Методическая статья

Мультиплексированных помощью иммунофлуоресцентного анализа и количественной оценки внутриопухолевых PD-1+ Тим-3+ CD8 клетки+ T

DOI:

10.3791/56606

⸱

8 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1PARCC-INSERM U970, Université Paris Descartes, 2INSERM U970, Université Paris Descartes, 3Equipe Labellisée Ligue Contre le Cancer, 4Department of Immunology, Hopital Européen Georges Pompidou, 5Department of Medical Urology, Hopital Européen Georges Pompidou, 6Department of Pathology, Hopital Européen Georges Pompidou, 7Université Paris Diderot Paris 7, 8Department of medical oncology, Hopital Européen Georges Pompidou

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучая микроокружения опухоли может идентифицировать прогностическое или интеллектуального биомаркеров клинической реакции на иммунотерапию. Представленные здесь, инновационный метод основан на в situ флуоресценции многоспектральных изображений для анализа и рассчитывать автоматически различных субпопуляций CD8+ T клетки. Этот воспроизводимый и надежный метод подходит для анализа больших когорты.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунные клетки являются важными компонентами микроокружения опухоли и влияние роста опухоли и эволюция на всех стадиях канцерогенеза. В частности теперь хорошо известно, что иммунной проникнуть в человека опухоли можно соотнести с prognosis и ответа на терапию. Анализ иммунной проникнуть в микроокружения опухоли стал серьезной проблемой для классификации пациентов и ответ на лечение.

Совместное выражение рецепторов ингибирующих такие программы клеток смерть белок 1 (PD1; также известен как CD279), цитотоксических Т-лимфоцитов связанные белка (CTLA-4 4), Т-клеток иммуноглобулина и муцина содержащих протеин-3 (Тим-3; также известен как CD366) и лимфоцитов Активации генов 3 (ЛАГ-3; также известен как CD223), является отличительной чертой истощения Т-клеток. Мы разработали многопараметрических в situ иммунофлюоресценции, пятнать для идентификации и количественной оценки на клеточном уровне совместного выражение этих рецепторов ингибирующих. На ретроспективной серии замороженные ткани почечно-клеточной карциномы (РСС), с использованием многоспектральных изображений технологии флуоресценции в сочетании с анализа изображений программное обеспечение, что Сопредседатель выражение PD-1 и Тим-3 было установлено на опухоли, проникнув CD8+ T клетки связан с плохой прогноз в РКЦ. Насколько нам известно, это представляет собой первое исследование демонстрирует, что это Автоматизированная технология мультиплексный в situ могут иметь некоторые клиническое значение.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние несколько лет иммунотерапия стала весьма перспективным лечения для многих видов рака, включая РСС. В частности иммунотерапия, основанные на ингибирование ингибирующее контрольно-пропускных пунктов, как PD-1 и CTLA-4 было сообщено быть клинически эффективным1,2,3,4,5, 6. моноклональных антител против CTLA-4, PD-1, или программа смерти лигандом 1 (PD-L1) уже утвержденных в несколько рака и привести к длительной клинических ответов в более чем 20% больных7. Тем не менее не все пациенты ответчиков, стоимость лечения является высокой, и эти процедуры являются токсичными, приводит к потенциальные серьезные аутоиммунных как побочные эффекты. Таким образом текущий задача заключается в определении прогнозных маркеров для этих новых immunotherapies. Соотнести с клинической реакции были зарегистрированы темпы мутаций в опухоли, выражение PD-L1 или уровней внутриопухолевых CD8+ Т-клеток инфильтрата. Однако эта Ассоциация еще слишком слаб, чтобы рекомендовать использование этих клинических биомаркеров в клинической практике за исключением компаньона тест для PD-L1 до отправления Pembrolizumab в немелкоклеточного легких рака легкого (НМРЛ) пациентов8 ,9,1011,12. Доказано, что Сопредседатель выражение многих рецепторов ингибирующих как PD-1, Тим-3, ЛАГ-3, и CTLA-4, индуцирует ячейки истощение фенотипа и устойчивость к терапии13,14,15. Так как периферической крови не является представителем микроокружения опухоли, он представляет большой интерес для анализа Фенотипические особенности клеток в situ. PD-1 и Тим-3 совместно выражая Т-клетки известны как функционально нарушениями клеток в нескольких контекстах13,16,17. В это исследование, прогнозные последствия совместного выражение двух рецепторов ингибирующих PD-1 и Тим-3 на CD8+ T оценивалась клетки.

