Методическая статья

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

DOI:

10.3791/56752

⸱

7 марта 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает комбинаторного использования чип seq, 4СУ seq, Общая РНК seq и рибосома профилирование для клеточных линий и главные ячейки. Это позволяет отслеживание изменений в фактор транскрипции привязки, de novo транскрипции, обработки РНК, оборот и перевод с течением времени и отображает общий ход событий в активированных или быстро меняющейся клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После активации, клетки быстро изменить их функциональные программы и, таким образом, их профиль выражения гена. Массовые изменения в экспрессии генов происходят, например, во время клеточной дифференцировки, морфогенез и функциональной стимуляции (например, активации иммунных клеток), или после воздействия наркотиков и других факторов от местной окружающей среды. В зависимости от типа раздражитель и ячеек эти изменения происходят быстро и на любом уровне регуляции генов. Отображение всех молекулярных процессов ответивших ячейки для определенного типа стимул/наркотиков является одним из самых сложных задач в области молекулярной биологии. Здесь мы описываем протокол, который позволяет одновременный анализ нескольких слоев регуляции генов. Мы сравниваем, в частности, транскрипционный фактор привязки (Chromatin иммунопреципитация последовательности (чип seq)), de novo транскрипции (4-thiouridine последовательности (4СУ seq)), обработка мРНК и оборот, а также перевод (рибосомы Профилирование). Объединив эти методы, можно отображать подробные и генома широкий курс действий.

Секвенирование недавно транскрипции РНК особенно рекомендуется при анализе быстро адаптации или изменения систем, поскольку это изображает транскрипционный анализ деятельности всех генов во время воздействия 4СУ (независимо от того, являются ли они вверх - или downregulated). Комбинаторного использования всего РНК seq и рибосома Профилирование позволяет дополнительно расчета темпов оборота и перевод РНК. Bioinformatic анализ результатов высокопроизводительного секвенирования позволяет много средств для анализа и интерпретации данных. Созданных данных также позволяет отслеживать, co-transcriptional и альтернативного сплайсинга, только, чтобы упомянуть несколько возможных результатов.

Комбинированный подход, описанный здесь может применяться для различных модельных организмов или типы клеток, включая клетки первичной. Кроме того мы предоставляем подробные протоколы для каждого используемого метода, включая контроль качества и обсудить потенциальные проблемы и подводные камни.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы последовательности РНК (РНК seq) стала стандартным инструментом для анализа всех выразил РНК в клетки или организма1. Однако чтобы понять весь процесс адаптации в ответ на конкретный раздражитель/наркотиков клеток, необходимо полностью определить все основные процессы, начиная от мРНК транскрипции для обработки, оборот и перевод. Краткосрочные изменения в транскрипции РНК вряд ли может быть измерена всего RNAseq, поскольку изменения всего РНК зависят от факторов например РНК полураспада и транскрипционный анализ деятельности, которые являются плохой шаблон для отражения адаптацию клеток экологические последствия2,3. Действительно было разработано множество различных новых методов секвенирования, которые позволяют проводить анализ различных шагов в процессе гена регулирование4 при сочетании в правильной манере. Этот протокол описывает как объединить некоторые довольно легко применимые последовательности методы, которые позволяют отслеживания регулирование основных слоев мРНК в сравнительной форме. Для анализа транскрипционный анализ деятельности, были описаны различные методы, такие как Кап анализ гена выражение (Кейдж)5, родной удлинение Стенограмма последовательности (NET-seq)6и геном всей ядерной выбега (GRO-seq)7 , 8, а также bromouridine последовательности (Bru-seq) и 4-thiouridine последовательности (4СУ seq), которые используют метаболитов которые включены в недавно транскрипции РНК9,10, только для того, чтобы упомянуть несколько. Хотя Кейдж идентифицирует сайт старт точные транскрипции, NET-seq и ГРУ seq доставить более точной информации о чтении направления и 4СУ seq (который является метод, описанный здесь) обнаруживает только недавно транскрипции РНК. Однако, 4СУ seq очень чувствительна и может применяться в различных временных рамках для измерения количественных транскрипционный анализ активности в активно меняющихся клеток, а также количественные изменения в обработке мРНК (который и происходит в течение нескольких минут)9, 11,12. Кроме того 4СУ seq идеально сочетать с РНК seq для вычисления РНК текучести для генов9. Транскрипция мРНК осуществляется путем РНК-полимераза II (RNAPII), который в свою очередь зависит от множества факторов, таких, как факторы транскрипции, изменения гистона и общие активаторы/подавляющего, которые могут даже быть частью транскрипционный анализ комплекс. Чтобы проверить, сколько гена/промоутер/усилитель регионы руководствуются одним из факторов, был разработан чип seq, который теперь является стандартным методом для этой цели, благодаря много коммерчески доступных антитела13. Однако хотя ChIPseq дает четкую информацию о где регулирующие факторы bind, он не отражает, если это действительно приводит к изменениям в транскрипции14. Таким образом выполнение чип seq с 4СУ seq является идеальное сочетание для таких биологических вопросов. Регуляцию экспрессии генов также может произойти на более позднем этапе, поскольку уровни mRNA и белка не обязательно коррелирует15,16, указывающее потенциально существенные положения о поступательные или столб-поступательные уровень, в зависимости от контекста. В 2011 году рибосома профилирования были впервые объединены с РНК seq и теперь является методом выбора для количественной оценки изменений, которые происходят быстро белка, так как есть еще некоторые ограничения чувствительности с масс-спектрометрии17. Действительно, тарифы на перевод, полученные из таких методов было показано, чтобы доставить относительно хорошую оценку изменений в уровнях белка (по крайней мере измеряется для долгосрочных изменений) и позволяют еще более подробный взгляд на процесс перевода, например определение начала стороне и альтернативного перевода кадров17. Комбинаторного использования всех четырех методов могут быть использованы в устойчивом состоянии, между различными типами клеток, или в времени серийный эксперимент быстро изменяющейся ячейки11. Это использование предоставляет генома широкий обзор изменений в привязке фактор транскрипции, влияющие на транскрипции РНК, обработка и перевод.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы являются в соответствии и соблюдение Гельмгольца Zentrum München институциональных, государственных и федеральных руководящих принципов.

1. Подготовка

  1. Сделать подробный план экспериментальной установки, включая график выполнения, когда добавить 4СУ в среде культуры клеток и когда урожай клетки для каждого метода. В зависимости от биологических вопрос тщательно рассмотреть моменты времени для образец рисования, маркировки 4СУ времени и концентрации (Таблица 1).
    Примечание: Проверить влияние 4СУ на жизнеспособность клеток и подчеркнуть ответ заранее (см «Проверить оптимальные 4СУ маркировки условия» представитель результаты и Рисунок 1). Рекомендуется проводить предварительные испытания каждого метода с по крайней мере один образец. Проверьте, если качество и количество РНК/ДНК является достаточным для глубоких последовательности (см. выделенные части протокола) и практика быстро, но нежный обработки клеток во время эксперимента.
  2. Рассчитать количество клеток, необходимых для каждой точки время каждого метода (см. таблицу 2 для грубой оценки при использовании первичного Т-клетки). Кроме того рассмотрим последовательность меньше образцы всего РНК, чем просто 4СУ РНК (например, только за время точки перевод ставок или РНК оборот ставки должны рассчитываться). Для подтверждения и проверки значимость результатов (рекомендуется), создайте по крайней мере один из биологических репликации.
    Примечание: Важно, для всех методов и точек подряд, образцы должны быть от одного начального пула клеток. Рекомендуется по крайней мере один выделенный исследователь для каждого метода.
  3. Подготовьте все необходимое заранее (например, aliquoted 4СУ, циклогексимида, млекопитающих литического буфера и 1% формальдегида). После добавления 4СУ Избегайте попадания клеток яркий свет, как это может привести к сшивки 4СУ меченых РНК для клеточных белков18.
  4. Объединить все клетки интереса к одной колбе только до начала лечения (рис. 2). Подсчитать ячейки (например, с Горяева) и использовать необходимую сумму для необработанных контроля каждого метода (не забудьте также необработанных элемента управления для 4СУ seq с 4СУ label). Лечить оставшиеся клетки и сразу разделить необходимое количество клеток для каждой точке времени и метода. Как можно минимизировать стресс из-за изменения температуры или CO2 уровни быстрее обработайте клетки.
    Примечание: например, берутся пробы 1 ч, 2 и 3 ч после лечения, затем одна четверть клеток используется для без лечения контроля, и три четверти используются для обработки элемента управления.

