Методическая статья

Простой и недорогой Assay для измерения передвигаться в моделях мыши мышечной дистрофии

DOI:

10.3791/56772

⸱

29 декабря 2017 г.

 , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, 2Center for Duchenne Muscular Dystrophy, University of California, 3Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, 4Molecular Biology Institute, University of California

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает гибкий, лоу кост системы для измерения мыши передвигаться в открытом поле деятельности assay. Мы показывают, что 6-минутный передвигаться пробирного, основанными на этой системе обнаруживает снижение добровольного движения в многомерных выражений мышей и точно отличает улучшение мышц конкретных спасения этих животных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерения функциональных результатов в лечении мышечной дистрофии является важным аспектом доклинических испытаний. Assay неинвазивные и воспроизводимости результатов деятельности, который непосредственно аналогичных мер пациента передвигаться как тест 6-ти минутах ходьбы и связанных мобильности оценки является оценка добровольного передвигаться в моделях мыши. Многие общие методы для тестирования скорости мыши передвигаться и расстояние основаны на открытом поле тест, где свободное передвижение животных в арену измеряется временем. Один из основных недостатков этого подхода является что коммерческого программного обеспечения и оборудования для отслеживания движения с высоким разрешением дорого и может потребовать передачи мышей для специализированных объектов для тестирования. Здесь мы описываем лоу кост, основанные на видео системы для измерения передвигаться мышью, которая использует свободное и открытое программное обеспечение. Используя этот протокол, мы показываем что добровольные передвигаться в мышиной модели делеций null mdx для мышечной дистрофии Дюшенна (ДМД) снизился относительно деятельности одичал тип мыши. В многомерных выражениях мышей, выражая utrophin трансген, эти дефициты активности не наблюдалось и общее пройденное неотличима от мышей дикого типа. Этот метод является эффективным для измерения изменений в добровольных передвигаться, связанные с дистрофическими патологии и предоставляет универсальная платформа, которая может быть легко адаптирована для настройки различных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Надежных и воспроизводимых измерений функции мышц имеют решающее значение для оценки эффективности потенциальных терапий для ДМД. DMD является генетическим расстройством, вызванных мутациями в гене делеций приводит к прогрессивная мышечная слабость, потеря передвигаться, и возможного кардиореспираторной недостаточности. Наиболее широко используемых животных модель DMD является мышь делеций null многомерных выражений . Функциональных тестов появились как рутинных анализов для оценки прогрессирования заболевания в многомерных выражений мышью, а также аналогичных животных моделей другие дистрофий и миопатии. Часто используемые в vivo анализы включают измерения прочности сжатия передних конечностей, проволока, висит время, максимум rotarod, время до исчерпания во время беговой дорожки идущий и двигательной активности отслеживания. Там был значительные усилия в области стандартизации этих испытаний, с целью снижения изменчивости между доклинические исследования и увеличения трансляционная потенциал терапии, испытания на мышах1,2.

Одной из важных категорий доклинических испытаний является измерение добровольного движения, параметр, который часто изменяется в мышиных моделях мышечной дистрофии. Это обычно тестируется анализов, основанный на открытом поле мониторинг активности и может оценить горизонтальное (пешком) или вертикальными движениями (выращивание) течение минут или часов2,3,4. Ряд исследований показали добровольного движения должна быть изменена в многомерных выражений мышей, особенно после тренировки, и эти измерения показали быть чувствительным к наркотиков лечения и болезнь прогрессии. Одним из основных ограничений в выполнении этих анализов является потребность в специализированных, высокой стоимости оборудования. Здесь представлен метод лоу кост, который отслеживает мыши передвигаться с помощью легко доступных ресурсов.

6-ти минутах ходьбы находится метрика, широко используется в клинической оценки в качестве инструмента лиц с мышечной дистрофии Дюшенна5,6. Модификации этой меры были использованы для оценки результатов в животных моделях Дюшенна, включая mdx мышей7 и мышечная дистрофия (GRMD) Золотой ретривер собаки8. В этом исследовании мы фиксируем движения добровольных открытом поле в 6 минут, сразу же после вызов легкие упражнения. Расстояние передвигаться тогда была рассчитана с использованием бесплатно с открытым исходным кодом для измерения горизонтального движения с течением времени.