Вверх до сих пор, изучая Сопредседатель выражение несколько маркеров на опухоли, проникнув лимфоцитов (Тилс) главным образом выполнялись cytometry анализ потока, что делает необходимым для работы на свежие опухоли и поэтому исключающие ретроспективный анализ. С обычными в situ окрашивание, только один пятная единовременно может быть выполнена, и характеристика типа клеток, которые совместно выражает маркеры не возможен. Например PD-L1 выражается многие типы клеток микроокружения опухолевых, что делает его трудно определить путем анализа обычных иммуногистохимии, какие ячейки, выражая PD-L1 более актуальны для корреляционного исследования. В этой работе, мы разработали инновационные в situ многопараметрических иммунофлюоресценции метод подсчета компьютер для корреляции со выражение PD-1 и Тим-3 опухоли, проникнув CD8+ Т-клеток с клинические исходы в РКЦ. Этот метод имеет ряд преимуществ, включая возможность для анализа на уровне одной ячейки и несколько маркеров в то же время с помощью многоспектральной камеры, которые могут захватить ограниченным интервалом > 10 Нм через жидкий кристалл фильтры18. Кроме того процедура является автоматической что позволяет воспроизводимость между оператором и сокращенный анализ по сравнению с методами руководства19. В области рака несколько исследований сообщалось, убедить несколько stainings молекул иммунной как PD-1, ПД-L1 и CD8 в Меркель клеточной карциномы, рака легких и головы и шеи рак20,21,22, 23. число автоматизированных ячеек возможна с подготовки пользователем (фенотип шаг). Флюоресценция измеряется в различных клеточных компартментов (ядер, цитоплазмы и мембраны).

Здесь, различные подмножества проникновения опухоли CD8+ T-клеток выражая PD-1 и/или Тим-3 в большой когорты РСС были подсчитаны и результаты коррелировали с параметрами выживания и тяжести клинической оценки. Было также можно анализировать интенсивности флуоресценции мембраны на сотовой резолюции с данными означают интенсивности флуоресценции (MFI) как в цитометрии. Насколько нам известно, это первый отчетности прогнозные результаты исследования с использованием этой многоспектральных изображений на основе фото технике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было проведено в соответствии с Хельсинкской декларации и был одобрен Комитетом местных этики (CPP Иль де Франс nr. 2012-05-04). Информированное согласие было получено от участника, включены в когортах.

1. ткань материала

  1. Сбор образцов ткани РСС на день операции. Обработайте хирургического образца при комнатной температуре (отделение патологии).
  2. Соберите образец опухоли примерно 0,5 х 0,5 см x 0.5 см размер в сухую пробирку. Оснастки замораживание в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
  3. Герб образцы оптимального раскроя температуры смеси. Раздел образцы с криостата при-20 ° C толстые разделов 4-6 мкм. Пусть образцы воздуха сухой на слайдах для 12 h и непосредственно хранить их в-80 ° C, чтобы избежать высыхания.
  4. Проверьте качество образца, просмотрев гематоксилином и эозином, окрашенных раздел.