2. 4СУ маркировки

Примечание: Этот протокол отличается от Rädle, и др. 19 относятся к их протокол для дополнительной информации о метаболических маркировки с 4СУ. Для всех методов и точек подряд образцы должны происходить из одного начального пула клеток.

  1. Начало маркировки
    1. Потепление aliquoted 4СУ непосредственно перед использованием. Добавить 4СУ в каждый момент времени непосредственно в среде, содержащей клетки интерес (см. в таблице 2 для чисел рекомендованные Т-клеток, наименее 60 мкг РНК на момент времени), осторожно перемешать и место обратно в инкубаторе. Метод Dispose, оставаясь 4СУ (не замораживать).
    2. В конце маркировки собирайте клетки (например, ячейку скребок) и центрифуги на 330 x g 5 мин при 4 ° C в полипропиленовые трубы (которые сопротивляются высокой g сил). Аспирационная среднего и добавить реагент для изоляции РНК (≥1 мл на 3 х 106 клеток, смотрите материалы для рекомендации для использования) к каждой трубе. Полностью Ресуспензируйте Пелле (≥1 мл на 3 х 106 клеток), инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) и заморозить образцов при-20 ° C. Образцы можно хранить при-20 ° C для по крайней мере 1 месяц.
      Осторожностью: Реагентов, используемых для изоляции RNA чрезвычайно опасных при контакте с кожей или глазами. Обрабатывать их с осторожностью и рассмотреть на инструкции по безопасности.
  2. RNA подготовка с помощью изменения РНК Протокол изоляции
    1. Добавить 0,2 мл хлороформа за 1 мл реагента для изоляции RNA и тщательно перемешать путем встряхивания в течение 15 с. продолжить, как указано в протоколе метаболических маркировки (шаг 1-12, 2. RNA подготовка с помощью изменения протокола Тризол) из Rädle и др. 19
    2. Измерение концентрации РНК (см. Таблицу материалы), в соответствии с инструкциями производителя. Используйте этот РНК для всего РНК seq (см. шаг 3. Всего РНК seq) или хранить при температуре-80 ° C для по крайней мере 1 месяц.
  3. Тиоловых конкретных Biotinylation недавно транскрипции РНК
    1. Начните с 30-80 мкг общей клеточной РНК. 60 мкг РНК должна принести достаточное количество новых транскрипции РНК.
    2. Подготовьте обозначая реакции. Пипетку в следующем порядке (за мкг РНК): 1 мкл 10 x Biotinylation буфера, 7 мкл РНК (содержащий 1 мкг РНК, разбавленных в свободной от нуклеиназы H2O) и 2 мкл биотин HPDP (1 мг/мл). Последнее добавление биотина HPDP и смешайте сразу же закупорить. Оберните трубы с алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия яркого света. Смотрите обсуждение альтернативу биотин HPDP. Инкубируйте на RT 1,5 h с вращением.
    3. Соответствующие 2 мл пробирок (см. Таблицу материалы) на 15000 x g на 2 мин Пипетка все биотинилированным РНК в предварительно закружилось 2-мл пробирку, добавить равное количество метилхлороформа и смесь энергично. Проинкубируйте 2-3 мин до фазы начинают отделить и пузырьки начинают исчезать.
    4. Центрифуга на 15000 x g 15 мин при 4 ° C. Тщательно перенесите верхний водной фазе в новой трубки.
    5. Повторите шаги 2.3.3. и 2.3.4. один раз. Добавьте 10% от объема NaCl (5 М) и равный объем изопропанола в водной фазе. Центрифуга на 20000 x g 20 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    6. Добавьте одинаковый объем свежеприготовленные 75% этанола. Центрифуга на 20000 x g. удалить супернатант, спина кратко и удалить остальные этанола. Полностью Ресуспензируйте в 30-100 мкл H2O (использование 1 мкл H2O на 1 мкг ввода РНК из шага 2.3.1), смешивая пипеткой.
    7. Проверка целостности РНК путем электрофоретического анализа, или взять Алиготе и проверить позже.
  4. Разделение вновь транскрипции (помечена буквой) и существующий (без метки) РНК
    1. Удаление парамагнитных бусины (см. Таблицу материалы) от 4 ° C для хранения и пусть она стоять по крайней мере 30 мин довести их до комнатной температуры. Тепла 4СУ Отмывающий буфер (3 мл на сэмпл) до 65 ° C.
    2. Готовят раствор Дитиотреитол (DTT) 100 мм. Весят DTT в ультра-тонкой масштабе и добавить необходимое количество воды, свободной от нуклеиназы. Всегда готовить свежие. Используйте 200 мкл на сэмпл.
    3. Тепло биотинилированным образцов РНК (1 мкг/мкл) до 65 ° C для 10 мин Денатурировать и немедленно разместить на льду. Добавьте 100 мкл стрептавидина бусины биотинилированным РНК и Инкубируйте 15 мин с вращением в рт.
    4. Место соответствующей колонки (см. Таблицу материалы для рекомендаций) для каждого образца в магнитного стенд и заранее сбалансировать каждого столбца с 1 мл комнатной температуре 4СУ Отмывающий буфер.
      Примечание: Это займет около 5-10 мин. Если любой из столбцов не инициировать слив через 5 мин, аккуратно нажмите на колонне с пальца в перчатке.
    5. Применять смесь РНК/бусы в середине каждого столбца. Отбросить проточный, если необходимо восстановить немеченого РНК. Если это так, собирайте потока через и по крайней мере первой стирки. Выполнить восстановление РНК, как описано в Rädle и др. (шаг 1-7, 7. Восстановления неподписанных, несвязанных РНК)19.
    6. Вымойте три раза с 0,9 мл 4СУ Отмывающий буфер (разогретую до 65 ° C с шагом 2.4.2.) и 0,9 мл RT 4СУ Отмывающий буфер, соответственно.
    7. Используйте парамагнитных бусы для восстановления недавно транскрипции РНК. Пипетка 400 мкл хорошо дисперсной RT парамагнитных бусины в трубе за образец и место под каждого столбца. Элюировать недавно транскрипции РНК с 100 µL 100 мм DTT. Подождите 3 минуты и выполните второй элюирование с 100 µL 100 мм DTT. (Необязательно: выполнять элюции и восстановления, как описано в Rädle et al.) 19
    8. Mix вновь тщательно транскрибируются РНК/бусы пипеткой смешивания 10 раз и действовать согласно рекомендации производителя. Элюировать РНК в 11 мкл свободной от нуклеиназы H2O.Quantify РНК с помощью подходящего флуориметр (см. Таблицу материалы). РНК могут храниться при температуре-80 ° C для по крайней мере 1 месяц.
      Примечание: Недавно транскрипции РНК может использоваться для подготовки следующего поколения последовательности кДНК библиотек (см. Таблицу материалов для предложение на какой комплект для использования) или дальше вниз по течению анализы. 100 - 500 нг РНК являются достаточными для большинства библиотеки подготовка комплектов (см. обсуждение).

3. Общая РНК Seq

  1. Прямо взять РНК от 4СУ помечены РНК после подготовки РНК с помощью модифицированных реагент для РНК Протокол изоляции для всего РНК seq (см. шаг 2.2.2.)
  2. Для подготовки библиотека разбавить Алиготе РНК до конечной концентрации 50-100 нг / мкл. Используйте тот же комплект, что касается подготовки библиотека вновь транскрипции РНК. 100 - 500 нг РНК являются достаточными для большинства библиотеки подготовка комплектов.

4. рибосома профилирование

Примечание: Для всех методов и точек подряд, образцы должны быть из одного начального пула клеток. Рекомендации по какой комплект для использования, обратитесь к Таблице материалов.