Основным преимуществом этого метода является, что животных можно протестированы в различных параметров без необходимости специализированного оборудования или высокой стоимости коммерческого программного обеспечения для анализа. Одним из важных аспектов этого анализа является, что она может быть выполнена в основных лабораторных условиях без необходимости перемещения или передачи мышей из виварий специализированного основного объекта. Протокол видео слежения, описанный здесь хорошо подходит для оценки передвигаться за относительно короткий период времени и может обнаруживать активность различия между мышей дикого типа и многомерных выражений , а также раскрыть функциональные улучшения в спасательной модель DMD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные здесь методы были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в Калифорнийском университете, Лос-Анджелес. Одичал тип (C57BL/6J) и многомерных выражений мышей (C57Bl/10ScSn фон) были приобретены у коммерческого источника. MDX: utrophin-Tg мышей были подарок от Джеймса Ervasti, с разрешения от Kay Дэвис и были сохранены на фоне многомерных выражений . Передвигаться анализы проводились на самцов мышей в возрасте 6 месяцев. Мышей были сохранены в виварий Terasaki наук о жизни, следуя руководящим принципам институциональный уход животных и использование Комитета в Калифорнийском университете, Лос-Анджелес (утверждение #2000-029-43) и утверждения для этих исследований был предоставлен UCLA животного благосостояния гарантий (утверждение #A3196-01).

1. Подготовка камеры

  1. Выполните сбор данных в комнату отдыха, контролем температуры во время последовательного день9. Выполните тесты, ослепленный генотип и лечения мыши проходит проверку.
  2. Адаптировать любой системы камеры открытом поле для этого анализа.
    Примечание: В этом исследовании, мы используем недорогой и легко транспортируется запись камеры построены с большой мусорное ведро. Открытое поле Арена является набор на клетке или аналогичных повышенных платформа лоток.
  3. Поместите фотокамеру на проволочную сетку выше камеры для записи через полное Арена.
  4. Очистите записи камеры с дезинфицирующим средством до каждого разбирательства.

2. Предварительный протокол и осуществлять сбор данных

  1. При необходимости непосредственно перед активность записи, вызов каждой мыши с протоколом активации мышц.
    Примечание: Это необязательно, но рекомендуется в экспериментах с участием mdx мышей.
    1. Разрешить мыши для захвата вытащить бар датчика цифровой силы и осторожно потяните назад до тех пор, пока панели потяните освобождается. Повторите эту процедуру пять раз в суде.
    2. Напряжение (N) записи пик для каждого разбирательства.
      Примечание: в дополнение к действующей как вызов упражнения для assay передвигаться, сила животного во время этот assay прочность сцепления может использоваться как дополнительный функциональный результат измерения2,10.
    3. Выполните пять всего испытаний для каждой мыши с 1 мин отдыха между каждого разбирательства.
  2. Сразу же после пробирного прочность сцепления или другие упражнения протокол, поместите курсор мыши в деятельности Палаты.
  3. Начните запись видео движения мыши на арене камеры. Позволяет мыши, чтобы свободно исследовать за 6 мин.
  4. Остановить запись в 6 мин и вернуть его домой клетку мыши.