2. в месте иммунофлюоресценции окрашивание Тилс

  1. Процедурные руководящие принципы
    1. Выполните все экспериментальные при комнатной температуре.
    2. Для всех шагов выполняют разведений с трис буфер солевой (TBS; см. Таблицу материалы).
    3. Выполните промывку в TBS для всех шагов за исключением после основное антитело инкубации. Для последних, используйте буфер Tris физиологический Tween20 (TBST, смотрите Таблицу материалы). Для буфера композиции и воссоздание см Справочная таблица 1.
    4. Используйте камеру влажности для инкубаций антитела и окрашивание jar для стирки.
    5. Не позволяйте секции высохнуть во время процедуры.
  2. Предварительная обработка
    1. Оттепель слайд, содержащий образец ткани и тщательно высушить слайд вокруг образца с бумажным полотенцем. Разграничивать области реакции, содержащий ткань с ручкой гидрофобный барьер (см. Таблицу материалы). Химчистка на 2 мин.
    2. Исправьте образцы в 100% ацетона для 5 мин, сухой за 2 мин и мыть с TBS за 10 мин.
  3. Насыщенность и блокада
    1. Предварительной обработки слайды для 10 мин с 3 капли 0,1% авидин, крана и/или фильм на слайд, чтобы распространять авидин и удалить пузырьки воздуха и затем обращаться за 10 мин с 3 капли биотина 0,01% (см. Таблицу материалы), кран, или Флик. Вымойте с TBS.
    2. Выполните ФК блокады рецепторов. Применить 100 мкл 5% Объем/объем нормальной сыворотки, разбавленный TBS. использования сыворотки от того же вида узла как обозначенное антитело вторичного или третичного (см. Таблицу материалы); Здесь был использован осла сыворотки. Инкубируйте 30 мин.
    3. Во время инкубации кратко спина анти CD8, ПД-1 и Тим-3 антител (Таблица материалов). Подготовьте смесь первичных антител в TBS, как описано в дополнительной таблице 2.
  4. Иммуно окрашивание для CD8, ПД-1 и Тим-3
    1. Подготовьте смесь основное антитело. Обратитесь к Таблице материалы и Дополнительная таблица 2 для антитела, которые используются (анти CD8, ПД-1, Тим-3 и их соответствующие вторичные антитела) и их концентрации.
    2. Коснитесь и/или проведите оставшиеся осла сыворотки (Добавлено в шаге 2.3.2). Инкубируйте слайды с 100 мкл-меченых первичного антитела смеси на 1 ч в камере увлажненной.
    3. Во время инкубации кратко спина анти кролик цианиновые 5, AF488-анти коза и биотинилированным против мышиных антител и подготовить смесь вторичные антитела, как описано в дополнительной таблице 2.
    4. Вымойте слайды в TBST для 5 минут сухой слайды.
    5. Инкубируйте слайды с 100 мкл вторичных антител на 30 мин в камере увлажненной.
    6. Подготовьте смесь третичного антитела, содержащих Cy3-стрептавидина, как описано в дополнительной таблице 2.
    7. Вымойте слайды в TBS на 10 мин сухой слайды.
    8. Инкубируйте слайды с 100 мкл третичного антитела смеси для 30 мин.
    9. Вымойте слайды в TBS на 10 мин сухой слайды.
  5. Мобильный монтаж
    1. Смонтировать слайды в 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлорида DAPI-содержащих монтаж среднего (1,5 мкг/мл DAPI) с coverslip совместимый для микроскопии флуоресцирования (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Как отрицательный контроль для каждого эксперимента, один слайд с соответствием isotype антитела был использован на такой же концентрации как соответствующих антител. Для этого окрашивание, мы использовали IgG1 мыши, кролик IgG и отрицательный контроль антитела козочки IgG (см. Таблицу материалы). Как положительный контроль мы использовали человеческого hyperplasic миндалины, который как известно, быть положительным для протестированных маркеры для каждого эксперимента. Типичный пятнать описан в результатах (рис. 1). Моно окрашивание CD8, ПД-1 и Тим-3 должны быть выполнены индивидуально (одного окрашивания на слайд) с предварительно одинаково и без DAPI. Должны также выполняться слайд в тех же экспериментальных условиях без каких-либо антитела и только DAPI монтажа средних. Слайд должны отражаться с использованием одинаковых экспериментальных условиях без каких-либо антитела и DAPI.