  1. Подготовка и изоляции рибосома охраняемые фрагментов (РППБ):
    1. Используйте соответствующее количество клеток для каждой точки времени (см. Таблицу 2 чисел рекомендованные Т-клеток). Лечить адэрентных клеток с циклогексимида, как описано в протоколе производителя.
      Предупреждение: Циклогексимида высоко токсичен и может вызвать мутации. Избегайте контакта с кожей и ингаляции.
    2. Сбор и бассейн не - или полу - adherent клетки от каждый раз точка в одной из полипропиленовых труб и отрегулируйте конечной концентрации до 1 x 106 клеток / мл клеток конкретной среды (например, дополненная RPMI для Т-клетки). Добавление циклогексимида с конечной концентрации 0,1 мг/мл, смешивать, инвертирование полипропиленовые трубы и инкубировать 1 мин центрифуги клетки для 5 мин на 330 x g при 4 ° C. Аспирационная среднего и вымыть клетки с по крайней мере 10 мл PBS, дополнена циклогексимида (конечной концентрации 0,1 мг/мл).
    3. Центрифуга клетки для 5 мин на 330 x g при 4 ° C. Аспирационная среднего и добавьте 100 мкл буфера lysis клеток млекопитающих на 10 х 106 клеток. Смешать, закупорить и высылать через стерильную 22 25-иглы для Лизируйте клетки полностью.
    4. Передача lysate клетки к помощи 1,5 мл. Проинкубируйте втечение 10 мин на льду с периодическим инверсий. Центрифуги для 10 мин на 20000 x g при 4 ° C для уточнения lysate. Передать супернатант помощи 1,5 мл.
    5. Подготовить 1:10 разбавление lysate свободной от нуклеиназы водой и запись A260чтения с помощью спектрофотометра. Использовать бесплатные нуклеиназы воду как пустой и 1:10 разрежения буфера lysis клеток млекопитающих как стандарт. Рассчитайте A260/мл концентрация lysate по следующему уравнению:
      (260 клетки lysate -260 млекопитающих буфера Lysis) x коэффициент разбавления 10 =260/мл
    6. Создайте 200 мкл аликвоты от lysate на льду и приступить к лечению нуклеиназы.
      Примечание: При необходимости, подготовить 100 мкл аликвота для всего РНК, 10 мкл 10% SDS и перемешать. Хранить при 4 ° C и продолжить с 4.3.2. Рекомендуется использовать всего РНК от 4СУ меченых РНК (см. шаг 3. Общая РНК seq).
  2. Рибосома footprinting
    1. Проводить лечение нуклеиназы немедленно без замораживания lysate. Добавьте 7,5 единиц нуклеиназы (входит в комплект рекомендуется) для каждого A260 lysate. Например: 80 A260/мл145 lysate x 0.2 мл lysate x 7,5 нуклеиназы U/А260= 120 U нуклеиназы.
      Примечание: При необходимости, Титруйте нуклеиназы для пищеварения, как описано заводом-изготовителем.
    2. Инкубируйте нуклеиназы реакции для 45 мин на RT с нежным смешивания. Заморозить 200 мкл аликвоты от lysate жидким азотом и хранить при температуре-80 ° C, или остановить нуклеиназы реакции, добавив 15 АБС битор РНКазы мкл каждого 200 мкл аликвота и перейдите к шагу 4.3.2.
  3. Очистка РППБ
    1. Размораживать один образец РППБ нуклеиназы переваривается и добавить 15 АБС битор РНКазы мкл. Храните образцы на льду.
    2. Очистить РППБ согласно протоколу производителя (столбец очистки рекомендуется) и измерения концентрации РНК на спектрофотометре.
  4. рРНК истощения
    1. Используйте 5 мкг очищенный РППБ рРНК истощения.
    2. Следуйте производителя протокол (шаг 1-2, истощение первичного рРНК) для рРНК истощения. Измерение концентрации РНК рРНК истощены РППБ на спектрофотометре.
  5. СТРАНИЦА очистка РППБ
    1. Использование 500 нг рРНК обедненного РППБ для очистки страницы.
    2. Подготовьте управления РНК, образцы и лестницы для очистки страницы. Смешайте 5 мкл РНК управления и 5 мкл Денатурирующий гель загрузки красителя в пробки microcentrifuge 0,5 мл. Смесь 10 мкл каждого ПФР с 10 мкл Денатурирующий гель, загрузки, соответственно. Подготовить аликвота лестница (4 мкл 20/100 лестнице, 1 мкл нуклеиназы свободной воды и 5 мкл Денатурирующий гель загрузки краситель). Загрузите его между каждой выборки и контроля для предотвращения crosscontamination.
    3. Денатурируйте образцы и лестница по инкубации при 95 ° C за 5 минут и сразу же место на льду. Загрузить 20 мкл каждого образца (при необходимости загрузить 10 мкл и заморозить остальные образцы при 20 ° C) разделенных 10 мкл подготовленных лестницы на 12% или 15% мочевина Полиакриламид-гель. Загрузите 10 мкл РНК управления. Побегите гель до тех пор, пока группа бромфеноловый синий достигает нижней части геля (180 V, ~ 70 мин) (рис. 3).
    4. Пятно гель по данным производителя протокол при 4 ° C. Используйте темно поле transilluminator, которое испускает голубой свет для визуализации РНК. Акцизный ломтиков геля для каждого образца, соответствующее ~ 28 и 30 nt в длину. Взять под контроль РНК как ссылка и акцизных его.
      Примечание: РППБ едва видны. Акцизный ломтики на указанного размера управления РНК - содержащий два oligos nt 28 и 30 в длину - даже если образцы не видны.
    5. Протыкайте отверстие в нижней части трубы microcentrifuge 0,5 мл стерильной иглой 20-го калибра. Перенесите каждый ломтик гель в отдельные трубки и трубы место сборную в 1,5 мл. Центрифуги для 2 мин в 12000 x g. повторить центрифугирования если фрагменты геля не shred полностью в 1,5 мл трубку.
    6. Элюировать RNA из ломтика нарушается гель с 400 мкл нуклеиназы свободной воды, 40 мкл аммония ацетат (5 М) и 2 мкл SDS (10%), каждую ночь при 4 ° C.
    7. Передать 1,5 мл трубки фильтра (предоставляется с Рекомендуемый комплект) навозной жижи с кончиком пипетки 1 мл (wide родила подсказка или самодельные 1 мл наконечник с разреза конец). Центрифуги для 3 мин на 2000 x g для разделения этого eluted РНК из ломтиков геля. Аккуратно Пипетка водный раствор в 1,5 мл трубку. Добавить 2 мкл гликогена (предоставляется с Рекомендуемый комплект) и 700 мкл 100% изопропиловый спирт и хранить при температуре-20 ° C для по крайней мере 1 час.
    8. Центрифуга на 4 ° C на 20 мин в 13 000 x g. удалить супернатант. Помыть лепешка с предварительно охлажденные свежеприготовленные 80% этанола на 4 ° C на 10 мин на 13000 x g. удалить супернатант и просушите. Ресуспензируйте каждого образца в 20 мкл и управления РНК в 8 мкл нуклеиназы свободной воды. Хранить при температуре от-20 ° C, при необходимости.
  6. Фрагментация, конец ремонт, 3' адаптер перевязки, обратная транскрипция
    1. Выполните процедуру, как описано в протокол изготовителя (фрагментация и окончания ремонта, 3' адаптер перевязки и обратной транскрипции).
  7. СТРАНИЦА очистка cDNA
    1. Подготовка образцов, РНК управления и лестницы для очистки страницы: микс 10 мкл каждого образца и управления РНК с 10 мкл Денатурирующий гель загрузки краситель, соответственно. Подготовить аликвота лестница (4 20/100 мкл лестница, 1 мкл нуклеиназы свободной воды, 5 мкл Денатурирующий гель загрузки краситель). Загрузите его между каждой выборки и контроля для предотвращения crosscontamination.
    2. Денатурируйте образцы и лестница по инкубации при 95 ° C за 5 минут и сразу же место на льду. Загрузить 20 мкл каждого образца (при необходимости загрузить 10 мкл и заморозить остальные образцы при 20 ° C) разделенных 10 мкл подготовленных лестницы на 10% полиакриламида/7 - 8 M мочевины/КЭ лари. Загрузите 10 мкл РНК управления. Побегите гель до тех пор, пока бромфеноловый синий полностью переносит из геля (180 V, ~ 60 мин).
    3. Пятно гель по данным производителя протокол при 4 ° C. Используйте темно поле transilluminator, которое испускает голубой свет для визуализации РНК и акцизный ломтиков геля для каждого образца, соответствующее nt ~ 70-80.
    4. Действуйте, как описано в шаге 4.5.5 - 4.5.8 и Ресуспензируйте каждый образец в 10 мкл нуклеиназы свободной воды.
  8. cDNA рецензий
    1. Подготовка мастер смесь достаточно рецензий для всех реакций, объединяя следующие реагентов для каждого образца на льду: 4.0 мкл рецензий реакции микс, 2.0 мкл АТФ, 2.0 мкл НКД2и 2.0 мкл лигаза.
    2. 10 мкл мастер смеси, для каждого образца. Осторожно перемешать и центрифуги кратко. Проинкубируйте образцы на 60 ° C в течение 2 ч., сразу же место образцы на льду.
  9. Амплификации PCR
    1. Следуйте производителя протокол (шаг 1-3, амплификации PCR) для амплификации PCR. Используйте 4 мкл circularized cDNA для усиления с 9 циклов PCR для первичного Т-клеток, для достижения наилучших результатов.
    2. Очистить библиотек и проверить их распределение по размерам, по данным производителя протокол (шаг 4-8, ПЦР-амплификации). Ожидаемый размер усиливается библиотеки является bp 140-160 (см. Рисунок 4).
    3. Для секвенирования библиотек обратитесь к протокол изготовителя и объект последовательности для дальнейшего руководства.