3. видео анализ

  1. При необходимости подготовка видео для анализа путем уменьшения частоты кадров. Чтобы уменьшить частоту кадров для отслеживания анализа, используйте следующий протокол в видео редактирования программного обеспечения (например, iMovie или аналогичной программе) уничтожить частота кадров видео с коэффициентом 2.
    Примечание: В зависимости от длины и частоту кадров видео, он может быть полезен для снижения частоты кадров видео до анализа. В этом исследовании видео было записано на 30 кадров/с (6 мин записи, приблизительно 10 800 кадров всего).
    1. Загрузите видео в программное обеспечение.
    2. В меню «Скорость», выберите ' скорость: Fast' и установите скорость 2 x.
    3. Экспортируйте уничтожена видео в формате .mp4 для отслеживания анализа.
  2. Откройте видео для анализа в программе. Установите калибровки для записи с помощью инструмента линия видео. Нарисуйте линию вдоль одной стороны камеры. Щелкните правой кнопкой мыши на линии и выберите пункт «Калибровать мера...» Введите фактический размер стороны камеры в сантиметрах.
  3. Чтобы начать полу Автоматизированное отслеживание позиции мыши, нажмите на «переместить» курсор.
    Начиная с первоначального кадра в видео, щелкните правой кнопкой мыши на точке отслеживания; точка отслеживания помечена с синий круг.
    Примечание: В настоящем исследовании, позиция каждого животного было считано путем отслеживания основание хвоста.
  4. Заранее кадр, нажав кнопку со стрелкой вправо на клавиатуре; точка отслеживания должна автоматически смещаться на позиции основанию хвоста.
    1. Если позиция отслеживания не выравнивается с точки интереса в данном кадре, вручную выровняйте синий круг к основанию хвоста.
      Примечание: В зависимости от качества видео и скорость мыши, отслеживания может потребоваться различные уровни пользовательского ввода для поддержания выравнивание с точки интереса. Путь мыши следует заранее через курс видео.
  5. При завершении отслеживания полное видео, сохраните видео и трассировки оверлея. Экспорт в позиционных данных трассировки, выбрав «Экспорт в электронную таблицу».

4. анализ данных

  1. Откройте позиционные данные в программу электронных таблиц. Программное обеспечение для анализа движения сообщает, что X, Y координировать позиции указателя мыши в каждом кадре.
  2. Чтобы вычислить расстояние, пройденное кадра, используйте следующее уравнение (где это положение в кадре, один x1, y1 и два кадра является x2, y2):
    figure-protocol-1
    Примечание: Совокупное расстояние со временем можно рассчитать путем добавления расстояния между каждого кадра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вариации в открытом поле анализа было показано, быть эффективным методом для тестирования прогрессирования заболевания в моделях мышечной дистрофии. Здесь мы демонстрируем универсальный видео отслеживания метод для анализа движения двумерных мыши, с помощью легко доступных записывающее оборудование и открытым исходным кодом программного обеспечения (рис. 1A–B). В соответствии с результатами сообщили от подобных анализов, мы п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay открытое поле обеспечивает эффективную и неинвазивный способ проверить моторную функцию в моделях мыши заболевания мышц, и вариации этот assay может служить ценным конечной меры для доклинических исследований. Одним из основных ограничений с этим типом пробирного является высокой стоимостью и ограниченным доступность деятельности систем мониторинга. В этом исследовании мы демонстрируем лоу кост системы для анализа деятельности открытого поля, которые могут генерировать результаты, аналогичные существующим коммерчес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья [R01 AR048179 и R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033 и F32 AR069469to E.M.G] и мышечной дистрофии ассоциации США [274143 и 416364 к R.C.W.].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ВидеокамераApple Inc.ME553LL/AДля записи видео о передвижении, iPhone 5S Plus (или аналог)
Программное обеспечение Kinovea (версия 0.8.15)Программное обеспечение Kinovea Associationс открытым исходным кодом. Скачать бесплатно, совместимо с ПК (версии 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (версия 10.0.6)Apple Inc.Любое подобное программное обеспечение может быть использовано для снижения частоты кадров видео (опционально)
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bun (Открытая полевая камера)Rubbermaid# 1778013Любая система открытых полевых камер может быть адаптирована для записи. В этом исследовании используется записывающая камера, сконструированная из лотка на платформе, на дне большого мусорного бака.
Avant White Пластиковый лоток 15 дюймов Ш x 10 дюймов Г x 1,45 дюйма В (Открытая полевая камера)US Acrylic, LLCЛюбая система открытых полевых камер может быть адаптирована для записи. В этом исследовании используется записывающая камера, сконструированная из лотка на платформе, на дне большого мусорного бака.
C57BL/6JJackson Laboratory#000664Самец 6-месячных мышей
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)Jackson Laboratory#001801Самец 6-месячных мышей
mdx: утрофин-Tg (fiona)Подарок от Джеймса Эрвасти, с разрешения Кей ДэвисСамец 6-месячных мышей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
  2. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  3. Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
  4. Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
  5. McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
  6. Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
  7. Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
  8. Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
  9. Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
  10. Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
  11. Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
  12. Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
  13. Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
  14. Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mdx

Похожие статьи