3. флуоресцентный анализ и автоматизированных число ячеек

  1. Получение изображения с автоматизированной микроскопа
    1. Создание протокола.
      1. Включите программное обеспечение автоматизированных микроскопа и флуоресцентной подсветки.
      2. В строке меню, нажмите на «Файл», «создать протокол,» выберите «DAPI,» «FITC» и «TRITC.»
      3. Нажмите кнопку «Далее», «Ткани секция,» и нажмите «Далее», «Имя протокола». Выберите имя, например, «CD8-PD-1-Тим-3,» нажмите «Далее» и «сохранить».
      4. Вручную место слайда на сцене.
      5. В строке меню нажмите кнопку «Настройка», «параметры». Нажмите кнопку «установить дома Z» в новом окне.
      6. Отрегулируйте время экспозиции с позитивным элементом управления слайд- т.е. CD8, PD-1 и Тим-3 тройной витражи с DAPI образца.
      7. В панели управления нажмите кнопку «установить экспозиции».
      8. Отрегулируйте время экспозиции для каждого фильтра, пока не получен сигнал достаточно, но не насыщения.
      9. Для монохромных изображений, выполните следующие действия:
      10. Выберите приобретения и под «автофокус» выбрать DAPI фильтр.
      11. В «сканирования области предел» переместите объективных Верхний верхний левый угол слайда. Нажмите кнопку «Пометить». Сделайте то же самое, на правом нижнем углу.
        Примечание: Этот шаг delimitates области низкой мощности визуализации (LP Вообразимый) 4 X; Помните, что вы поместите знак хорошо так что касается окружают все образцы серии.
      12. Для высокой мощности (HP) изображений выполните следующие действия:
      13. В разделе «Автофокусом» выберите «DAPI».
      14. В разделе Группа «Приобретение» выберите «DAPI», «FITC», «Cy3» и «Cy5». Нажмите кнопку «ОК». В строке меню нажмите кнопку «Файл», «сохранить протокол».
    2. Сканирование слайдов.
      1. Загрузите протокол, нажав кнопку «Файл», «загрузить протокол» в строке меню. Нажмите кнопку «Пуск».
      2. Введите «Lab ID» (расположение папки для хранения снимков). Введите слайд ID для идентификации слайд. Нажмите кнопку «Далее».
      3. Нажмите «Монохромных изображений» (чтобы сканировать весь слайд под светлые области света и приобрести последовательных изображений, используя цель 4 x).
        Примечание: Это производит обзор серого слайда.
      4. Нажмите «Найти образец». Выберите область ткани проверяемых с низким разрешением (4 x): удерживайте клавишу «Ctrl» и нажмите на поле, используя курсор, чтобы выбрать или deselect поля (рис. 2A).
      5. Нажмите кнопку «LP Imaging» (4 x изображений) для флуоресцентные красный синий зеленый образ приобретение каждого поля.
      6. Для выбора поля HP удерживайте нажатой клавишу «Ctrl» и нажмите на поле, используя курсор, чтобы выбрать или deselect поля, которые соответствуют области тканей, которые будут проверяться с высоким разрешением (20 x). Выберите 5 поля (рис. 2B).
      7. Нажмите кнопку «HP Imaging» (20 x изображений) для приобретения Мультиспектральное изображение каждого поля (рис. 2 c).
      8. Нажмите кнопку «Хранения данных» для хранения изображений в папке, которая была выбрана в начале в этой.
        Примечание: Этот процесс кратко и показано на рисунке 2. Для каждого шага (обнаружение ткани, выбор поля) алгоритм может увеличивается и подготовленных пользователей для всей автоматизированной проверки процесса.
  2. Анализ изображений флуоресценции и автоматизированных клеток подсчета с спаренных анализ программного обеспечения
    1. Построение спектральной библиотеки.
      1. Откройте программное обеспечение для анализа изображения.
      2. На левой панели откройте «Построения библиотек». В разделе «Загрузка изображения» нажмите кнопку «Обзор» и выберите один моно витражные изображения (например, CD8/цианиновые 5).
      3. Выберите Флюорофор, (например, цианиновые 5). Нажмите кнопку «извлечь». Нажмите «Сохранить», чтобы сохранить в библиотеке. Нажмите кнопку «Сохранить».
      4. Повторите тот же процесс для PD-1, Тим-3 и DAPI моно окрашенных слайды для того, чтобы интегрировать спектр каждого Флюорофор интерес.
        Примечание: Строительство спектральной библиотеки интегрирует спектр для каждого Флюорофор, для конкретных тканей (здесь, почек), но может быть использован «синтетических» библиотек, которые уже существуют. Как спектр аутофлюоресценция строго по отношению к ткани, важно выполнять одно auto флуоресценции и спектральной библиотеки в проект.
    2. Создайте новый проект.
      1. В строке меню выберите «Файл», «Новый проект». В закладке «Функция поиска» выберите «ячейки сегментации». В закладке «Фенотип» выберите «фенотип». Нажмите кнопку «Создать».
      2. Интегрируйте представитель изображения в проекте.
        1. На вкладке «Файл» нажмите на «открыть изображение». Выберите 10-30 представитель изображения всей серии. Добавьте слайд витражи для удаления аутофлюоресценция. На правой панели: Источник выберите Библиотека. Выберите Флюорофор и выбрать те соответствующие спектральной библиотеки ранее построен.
      3. Чтобы удалить ткани аутофлюоресценция, нажмите кнопку «AF» и затем выберите область аутофлюоресценция на пустом слайде.
      4. Обработка изображений и создания композитных изображений.
        1. Нажмите кнопку «Подготовить все «интегрировать библиотеки флуоресценции и аутофлюоресценция спектры для создания составного изображения (рис. 3). Нажмите на значок «глаз», чтобы открыть панель «представление редактора» и выберите отображаемые данные: выберите маркеры CD8, ПД-1, Тим-3 и DAPI. Удаление аутофлюоресценция. Выполните действия, представленные программного обеспечения.