5. чип Seq

Примечание: Этот протокол изменяется от Blecher-Гонен, и др. 14 , относятся к их протокол для дальнейшей информации относительно чип seq. Для всех методов и точек подряд образцы должны быть от одного начального пула клеток.

  1. Сшивки и уборке клетки
    1. Crosslink соответствующее количество клеток (см. Таблицу 2 рекомендованных Т-клеток чисел) для каждой точки время с конечной концентрации 1% формальдегида в cellspecific среде (например, дополненная RPMI для Т-клетки) для 10 мин при комнатной температуре с плавное покачивание. Остановите сшивки реакции путем добавления глицин до конечной концентрации 0,125 м.
    2. Центрифуга клетки на 330 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и вымыть клетки в ледяной PBS. Повторите шаг 5.1.2 дважды и заморозить клеток окатышей на-80 ° C. Замороженные гранулы могут храниться для по крайней мере 6 месяцев.
  2. Лизис клеток и Sonication
    Примечание: Во всех клеток лизис и sonication шаги, образцы должны храниться на льду или на 4 ° C для сведения к минимуму деградации вспять и белка crosslink.
    1. Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл ледяной ячейки литического буфера с ингибиторы протеазы свежезаваренным добавлен изолировать ядер (при необходимости добавьте битор фосфатазы). Проинкубируйте втечение 10 мин на льду и центрифуги на 2600 x g 5 мин при 4 ° C.
    2. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте ядра гранул 1 мл ледяной ядер литического буфера с ингибиторы протеазы свежезаваренным добавлен (опционально: добавить битор фосфатазы). Проинкубируйте втечение 10 мин на льду. Sonicate клетки для создания средняя фракция размер ДНК 0.2 - 1.0 kb (см. Рисунок 5).
      Примечание: Sonication условий необходимо быть оптимизированы в соответствии тип ячейки и далее условия (например, номер ячейки, объем и буфера). Для первичного Т-клеток sonication для 20-25 циклов рекомендуется (см. материалы для подробного описания).
    3. Возьмите 20-50 мкл аликвота стриженый хроматина и тепла для 10 мин при 95 ° C и 1000 об/мин, пожимая выполнить быстрый обратный crosslink и проверить размер хроматина. 2-5 мкл протеиназы K и проинкубируйте втечение 20 мин на 56 ° C и покачивая 1000 об/мин. Выполнение тепловой инактивации 10 мин при 95 ° C и покачивая 1000 об/мин. Очищают хроматина с соответствующим kit (см. Таблицу материалы). Проверьте размер хроматина на геле агарозы 1% и использовать 100 bp Plus маркер.
    4. Центрифуга стриженый хроматина со средним ДНК размер фракции 0.2 - 1.0 kb 10 мин на 20000 x g и 4 ° C для пеллет нерастворимых хроматина и мусора. Супернатант передать новой трубки и держать на льду.
    5. Держите 5-10% sonicated хроматина в качестве входных данных. Замерзает при-20 ° C (используется в шаге 5.5.2).
  3. Пара антитела к бисеру
    1. Пара 10 мкг антител (например, анти РНК Pol II; анти Хистон H3K36me3) в 220 мкл PBS (с BSA 0,5% и 0,5% анимации 20) до 80 мкл суперпарамагнетическим бисера в сочетании с белком G (см. Таблицу материалы) для по крайней мере 1 ч при комнатной температуре с вращением.
    2. Место труб на магнит. Подождите, пока все бусины привязаны к магниту и удалить супернатант. Далее блок с 6 мкл sonicated спермы лосося ДНК в PBS (с BSA 0,5% и 0,5% анимации 20) за 30 мин при комнатной температуре с вращением.
    3. Место труб на магнит. Подождите, пока все бусины привязаны к магниту и удалить супернатант ясно. Вымойте бусы с буфером чип IP три раза.
  4. Иммунопреципитации Chromatin
    1. Разбавить хроматина в 1 мл общий объем литического буфера ядра с ингибиторы протеазы свежезаваренным добавлен (при необходимости добавьте битор фосфатазы). Добавить IP чип буфер с ингибиторы протеазы свежезаваренным добавлен (при необходимости добавьте битор фосфатазы) окончательный объемом 3 мл. Держите на льду или на 4 ° C, в то время как антитела в сочетании с бисером.
    2. Добавьте разбавленный хроматина антитела к сочетании бусы из шага 5.3.3 и инкубировать за ночь при 4 ° C с нежным вращения.
    3. Промойте следующие буферы (1 мл каждый, см. Таблицу материалов) при комнатной температуре за 5 мин с вращением, место трубы обратно на магните и удалить супернатант: мыть буфера я, мыть буфера II, III мыть буфера и 2 x TE рН 8,0 соответственно.
    4. Отменить супернатант и просушите ~ 5 мин.
  5. Обратного сшивания
    1. Удаление образцов от магнита. Добавьте 50 мкл Элюирующий буфер и смешивать, закупорить элюировать ДНК белковых комплексов из бисера.
    2. Включать входной представленном(ых) от этот шаг вперед. Добавить Элюирующий буфер ввода представленном(ых) для окончательный объем 50 мкл (чтобы сохранить состав буфера похож на чип образцы) и процесса вместе с образцами чип.
    3. Mix 3 мкл Элюирующий буфер и 2 мкл РНКазы (DNase бесплатно). 5 мкл смеси для каждой выборки и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
    4. Смешайте 2,5 мкл протеиназы K, 1 мкл гликогена и 1,5 мкл Элюирующий буфер на сэмпл. 5 мкл смеси для каждой выборки (1 U протеиназы K и 20 мкг гликогена на сэмпл) и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
    5. Проинкубируйте образцы при 65 ° C ночь (по крайней мере 4 h) встряхивании для выполнения обратного сшивания.
    6. Место труб на магните для по крайней мере 30 s и передачи супернатант к новой пробке. Образцы могут быть заморожены при-20 ° C до 12 месяцев.
  6. Очистка ДНК
    1. Мкл 140 хорошо рассредоточенных парамагнитных бисера в 60 мкл пример (2.3:1 соотношение). Тщательно Пипетка вверх и вниз 25 раз, чтобы тщательно перемешать. Убедитесь, что жидкость в каждой тюбике однородной. Инкубации при комнатной температуре на 2 мин место трубы на магните для 4 мин, или до тех пор, пока все швы будут привязаны к магниту и отбросить супернатант.
    2. Оставьте трубы на магните и 200 мкл свежеприготовленные 70% этиловом спирте. Инкубировать трубы для 30 s не нарушая бисер. Отменить супернатант и повторите этот шаг еще раз. Аспирационная этанола полностью и пусть парамагнитных бусины просушите на 4 мин.
      Примечание: Удаление неполной этанола может серьезно уменьшить восстановления ДНК и выход. Сухие гранулы, только до тех пор, пока он высохнет. Чрезмерного высыхания гранулы могут уменьшить восстановления ДНК и урожайности.
    3. Удаление трубы из магнита и 20 мкл 10 мм трис-HCl (рН 8,0). Аккуратно Пипетка весь громкости 25 раз, чтобы тщательно перемешать. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре. Место труб обратно на магните для 4 мин и передать другой трубки супернатант.
    4. Измерить количество ДНК с подходящей флуориметр (см. Таблицу материалы).
    5. Убедитесь, что чип был успешным, ПЦР (разбавить 1 мкл в µL 100 мкл H2O и использования 2-5 для ПЦР). Использование конкретных грунтовки для положительный (сайт известных связывания белка интерес) и отрицательный контроль (например, ген, это молчание и/или не целевой протеина интереса).
      Примечание: Библиотека подготовка может быть выполнена с 2 нг чип ДНК в зависимости от комплекта (см. Таблицу материалов для предложение на какой комплект для использования).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4 Су маркировки: проверить оптимальные 4 Су маркировки условий (апоптоз, ядерный стресс, цитоплазматических стресс), время и концентрация: Высокий уровень 4СУ может тормозить производство и обработка рРНК и побудить цитоплазмы, а также ядерный стресс30. Таким образом клетки интереса должны быть проверены на 4СУ индуцированной стрессом, а также апоптоз. Западный анализ помаркой рекомендуется для визуализации p53 накопления, который указывает ядерный стресс, увеличивая уровни фосфо EIF2a, отображающие цитоплазматических стресс и активирован флуоресценции клеток, сортировка (FACS) Анализ апоптоза. Высокий уровень и длительным воздействием 4СУ или наркотиков, как увеличивается или арсенита может использоваться для стимулирования клеточного стресса. Чтобы побудить смерти apoptosis или клетки, клетки лечили BH3I-1 (500 нг/мкл) или инкубирован за 5 мин при 95 ° C (теплового шока). Annexin V/7-AAD пятнать была использована для определения apoptotic (Annexin V) и мертвых (7-AAD) клетки. Маркировки в пробирке создан первичный Th1 клетки для 0,5 ч с 500 мкм 4СУ (конечная концентрация) или 1 час с 200 мкм 4СУ не индуцирует признаки клеточного стресса, ни апоптоз (рис. 1) но привести к достаточно 4СУ инкорпорации.

