Method Article

Microstructured устройства для оптимизированного микроинъекции и изображений личинок данио рерио

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроинъекции zebrafish эмбриона и личинки является важным, но сложным техника, используемая во многих моделях данио рерио. Здесь мы представляем широкий спектр микромасштабной инструментов для оказания помощи в стабилизации и ориентации данио рерио микроинъекции и изображений.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио превратились в мощную модель различных заболеваний человека и полезным инструментом для увеличения диапазона экспериментальных исследований, охватывающих основные биологии развития через крупномасштабных генетических и химических экраны. Однако многие эксперименты, особенно тех, которые касаются инфекции и гранулы ксенотрансплантата модели, полагаются на микроинъекции и изображения эмбрионов и личинки, которые кропотливой методы, которые требуют навыка и опыта. Чтобы повысить точность и производительность современных методов микроинъекции, мы разработали ряд microstructured устройств для ориентации и стабилизации zebrafish эмбриона на 2 дня пост оплодотворение (dpf) в брюшной, спинной или поперечной ориентации до процедура. Для оказания помощи в визуализации эмбрионов, мы также разработали простое устройство с каналами, которые Ориент 4 данио рерио боково параллельно против скольжения обложки стекла. Вместе инструменты, которые мы представляем здесь продемонстрировать эффективность фотолитографический подходов для создания полезных устройств для оптимизации данио рерио методов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данио рерио превратились в мощную модель для многих областях, начиная от исследования фундаментальных биологии развития для крупномасштабных генетических и химических экранов1,2. Рутинной генетических манипуляций, например гиперэкспрессия генов, сногсшибательно, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза и трансгенез полагаются на микроинъекции генетического материала в одной ячейки зиготы, которая привела к разработке простых, легко в использовании, коммерчески доступные инструменты для ориентации и стабилизации яйца для инъекций3. Другие подходы, например трансплантации и инфекции, часто требуют микр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроинъекции личинок был одобрен Подкомитетом общие больницы Массачусетс на исследования животных уход под протокол 2011N000127.

1. устройство изготовление

Примечание: Все компьютерные рисования (CAD) файлы используются для разработки фотолитографии маски описано здесь (рис. 1) доступны для скачивания. Смотрите таблицу материалов.

  1. Изготовить мастер формы пластин в чистую комнату класса 1000 с использованием стандартных методов фотолитографический7. Для массивов микроструктуры и каналы, модель на основе эпоксидных негативного фоторезиста последовател....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь подход демонстрирует дизайн (рис. 1) и изготовление приборов для использования с 2 dpf данио рерио, используя фотолитографический (рис. 2) и мягкие литографические техники (рис. 3). Этот метод позволяет быстрое тестирование многих итераций дизайна и модификаций и изменений и оптимизации микроструктуры размеры для использования с данио рерио на других этапах развития могут расширить их.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь, мы описывают использование устройств мы недавно разработали для облегчения 2 dpf данио рерио микроинъекции5и ввести устройство простой монтаж бесплатно агарозы для удобного отображения эмбрионов. Эти инструменты подчеркнуть полезность фотолитографический техники для изготовления устройств, полезных для данио рерио методов.

Мы нашли MSA устройства особенно полезен для инъекции клеток или частицы склонной к агрегации в пределах микроинъекции иглы, например грибковы.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Лангенау за щедро предоставленные аквариум пространства; Эрик Стоун, Джон C. Мур и Цинь Тан для помочь с данио рерио обслуживания и реагентов и Энн Робертсон и Эллиотт Hagedorn Леонард Zon лаборатории для закупки штамм данио рерио, используемый здесь. Они также хотели бы поблагодарить Octavio Уртадо за консультацией по фотолитографический методов. FE финансировалось стипендии от Шрайнер в больницу для детей и Американской ассоциации Австралии. Эта работа финансировалась NIH Грант GM92804.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dow Corning Sylgard 184 Полидиметилсилоксан (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0,5 КГДля литья устройств. В комплект входит мономер PDMS и инициатор
Низкая температура гелеобразования агарозыSigma AldrichA9414-10GДля литья агарозных устройств
PFDTS силанSigma Aldrich448931-10GДля литья негативных PDMS форм
Трикаин (MS-222)Sigma AldrichE10521-10GДля обезболивания данио-рерио
Родамин Декстран 70 000 DaThermoFisherD1818Для отслеживания микроинъекций
Лейкотриен В4 (LTB4)Cayman Chemicals20110Нейтрофильный хемоаттрактант
N-формилметионин-лейцил-фенилаланин (fMLP)Sigma AldrichF3506-50MGНейтрофильный хемоаттрактант
15 см чашка ПетриФишер научный08-757-148Для литья из мастер-
Стеклянное дно 6-луночных планшетовMatTekP06G-0-20-FДля устройств визуализации
микрокапилляров из боросиликатного стеклаWorld Scientific InstrumentsTW-100-4Для микроинъекционных
игл Трансферные пипеткиSigma AldrichZ350796Для переноса эмбрионов рыбок данио-рерио
Наконечники микрозагрузчикаFisher scientificE5242956003Для загрузки микроинъекционных игл
Harris Uni-Core 1,5 мм PunchТед Пелла Инк.15111-15Для пробивания отверстий в аппаратах визуализации
PDMS No11 СкальпельFine Science Tools10011-00Для резки PDMS
Dumont No5 ЩипцыFine Science Tools11252-10Для дехорионирования эмбрионов и поломки наконечников микроинъекций
Marzhauser МикроманипуляторASIMM33-RДля манипуляций с иглой для микроинъекций
Магнитная стойкаMSCSPI - 87242624Для монтажа микроманипулятора
MPPI-3 Контроллер PicopumpASIMPPI-3Для контроля объема и времени микроинъекции
EVOS инвертированный флуоресцентный микроскопThermoFisherEVOS FLДля визуализации инжектированных эмбрионов
Препарирующий микроскопNikonSMZ745Для визуализации микроинжекции
Программное обеспечение AutoCADAutodeskСкачать файлы AutoCAD с: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 и на вики-странице протокола сообщества ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  
иглы

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish MicroinjectionMicrostructured DevicesEmbryo OrientationImaging ChannelsPDMS BlockHair Loop ManipulationPICO PumpFluorescent MicroscopyOtic VesicleNeutrophil Recruitment

Related Articles