      5. Сегмент клетки.
        1. Для разделения клетки, в «Отсек», выберите «Ядра» и «Мембраны». В закладке «Ядра» задайте DAPI как ядерной изображение.
        2. В закладке «Максимальный и минимальный размер (в пикселях)» введите «40» и «176» как минимальные и максимальные размеры, соответственно. Для «Минимум» сигнала Установите «0,13». В «Сплит» на вкладке установите «2.60». В «Ядра» на вкладке установите «0.81». Выберите «использовать сигнал мембраны для помощи сегментации».
        3. Нажмите «Сегмент клетки» в нижней части экрана. Проверьте сегментации ядер и мембран клеток и повторите с различными параметрами, если он не соответствует флуоресценции DAPI и мембраны клеток.
          Примечание: Программное обеспечение распознает клетки с ядерной DAPI окрашивание и на основе размера ячейки. Отрегулируйте параметры ячейки (размер, Сплит, пикселей) в соответствии с проектом.
      6. Фенотипа клетки.
        1. На вкладке «Фенотип» нажмите «Добавить». Создайте ячейки фенотип категории: CD8 (синяя точка) / CD8-PD-1 (красная точка) / CD8-PD-1-Тим-3 (зеленая точка) / другие (черная точка) (Рисунок 4).
        2. Выберите более чем 5 Примеры клеток в каждой категории. Нажмите «Поезд классификатора».
          Примечание: Это создает алгоритм статистической классификации программного обеспечения.
        3. Нажмите кнопку «Фенотип все» для получения фенотип каждой ячейки.
          Примечание: Программное обеспечение дает фенотип одной ячейки с доверительным интервалом (ди) точности.
        4. Улучшить алгоритм подготовки программного обеспечения, до тех пор, пока разница между глаз и автоматизированных количество совпадающих (ошибка < 5%). Выберите CI, что является приемлемым для клетки интереса.
          Примечание: Мы решили сделать обучение на основе 55% ди как приемлемые.
      7. Сохраните проект и алгоритм.
      8. В разделе «Файл» выберите «проект». Имя и нажмите кнопку «Сохранить».
    3. Выполните анализ пакетный серии.
      1. Выберите «Пакет анализа». Выберите проект. Добавьте изображения для анализа. Выберите папку для хранения данных. Нажмите «Запустить». Проверьте качество составного изображения. Проверьте фенотипирование для всех изображений серии.
        Примечание: Программное обеспечение для анализа связанных изображений интегрирует все сигналы отсеков (мембраны/цитоплазме/ядер) клеток. Фенотипирование шаг имеет решающее значение, хотя и обучения алгоритм может быть длительным шагом. Все данные каждого изображения находятся в одном файле .txt. Все данные одной ячейки (особенно ее фенотип, с его CI) находятся в одной линии. Для каждого слайда загрузки изображений и последующим пунктам были исполнены на 5 полей.
  3. Интеграция исходных данных и генерации число автоматизированных ячеек
    1. Вычислите данные с помощью статистической программы.
      1. Вычислите все данные из 5 изображений, соответствующий 5 полей, проанализированы для 1 пациента. Использовать статистической платформе и у опытных статистик, диспетчер данных или данных ученый выполнения анализа. Создать сценарий, который автоматически подсчитывает количество ячеек в зависимости от их фенотип, выбрав CI > 55%.
      2. Положите все файлы .txt серии в той же папке.
    2. Извлечение данных.
      1. Положите все TXT-файлы в одну папку. Выполните автоматический сценарий построен на шаге 3.3.1. Откройте выходной CSV-файл, созданный сценарием R. Сохраните в формате .xl. Выходные данные собирает количество ячеек для каждого фенотипа (т.е., CD8 одиночку, CD8-PD-1, CD8-PD-1-Тим-3) для каждого пациента.
      2. Вычислить среднее количество клеток для каждого пациента на поле: Разделите количество ячеек на количество полей (т.е., 5) для нормализации количество ячеек для каждого пациента на поле.
      3. Рассчитать процент клеток PD-1+ среди всего CD8+ T клетки и Тим-3 PD-1+ + клетки среди всего CD8+ T клетки. Смотрите Рисунок 5 резюме этого шага.
        Примечание: Язык R (или другие программное обеспечение по выбору) необходимо правильно создавать и выполнять команды, и поэтому важно опытный пользователь или ученый статистик/данных. R программа может вычислить данные той же пациентки, но имя 5 TXT-файлов одного пациента должны иметь идентичные начала, соответствующий уникальный идентификатор пациента.
  4. Статистический анализ
    1. Использование статистического программного обеспечения для статистического анализа результатов.
    2. Выполните соответствующие статистические анализы с помощью статистик.
      1. Использование непараметрических Вилкоксон подписали ранга тесты для сравнения МФО PD-1 между двумя клетки фенотипов (рис. 6). Коррелируют ковариаций и гистологической характеристики с хи-квадрат Тест Пирсона.
      2. Используйте метод Каплана-Мейера для оценки безрецидивная выживаемость прогрессии и кокс регрессии модели для оценки воздействия залежки на события времени исходы, такие как общая выживаемость и безрецидивной выживаемости.
      3. Рассмотрим p-значения меньше чем 0,05 как значительный.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование общего протокола, описанных выше, мы стремились количественно внутриопухолевых CD8+ T клетки совместно выражая ингибирующее рецепторов PD-1 и Тим-3 в замороженных тканях от пациентов с СРК и соотнести результаты с клиническим исходам25.