РНК, маркировка время также может быть сокращен (≤5 мин) что приводит к увеличению недолго intronic последовательностей по сравнению с более маркировки раз. Чтобы визуализировать co-transcriptional сращивания ставки, маркировки 4СУ раз не должен превышать 30 мин. Более подробная информация о 4sUlabeling пожалуйста, обратитесь к Rädle и др. 19

Контроль качества: Целостность РНК имеет большое значение при обработке РНК. Это наиболее удобно проверить качество РНК 4СУ меченых РНК после biotinylation методом electrophoretical анализа (см. Таблицу материалы). Рассмотрим, проверка изолированных РНК из шага 2.2.2, особенно при использовании его для секвенирования всего РНК. Число целостности РНК (Рин) должно быть ≥8 для обеспечения целостности РНК для дальнейшей обработки (рис. 3).

Electrophoretical анализ может также использоваться для проверки недавно транскрипции РНК. Имейте в виду, что недавно транскрипции РНК содержит значительно менее зрелых теорией, по сравнению с общей РНК с типичной рРНК полос, будучи гораздо менее заметными.

Рибосомы профилирование: ПЦР-амплификации кДНК библиотеки: амплификация cDNA (шаг 4.9.1) является важным шагом для обеспечения хорошей последовательности результатов. Анализировать усиливается библиотек electrophoretical анализа. Хороший пример усиливается библиотек пик вокруг bp 140-160 (рис. 4A). Чрезмерное количество адаптера, димеры следует избегать (рис. 4B), и эти образцы следует далее очищается с помощью процедуры очистки страницы согласно производителя протокол (страница очистки продуктов ПЦР). Слишком много шаблон или слишком много циклов PCR может привести к чрезмерной амплификации, характерно появление полосы молекулярный вес более высоких, чем ожидалось, смазывают продуктов ПЦР и адаптер димер продуктов (рис. 4 c). Для большинства образцов 1-5 мкл circularized cDNA и 9 циклов PCR для амплификации обычно даст достаточное количество правильный продукт PCR.

Микросхема: Chromatin стрижка: Оптимальный наклон условия должны быть скорректированы для каждого типа клеток. Заранее определите наклон условия (например, количество циклов, высокой или низкой мощности). Используйте одинаковое количество клеток и такой же объем для тестирования, поскольку более низкую плотность клеток увеличивает эффективность сдвига. Старайтесь избегать над - или под стрижка хроматина. Фрагменты большой хроматина может значительно повлиять на результаты чип закупоривания, и чрезмерно стрижка может уничтожить epitopes на протеин интереса, ведет к снижению эффективности привязки антитела. В этом эксперименте, были достигнуты лучшие результаты, когда основная часть стриженый хроматина было около 1000 bp или немного ниже (Рисунок 5A).

Проверка чип на ПЦР: Перед началом чип, целесообразно проверить, если используемые антитела подходит для чипа (если возможно, используйте антитела класса чип), чип ПЦР. Проверьте чип для виртуализации, ПЦР перед началом подготовки библиотеки (см. шаг 5.6.5). Праймеры дизайн, привязанные к известным целевой сайт протеина интереса. Если неизвестно точное целевой сайт внутри ген, несколько пар грунт может использоваться для проверки гена и связанных с ними нормативных элементов. Для RNAPII чип Th1 клеток Ifng, который -транскрипционно upregulated после стимуляции, и актина грунты могут использоваться как позитивный элемент управления. Sox9 и инсулина служат отрицательный контроль, так как эти гены не выражаются в клетках Th1 (Рисунок 5B). Не забудьте использовать Экзон охватывающих грунты, которые обычно используются для ПЦР мРНК. Элемент управления IgG может использоваться также доказать специфика используемых антитела. Immunoprecipitated ДНК может быть измерена с подходящей флуориметр (см. Таблицу материалы). Количество nonspecifically связанного ДНК IgG управления должен значительно ниже по сравнению с суммой ДНК, обязательность антитела интерес.

Реплицирует: доказательство биологическое значение: Настоятельно рекомендуется выполнять кинетическая эксперимент для всех методов, начиная от одного пула клеток, чтобы убедиться, что клетки имеют одинаковую идентификацию всех необработанных и обработанных образцов (рис. 2). Тем не менее рекомендуется принять небольшие аликвоты основного времени точек для каждого метода для сравнения образцов биологического репликации (например, путем ПЦР, анализ СУИМ). Это позволяет для грубой оценки, если лечение для обоих реплицирует воспроизводимость и можно приступать к виртуализации. Проверка реплицирует должно выполняться с помощью биоинформатический анализ. Воспроизводимость результатов может оцениваться с точки зрения корреляции между значениями FPKM между реплицирует и визуализированы с помощью точечных участках (рис. 6).

figure-results-1
Рисунок 1: Проверка оптимальных условий 4СУ маркировки без нарушается физиологии клетки (рисунок от Давари и др. 11)
(A) обнаружения апоптоза клеток СУИМ анализ: В пробирке создан Th0 клетки были относиться с различной концентрации 4СУ (указывается в скобках) 0,5 ч, ч. 1 и 2 h, соответственно. Лечение BH3I-1 был использован для индуцировать апоптоз определяется Annexin V, тогда как для вызывать гибель клеток, определяется 7-AAD использовался теплового шока (5 мин на 95 ° C). (B) Западный анализ помаркой для p53 4СУ лечение и активация Т-клеток: образцы были помечены с 200 мкм 4СУ за указанное время активации, за исключением точки 0,5 ч время, которое было названо с 500 мкм 4СУ. (C) Западный анализ помаркой фосфо EIF2a и всего EIF2a в активированные Th1 клетки с маркировки те же условия (B). Увеличивается был использован как позитивный элемент управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематичный обзор кинетическая установки для отслеживания изменений на уровне генома
Эта схема иллюстрирует установку для объединения 4СУ seq, всего РНК seq, профилирование рибосомы и чип seq для изучения генома изменения после лечения. Объединять ячейки и выделить необходимое количество клеток для без лечения управления. Лечить оставшиеся клетки и разделить для каждого метода и времени точки. Ярлык не лечить и лечить клетки для 4СУ seq с 4СУ как описано. Моменты времени и образцы для каждого метода зависят от конкретных биологических вопрос рассматривается. Образцы для каждой точки время и метод и следовать выделенный частью протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: контроль качества 4СУ меченых РНК
Общая РНК и биотинилированным РНК, полученные из активированные клетки Th1 были проанализированы на Bioanalyzer. Показываются 18S рРНК и 28S рРНК и РНК целостности число (Рин) дается инструмент для определения целостности РНК. Рин должно быть ≥8 для обеспечения целостности РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Bioanalyzer профили рибосомы, профилирование библиотек
(A) A хорошая библиотека: образец показывает пик на ожидаемый размер диапазона (140-160 bp) и без дальнейших очистки требуется. (B) Этот образец показывает чрезмерного адаптер димер усиливается продукт (120 bp) относительно желаемого продукта (140-160 bp). Эта библиотека требует дальнейшей очистки. (C) пример чрезмерно усиливается: более высокие, чем ожидалось молекулярный вес пики и смазывают ПЦР ампликонов видны (обозначается стрелками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Оптимальный хроматина размер после стрижки и проверки чипа, ПЦР
(A) агарозы гель картина показывает размер оптимальный фрагментов из стриженого хроматина из трех образцов, которые были стриженый для 25 циклов на sonicator и очищенный, как описано ранее в протоколе. (B) Q-ПЦР результаты всего микросхемы RNAPII (анти РНК Пол II, 8WG16, ab817) представлена как процент ввода. IFNG и актина грунтовки были использованы в качестве позитивного пока Sox9 и инсулина негативный контроль (оба гены не выражаются в активированные клетки Th1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Сравнение биологических реплицирует (рисунок от Давари и др. 11)
Представитель точечная, сравнивая значения выражения (FPKM) между реплицирует недавно транскрибируется (4СУ) РНК 4 ч после стимуляции клеток активированных Th1. Зеленая линия показывает равные значения FPKM и корреляции указывается в каждом сюжете.

