектрометрThermo Scientific23225
ThermoScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 смола, 1,9 мкмDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
Колонки Self Pck НоваяцельPF360-75-15-N-5
Дезоксихолат натрияSigma30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex Изобарическая метка реагентThermo Scientific90110
Трифторуксусная кислота (ТФК)Applied Biosystems400003
ТрипсинPromega V511C
МочевинаSigmaU5378
Xbridge Колонка C18 Вода186003943
Застежка-молния C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50мгВодаWAT054960

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464(2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171(2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

Related Articles