Оптимизация окрашивания CD8/PD-1/Tim-3:

Различные виды антител (мыши...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модификации и устранения неполадок:

Качество ткани является важным параметром; Он может легко проверяться окраской гематоксилином и эозином.

Одним из преимуществ этого метода является возможность мультиплексных stainings, но чтобы избежать распространения Флюорофор, рекомендуется выбирать выбросов длин волн с дельта минимум 10 Нм. Здесь, потому что мы имели 4 stainings, включая DAPI, мы решили распространять длин волн (DAPI: 460 Нм, AF488: 519 Нм, ц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов от Института национального du рака (ИНКОВ) (ET), le Лига против рака (ET), Университет Сорбонна Париж Сите (ET), НРУ (Selectimmunco) (ET), Labex иммуно-онкология (ET), SIRIC CARPEM (CG, ET). ЭДГ финансировался стипендий Fondation дуги. EV и CD финансировались братство APHP (биржа année исследований). ChB финансируется стипендий университета Сорбонна Париж Сите (contrat докторской). Авторы благодарят Bristol-Myers Squibb за их финансирование в этом проекте. Авторы благодарят Департамент патологии Hopital Européen Жоржа Помпиду и Некер (Laurianne Шамболь, Элоди Мишель и Жизель ЛЕГАЛЬ). Авторы благодарят гистология платформы PARCC, Hopital Européen Жоржа Помпиду (Corinne Lesaffre).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Vectra 3 Автоматизированная количественная визуализация патологии Перкин ЭлмерCLS142338
анализ клеток inForm 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R программное обеспечениеhttps://www.r-project.org
Dakopen разграничительная ручка DakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 таблеток
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7,6 100 таблеток
Система блокирования биотинаDakoX0590Авидин 0,1% и Биотин 0,01%
нормальная ослиная сывороткаJackson Immunoresearch017-000-0015% об./об. концентрация
Флюоршилд с DAPISigma-aldrichF60571,5 &; г/мл концентрации
Knittel glass coverslipKnittel Glä сер,10003924x60 мм 100 чехол
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055использование на 4&микро; g/mL
Мышь анти-PD-1 Клон NATabcamab52587использование при 2 & микро; г/мл
Козий анти-Тим-3R& DAF2365использование при 3 & микро; г/мл
Кролик анти-PD-L1 Клон SP142Roche7309457001использование при 1 & микро; g/mL
Mouse AF647 меченый пан- Кератиновый клон C11Cell Signalling4528использование при 0,5 & микро; г/мл
Козья античеловеческая гал9R& DAF2045использование при 0,3 и микро; г/мл
Cyan 5 конъюгированный ослик против кроликаJackson Immunoresearch711-175-152применение в 5 & микро; г/мл
Биотинилированный F(ab' 2) ослиный антимышиный IgGJackson Immunoresearch715-066-150применение при 3 & микро; г/мл
Alexa Fluor488 конъюгированный осел антикозий IgGabcamab150133использование при 5 & микро; г/мл
Cy3 меченый стрептавидинАмершамPA43001применение при 3&микро; г/мл
отрицательного контроля мыши IgG1DakoX0931использование при 2 & микро; г/мл
IgG из козьей сывороткиSigma-aldrichI5256использовать при 3 & микро; г/мл
IgG из сыворотки кроликовSigma-aldrichI5006использовать в 4&микро; г/мл