Продолжительность маркировки (мин)Рекомендуемые 4СУ концентрация (мкм)
120100 - 200
60200 - 500
15 - 30500 - 1000
< 10500 - 2000

Таблица 1: Рекомендуемые 4СУ концентрации (от Rädle, и др. 19)
Диапазон рекомендуемых 4СУ концентраций указан на разные времена маркировки.

МетодМобильный номерСумма РНК
4СУ маркировки≥2 x 107 ≥60µg
Рибосома профилирование≥2 x107
Чип seq≥2 x 107 - 3 x 10-7

Таблица 2: Необходимое количество первичных клеток T
Минимальное количество необходимых первичных клеток T для каждого метода. Суммы могут быть меньше при использовании других типов клеток.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализируя весь процесс регуляции генов необходимо полностью понимать клеточной адаптации в ответ на конкретный раздражитель или лечения. Сочетание всего РНК seq, 4СУ seq, рибосома профилирование и чип seq в разное время точках приводит к всесторонний анализ основных процессов регуляции генов с течением времени. Для определения экспериментальной установки, а также оптимальное время точки требуется глубокое понимание биологических процессов.

Поскольку методы для изучения гена регулирование улучшить быстро, эти протоколы могут быть адаптированы к быстрым изменениям. Тем не менее они обеспечивают наиболее важные методы для изучения механизмов регулирования основных генов в любой тип клеток. Здесь мы рассмотрим некоторые из ловушек и факты, которые необходимо учитывать при использовании этих методов.

Клетки: Клетки должны быть весьма жизнеспособной и, если с помощью первичных изолированных клеток, чистоту клеточных популяций должна быть гарантирована (например, анализ СУИМ для первичного Т-клетки). Даже немного подчеркнул клетки могут повлиять на результаты этих методов очень чувствительной последовательности и снизить количество вновь переписаны или переведенный НКА и привести к нежелательных отсчетов реакции стресса в последовательности результатов. Скорость центрифугирования, упомянутых в этом протоколе для пеллет клетки оптимизирован для первичного Т-клеток. Таким образом регулировать скорость в зависимости от типа ячейки.

4 Су эффекты на физиологии клетки: Помимо вышеупомянутых вариантов для проверки минимальной возмущений в клеточной физиологии при добавлении 4СУ могут выполняться дополнительные и/или дополнительного анализа, особенно, когда число клеток ограничены. Влияние на пролиферацию клеток может быть проверена путем проверки время удвоения клеток путем простого подсчета маркировку и непомеченного клетки. Ядрышковые стресс индукции также может быть проверена анализа морфологии клеток через иммунофлюоресценции окрашивание nucleolin и ядер. Для дальнейшей проверки воздействия 4СУ, измененные глобальные ген выражение можно судить по корреляции читать графов с метками всего РНК к немеченому всего РНК.

Мобильных номеров: В пробирке создан Т-клеток мы рекомендуем, начиная с по крайней мере количество клеток, указанных в таблице 2. Выбор надлежащего числа метода в зависимости от типа клеток. Так как Т-клетки имеют меньше цитоплазмой и РНК, по сравнению с другими клетками, скорее нижнюю других ячеек будет адекватной. Для чип seq числа клеток сильно зависит антитела, используемые и уровень экспрессии протеина интереса внутри клетки. Для гистона или RNAPII чип может использоваться ДВ клетки, тогда как число клеток необходимо увеличить при использовании факторов транскрипции, особенно если они выражены при низких уровнях.

4 Су маркировки и РНК biotinylation: При использовании адэрентных клеток, 4СУ маркировки могут быть направлены, как описано в Rädle и др. 19 начиная с клетки очень быстро включать 4СУ, его можно добавить непосредственно в среде подвеска, сторонником или полу адэрентных клеток.

Рекомендуется для запуска biotinylation с 60-80 мкг РНК. Тем не менее, меньше количества РНК могут быть использованы, хотя мы не тест менее чем 30 мкг. Добавить coprecipitant (например, GlycoBlue) при проникающих РНК, если шарик трудно увидеть. Даффи et al. также показали, что methylthiosulfonate активированный биотин (МТС биотин) более эффективно реагирует с надписью 4СУ РНК чем HPDP-биотин31. Следовательно она может быть стоит рассмотреть переход на МТС биотин, в частности, для восстановления малых РНК, которые склонны иметь меньше уридина остатков (см. biotinylation протокол, упомянутые Даффи и др.; см. Очистка 4СУ меченых РНК, Экспериментальные методы).

Для восстановления недавно транскрипции РНК можно использовать парамагнитных бусы или Очистка РНК бусины по вашему выбору. Всегда принимать во внимание, что эти комплекты могут или не могут очистить для конкретных молекул РНК. Например если вы заинтересованы в адаптивной, рассмотрите возможность использования конкретные наборы для захвата Мирна и последовательности.

Количественной оценки недавно транскрипции РНК: Чтобы точно измерить недавно транскрипции РНК, измерение должно выполняться подходящего флуориметр (см. Таблицу материалы). В течение 1 ч 4СУ воздействия недавно транскрипции РНК представляет около 1-4% всего РНК. Недавно транскрипции РНК 1 ч помечены, активированные Т-клетки состоит из ~ 90-94% рРНК11.

Рибосомы профилирование: При создании метода, мы определили, что использование 1.5 x количество нуклеиназы, чем предлагается в исходный протокол гарантирует правильное пищеварение. Кроме того побочные эффекты не сообщалось на повышенных количествах нуклеиназы. Так как это довольно трудно overdigest РППБ, хотя они являются частью РНК, обязательность рибосомных белки, можно еще немного увеличить объем к Титруйте оптимального нуклеиназы пищеварение.

Если меньше, чем 500 нг ПФР РНК были восстановлены в шаге 4.4.2, повторяю, рРНК истощения и бассейн очищается РППБ с РНК Clean & концентратор-5 столбцов. Кроме того Загрузите два идентичных образцов рядом друг с другом на геле (шаг 4.5.3) и бассейн гель фрагментов во время элюции РНК от геля (шаг 4.5.6).

Мы рекомендуем, резка РППБ на геле максимально плотно групп nt 28 и 30. Это помогает в устранении ненужных фрагментов с теорией и tRNAs, которая позже станет частью вашей библиотеки и уменьшить считывает последовательность для вашего РППБ.

Также рекомендуется избегать УФ света во время очищения геля. Это может создать Ники в РНК фрагменты, а также пиримидина димеры, которые в конечном итоге может серьезно повлиять на Библиотека подготовки и последовательности результатов.

Библиотека подготовка и последовательности данных: Рибосомы, профилирование протокол позволяет создать библиотеку cDNA, подходящих для виртуализации. Образцы, порожденных 4СУ маркировки может использоваться для приготовления библиотека с любой соответствующий комплект последовательности РНК. После недавно транскрипции РНК особенно при использовании коротких маркировки раз, может быть еще не polyadenylated, не поли-выбор должны выполняться. Вместо этого, мы настоятельно рекомендуем рРНК истощения, чтобы предотвратить уменьшение глубины последовательности для действительного образца. С помощью Т-клеток, мы начали с 400 нг вновь переписаны и общая РНК (в зависимости от комплекта, см. материалы), выполненных рРНК истощения и сокращение циклов для амплификации PCR для сведения к минимуму предвзятость ПЦР. Подготовка библиотеки могут быть выполнены с меньше исходного материала. Для учета библиотеки сложности количество циклов PCR должны быть оптимизированы.