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borghaei, H., et al. Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med. 373 (17), 1627-1639 (2015).
  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
  4. Robert, C., et al. Nivolumab in previously untreated melanoma without BRAF mutation. N Engl J Med. 372 (4), 320-330 (2015).
  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  7. Schadendorf, D., et al. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 33 (17), 1889-1894 (2015).
  8. Ribas, A., Hu-Lieskovan, S. What does PD-L1 positive or negative mean? J Exp Med. 213 (13), 2835-2840 (2016).
  9. Rizvi, N. A., et al. Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science. 348 (6230), 124-128 (2015).
  10. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. OncoImmunology. 6 (4), e1286437(2017).
  11. Pages, F., Granier, C., Kirilovsky, A., Elsissy, C., Tartour, E. Biomarqueurs prédictifs de réponse aux traitements bloquant les voies de costimulation inhibitrices. Bull Cancer. 103, Suppl 1. S151-S159 (2016).
  12. Tumeh, P. C., et al. PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  13. Fourcade, J., et al. Upregulation of Tim-3 and PD-1 expression is associated with tumor antigen-specific CD8+ T cell dysfunction in melanoma patients. J Exp Med. 207 (10), 2175-2186 (2010).
  14. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501(2016).
  15. Wherry, E. J., Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 15 (8), 486-499 (2015).
  16. Cai, C., et al. Tim-3 expression represents dysfunctional tumor infiltrating T cells in renal cell carcinoma. World J Urol. 34 (4), 561-567 (2016).
  17. Sakuishi, K., et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity. J Exp Med. 207 (10), 2187-2194 (2010).
  18. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  19. Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Curr Opin Immunol. 45, 60-72 (2017).
  20. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Res. 73 (1), 128-138 (2013).
  21. Nizard, M., et al. Induction of resident memory T cells enhances the efficacy of cancer vaccine. Nat Commun. 8, 15221(2017).
  22. Nghiem, P. T., et al. PD-1 Blockade with Pembrolizumab in Advanced Merkel-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  23. Roussel, H., et al. Composite biomarkers defined by multiparametric immunofluorescence analysis identify ALK-positive adenocarcinoma as a potential target for immunotherapy. Oncoimmunology. (4), (2017).
  24. Woods, K., et al. Mismatch in epitope specificities between IFNgamma inflamed and uninflamed conditions leads to escape from T lymphocyte killing in melanoma. J Immunother Cancer. 4, 10(2016).
  25. Granier, C., et al. Tim-3 Expression on Tumor-Infiltrating PD-1+CD8+ T Cells Correlates with Poor Clinical Outcome in Renal Cell Carcinoma. Cancer Res. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  26. Feng, Z., et al. Multispectral Imaging of T and B Cells in Murine Spleen and Tumor. J Immunol. 196 (9), 3943-3950 (2016).
  27. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3, 47(2015).
  28. Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
  29. Nizard, M., Roussel, H., Tartour, E. Resident Memory T Cells as Surrogate Markers of the Efficacy of Cancer Vaccines. Clin Cancer Res. 22 (3), 530-532 (2016).
  30. Sandoval, F., et al. Mucosal imprinting of vaccine-induced CD8(+) T cells is crucial to inhibit the growth of mucosal tumors. Sci Transl Med. 5 (172), 172ra120(2013).
  31. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nat Commun. 8, 15095(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Multiplexed ImmunofluorescencePD 1 Tim 3 Co expressionTumor Infiltrating CD8 T CellsFluorescence Multispectral ImagingCell Segmentation AnalysisPhenotyping AlgorithmAutofluorescence RemovalRenal Cell CarcinomaImmune Checkpoint MarkersClinical Prognosis Correlation

Похожие статьи