Для чип seq также имеются многочисленные наборы для приготовления библиотеки. В нашей библиотеке руки подготовка работал хорошо, начиная с 2 нг чип ДНК (см. материалы для предложение на какой комплект для использования). Не забудьте проверить индексы для цветовой баланс во время виртуализации. Мы рекомендуем последовательности глубины ≥40 х 106 читает каждый 4СУ seq, всего РНК seq, и чип seq образцы и ≥80 x 106 гласит на рибосомы, профилирование образцы. Секвенирование глубина зависит выборки и анализа течению биоинформатики и следует тщательно рассмотреть. Для анализа intronic читает для cotranscriptional сращивания, 100 bp в паре конец последовательности должен быть выбран.

Последовательности предвзятости: Секвенирование стал золотым стандартом при определении глобальных изменений в транскрипции, перевод или связывания фактор транскрипции. В последние годы существующие методы были толкнул до предела или новые методы были разработаны для виртуализации все больше начиная небольшое РНК. Это требует амплификация cDNA, который вводит шум или уклон. Недавно уникальные идентификаторы молекулярные (UMIs) были разработаны для экспериментально определить дубликаты, представленный ПЦР. Недавно было показано, что UMIs просто слегка улучшить последовательность мощности и уровень ложных обнаружения для дифференциальной ген выражение32. Тем не менее рекомендуется использовать уникальные идентификаторы молекулярные (UMIs) для всех библиотек виртуализации для управления для библиотеки сложности, особенно когда начиная с низкого количества РНК и когда требуется много циклов PCR.

Буфер и фондовых решения: Все буферы 4СУ seq и рибосома профилирования должна быть подготовлена в строгих условиях, RNase бесплатно, с использованием воды, свободной от нуклеиназы. Мы рекомендуем вам купить готовые бесплатные нуклеиназы NaCl, трис-HCl, ЭДТА, цитрат натрия и воды. Для обеспечения свободной от нуклеиназы условий, RNase Обеззараживание решение может использоваться для очистки пипетки или поверхностей. Все буферы для чип seq необходимо быть по меньшей мере DNase бесплатно и может храниться при комнатной температуре. Всегда добавить ингибиторы протеазы и, при необходимости, битор фосфатазы прямо перед использованием и держите на льду.

Биоинформатика: Анализ всех данных последовательности (то есть, чип seq, РНК seq и ribsosome профилирования) включает в себя контроль качества (например, с помощью FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), обрезки адаптер (например, с 20cutadapt) следуют картирования генома ссылка для клетки под исследование. РНК seq данных (как общей, так и 4СУ seq), а также рибосомы, Профилирование данных требуется сращивания РНК seq mapper, например ContextMap 221. Для выравнивания данных unspliced чип seq используя АДЖ-MEM22 является достаточным. Экспрессии генов могут быть рассчитаны с помощью модели (читает за Kilobase экзона за миллион сопоставить фрагменты) RPKM1, после определения читать сиг / Джин с помощью программы, например featureCounts23. Для вызова пик от чип seq данных, доступны ряд программ, например, MACS24 или25GEM. Далее вниз по течению анализы могут быть выполнены в R26, в частности с помощью инструментов, предоставляемых Bioconductor проекта27.

Одной из основных задач в деле интеграции 4СУ - и всего уровнем РНК и переводческая деятельность от рибосома профилирование вот нормализации. Классический подход к решению этой проблемы является нормализация уровня домоустройства генов. Чтобы уменьшить шум из-за случайных колебаний для отдельных генов домоустройства, рекомендуется не только использовать несколько домоустройства генов, но средний уровень для более широкого набора, например > 3000 домоустройства генов, составленный Айзенберг и Леванон28 . Для расчета показателей текучести РНК от соотношения 4СУ-до всего РНК, нормализации основан на средний оборот ставки (например, предполагая РНК полураспада 5 h)29. Однако поскольку это предполагает не общего изменения для домоустройства генов, мы рекомендуем использовать анализ подходов зависит от нормализации, например, кластеризацию рядов различных типов данных для выявления групп генов на основе корреляции с различных поведение в транскрипции и трансляции во время активации. Подробное описание по интеграции биоинформатический различных типов данных мы ссылаемся на оригинальной публикации11.

Анализ интеграции данных и темпы оборота: Недавно опубликованный документ33 , сравнивая полураспада определяется элемент управления мультиплексированных гена (MGC) глобальные методы можно показать, что полураспада коррелирует с полученными метаболических обозначая методами, по сравнению с другими методами (например, лучшее Общие ингибирование транскрипции наркотиков). Однако следует отметить, что различия между half-life расчеты могут возникнуть и были описаны в 15,34. Мы составляют большую часть проблемы и разногласия, которые появились в ответ стресса из-за длительного 4СУ воздействия. Таким образом необходимо исключить стресс ответ, представленный 4СУ маркировки. Для дополнительной проверки текучесть, мы рекомендуем использовать mgc.

Кроме того набор данных, созданный здесь также могут использоваться для более комплексных данных анализа (например, регулирование длиной некодирующих RNAs)35,36.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ларса Dölken за советы установить 4СУ маркировки для первичного Т-клеток; Элизабет Graf и Томас Schwarzmayr для критических помощь в библиотеке поколений и последовательности; Дирк Eick и Эндрю Флетли за предоставление RNAPII и Т-клеток антител; N. Генриетта Uhlenhaut и Franziska Greulich за помощь в подготовке библиотека для чип seq; Кэролайн C. Фриделя было поддержано грантов FR2938/7-1 и CRC 1123 (Z2) от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Гласмахер было поддержано Грант GL 870/1-1 из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) и немецкий центр для исследования мочеизнурения (DZD), Гельмгольца Zentrum München.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4sU-мечение
4-тиуридин (100 мг)Carbosynth13957-31-8Приготовьте 50 мМ бульон в стерильном H2O/PBS; храните в – 20° C в аликвотах 50-500 &; l; Не замораживайте повторно.
Пробирки с безопасным замком 1,5 млEppendorf30121589Дополнительные
полипропиленовые пробирки с завинчивающимся верхом 1,5 млSarstedt72692005Совместимы с диметилформамидом
15 мл ТубыBD Falcon352096Совместимы с диметилформамидом
2,0 мл Полипропиленовые тубыSarstedt72694005Совместимы с диметилформамидом
50 мл пробирки BD Falcon352070Совместимы с диметилформамидом
Agencourt RNAClean XPBeckman CoulterA63987Мы рекомендуем использовать эти парамагнитные бусины. Аликвот и хранить при 4° C
ХлороформSigma Aldirch372978ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ – ОПАСНЫЙ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ
ДИМЕТИЛФОРМАМИДSigma AldrichD4551
Дитиотреитол (ДТТ)Roth6908.1Готовьте в виде 100 мМ ДТТ в нуклеазном H<суб>2О; всегда готовьте свежий
этанолMerck1.00983.1000
EZ-Link Биотин-HPDP (50 мг)Пирс21341Приготовьте 1 мг/мл стокового раствора, растворив 50 мг Биотина-HPDP в 50 мл ДМФА. Мягкое прогревание усиливает солюбилизацию. Хранить по адресу 4° С в аликвотах 1 мл. ДМФА растворяет некоторые пластические материалы. Мы рекомендуем использовать стеклянные пипетки для переноса DMF из стокового стеклянного флакона в пробирки Falcon объемом 50 мл.
Высокочувствительный набор ДНКAgilent Technologies5067-4626
ИзопропанолMerck1.09634.1011
NaCl (5M)Sigma Aldrich71386Стоковый раствор
нуклеазный безнуклеазный ЭДТА (500 мМ), pH 8.0Invitrogen15575-020Стоковый раствор
нуклеазный H2OSigma AldrichW4502Стоковый раствор
без нуклеазы Tris Cl (1M), pH 7,4Lonza51237Стоковый раствор
Phase Lock Gel Тяжелые пробирки (2,0 мл)5Prime2302830Используйте на шаге 1.3.4.
Полипропилен 15  мл центрифужные пробиркиGreiner Bio-One188271Или эквивалент; они должны выдерживать до 15 000 раз >
QIAzol Lysis Reagent (200 мл)Qiagen79306Используйте этот или эквивалентный реагент TRI для выделения РНК, ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ &NDASH; КОРРОЗИОННЫЙ И ОПАСНЫЙ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ! Обеспечьте немедленный доступ к антидоту фенола (ПЭГ-метанол)
Набор для анализа РНК QubitHS Life TechnologiesQ32852Используйте этот набор для количественного определения количества РНК на шаге 1.4.11
RNeasy MinElute KitQiagen74204Опционально; включает буфер RLT
Цитрат натрияSigma AldrichC8532Приготовьте 1,6 М стоковый раствор с использованием воды без нуклеазы
Tween 20Sigma AldrichP1379
&микро; Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Магазин в 4° C, включает в себя µ Macs, используемые в шаге 1.4.6. (магазин на RT)
Cell Viability and stress Analysis
PE Annexin V Набор для обнаружения апоптоза IBD Biosciences559763Опционально
ТапсигаргинSigma-AldrichT9033Опционально
p53abcamab26Опционально
p-EIF2a (Ser51)Cell Signaling9721Опционально
BH3I-1Sigma-AldrichB 8809Опционально
<сильно>Буферы
4sU Промывочный буферхранить при ОТ100 мМ Трис pH 7,4, 10 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, 0,1% Tween 20 в безнуклеазном буфере для биотинилирования H2O
(10x)хранить при 4 ° C100 мМ Tris pH 7,4, 10 mM EDTA в безнуклеазной воде; сделать аликвоты по 1 мл; хранить при температуре 4°С; Буфер
для осаждения C РНКхранится в RT1,2 М NaCl, 0,8 М цитрата натрия в воде, свободной от нуклеаз. Приготовьте заранее в условиях, не содержащих нуклеазы. Хранить при комнатной температуре в соколиных тубах объемом 50 мл.
Equipment
2100 Биоанализаторприбор AgilentG2939BA
РНК 6000 Nano KitAgilent5067-1511Используйте этот набор для проверки целостности РНК на шаге 1.3.10
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513Опционально
УФ/ВИД спектрофотометрThermo ScientificNanoDrop 1000Или эквивалентные. Использование на шаге 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
Высокоскоростная центрифугаThermo ScientificHeraeus Multifuge X3Rили аналогичное оборудование, способное достигать 13 000  ×   g
Высокоскоростной роторThermo ScientificFiberlite F15-6 x 100y
Адаптеры для пробирок 15 мл Настольная
центрифуга охлаждаемаяEppendorf5430 RИли аналогичная.
ТермомиксерEppendorfThermomixer CИли аналог.
Магнитный стендMiltenyi Biotec130-042-109Один стенд вмещает 8 & микро; Колонки Macs.
Ультратонкий налетMettler ToledoML204Tили аналог.
E-Gel iBase PowerSystem InvitrogenG6400UKдля РНК-гелей; или эквивалент.
E-Gel EX 1% агарозные сборные гелиInvitrogenG4020-01Для РНК-гелей; или эквивалент.
DynaMag-2 Magnet-1 каждыйLife Technologies12321D
RNaseZapSigmaR2020Опционально
TruSeq набор для подготовки многотысячной общей библиотеки РНКIlluminaRS-122-2201Или эквивалент. Для Т-клеток мы использовали 400 нг 4sU и общую РНК с 11 циклами для амплификации ПЦР. Истощение рРНК включено в этот набор
NanodropThermo Scientificиспользует Nanodrop или эквивалентный прибор для измерения концентрации РНК
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (млекопитающие или дрожжи)IlluminaRPYSC12116 (дрожжи)
TruSeq Ribo Profile kit (млекопитающие или дрожжи)IlluminaRPHMR12126 (Млекопитающие)
Illustra MicroSpin S-400 HR колонкиGE Healthcare27-5140-01
РНК Clean & Концентратор-25 наборZymo ResearchR1017
RNA Clean & Набор концентратора-5Zymo ResearchR1015
Набор для удаления рРНК Ribo-Zero Gold (человек/мышь/крыса)IlluminaMRZG126 или MRZG12324
(набор для высокочувствительной ДНК)Agilent Technologies5067-4626Уже нужен для 4sU-seq
Все остальные расходные материалы и оборудование перечислены в руководстве пользователя!!Внимательно ознакомьтесь с инструкцией пользователя и заранее закажите необходимые расходные материалы (учитывайте длительное время доставки некоторых расходных материалов, например, гелей)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)гереральный лабораторный поставщик
100 bp Plus MarkerThermo FisherSM0323
16 % ФормальдегидThermo Fisher28908Добавьте к конечной концентрации 1%
70% EtOHгереральный лабораторный поставщикВсегда готовьте свежий
агарозныйгереральный лабораторный поставщик
Agencourt RNAClean XP бусиныBeckman CoulterA63987Мы рекомендуем использовать эти парамагнитные бусины. Аликвот и хранить при 4° C
Набор для подготовки библиотеки ChIPKapaBiosystemsKK8504Или используйте набор по вашему выбору
Микроцентрифужные пробирки для ДНК с низким связываниемEppendorfZ666548-250EAили аналог
Dynabeads Protein GInvitrogen10004DИспользуйте эти суперпарамагнитные шарики, соединенные с белком G на шаге 4.3.1.; Доведите до РТ перед использованием
Поставщик герерала ГлицинПриготовьтестоковый раствор 2М
ГликогенРош10-901-393-001
Набор для очистки ПЦР MinEluteQiagen28004Используйте этот набор (или эквивалент) для очистки хроматина на шаге 4.2.4.
Ингибитор фосфатазы (PhosStop)Roche4906837001Добавить свежим в буфер и держать на льду
Power SYBRgreen Master mixThermo Fisher4367659
Ингибитор протеазы (cOmplete, без ЭДТА)Roche11873580001Добавить свежий в буфер и держать на льду
Proteinase KInvitrogen25530049
Qubit dsDNA HS Набор для анализаInvitrogenQ32851Используйте этот набор для количественного определения количества ДНК на шаге 4.6.4. на кубитном флуориметре
Rnase, ДНКазе freeRoche11-119915001
Сперма лосося (обработанная ультразвуком примерно до 100.н.)SigmaD1626
TE pH 8.0гереральный лабораторный поставщик
<сильные>антитела (класс ChIP, если это возможно)
anti-RNA Pol II [8WG16]abcamab817
anti-Histon H3K36me3abcamab9050
или антитело представляющего интерес
Buffers
Binding/Blocking Bufferхранить в RTPBS с 0,5 % BSA и 0,5 % Tween 20
Cell-Lysis bufferХранить втрубах RT 5 мМ [pH 8,0], 85 мМ KCl и 0,5 % NP40
ChIP буферХранить приRT 0,01 % SDS; 1. 1% Тритон Х-100; 1.2  mM EDTA; 16.7  mM Tris-HCl, pH 8,1; 16.7  mM NaCl
Elution bufferХранить при RT до 6 месяцев10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA (pH 8,0), 300 mM NaCl и 0,5 % SDS
Nuclei-Lysis Bufferхранить при RT50 mM Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA, и 1 % SDS
Wash buffer Iхранить при RT0,1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8,1; 150 mM NaCl
Wash buffer IIхранить при RT0,1 % SDS; 1 % Тритон Х-100; 2  mM EDTA; 20  mM Tris-HCL pH 8,1; 500  mM NaCl
Wash buffer IIIХранить при RT0,25  M LiCl; 1% НП-40; 1  mM EDTA; 10  mM Tris-HCl, pH 8,1<
strong>Equipment
2100 Биоанализаторинструмент AgilentG2939BAиспользовать этот прибор для электрофоретического анализа
NanodropThermo Scientific
Bioruptor TBX микропробирки 1,5 млДиагенодC30010010
или пробирки специально для вашего ультразвукового устройства
Ультразвуковое устройство Bioruptor или ультразвуковое устройство по вашему выборуУльтразвуковое устройство Т-клеток с Bioruptor: 20 - 25 циклов (30 с вкл., 30 с выкл. на высоком уровне в двух микропробирках биоруптора объемом 1,5 мл с 500 & микро; Магнитная
подставка для пробирок
Термомиксер
Агарозный
Кубит ФлуориметрThermo ScientificИспользуйте этот флуориметр для количественного определения малых количеств РНК/ДНК
:гель Электрофорез

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126(2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533(2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

4sUChIP

Похожие статьи