Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

Summary

Этот протокол описывает воспроизводимость и надежный метод для подготовки на основе сублимации формалин фиксированной ткани, предназначенные для визуализации масс-спектрометрии.

Abstract

Использование матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации, масс-спектрометрия MALDI imaging (MALDI MSI) быстро расширяется, так как этот метод анализирует множество биомолекулы от наркотиков и липиды для N-гликанов. Хотя существуют различные методы подготовки образца, обнаружения пептиды с формальдегидом сохранить ткани остается одним из самых трудных задач для этого типа масс-спектрометрических анализа. По этой причине мы создали и оптимизированы надежной методологии, которая сохраняет пространственной информации, содержащихся в образце, заручаясь наибольшее количество ionizable пептидов. Также мы стремились добиться этого в экономически эффективным и простым способом, устраняя тем самым потенциальной предвзятости или подготовка ошибка, которая может произойти, когда с помощью автоматизированных инструментария. Конечным результатом является протокол воспроизводимость и недорогой.

Introduction

При содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрии изображений (MALDI MSI) был нанят в качестве изображения на основе методики для двух десятилетий^1,2, анализируя спектр включая биомолекулы: липиды³, пептиды^{2 ,4}, белки^2,5, метаболитов^6,7, N-гликанов⁸и синтетические молекулы, такие как лечебных препаратов^9,10. Количество публикаций, демонстрируя полезность этого метода значительно выросли за последние десятилетия^6,11,12,13. Некоторые молекулы, такие как липиды, являются относительно легко проанализировать через MALDI MSI, как они ионизируют легко из-за их химической природы и таким образом требуют мало предварительной подготовки³. Однако для более сложных целей, как пептиды, шаги, необходимые для эффективного ионизировать эти молекулы являются обширные и вообще сложно¹⁴. В настоящее время существует очень мало публикаций, которые направлены на адрес или продемонстрировать повторяемость в методологиях, которые используются для подготовки ткани Этот уникальный визуальный метод¹⁵. По этой причине, мы собрали наблюдений и реализовано оптимизаций в единый, легко осуществить, методологии, которые следует требуют практически нет изменений, для анализа пептидов из формальдегида сшитого ткани источника¹⁴.

В этой рукописи мы описали проверенных, низкая стоимость, воспроизводимые методологии для обнаружения и пространственного картографирования пептиды, полученные формалин Исправлена замороженные (FFF) и формалин Исправлена парафин врезанных разделов ткани (FFPE). Эта методология не требует и не полагаться на любой специализированный инструментарий³. В частности мы решить многие аспекты специализированных пробоподготовки, необходимых для анализа пептидов; такие шаги, как антиген извлечения¹⁶ и покрытие матрицы. Наш протокол также использует недорогое оборудование и реагенты, тем самым делая доступными для более широкого сообщества, которые в противном случае будет не в состоянии позволить себе альтернативного роботизированной аппарат¹⁷этой методологии.

Обоснование разработки метода подготовки ручной выборки был два раза: во-первых, использование sublimator создает последовательного и однородное покрытие матрицы кристаллов, которые являются ~ 1 мкм в длину¹⁸, что-то недостижимое с более распространенными распыления методы. Во-вторых относительно небольшой набор расходы: Общая стоимость аппарата настраиваемые был <$ 1500 AUD. Мы отмечаем, что с точки зрения эффективности затрат, Цена за образец гораздо дешевле, когда есть без роботов техники. Использование сублимации уже сообщалось ранее, однако, в меру наших знаний, шаг за шагом методологий, которые описывают этот процесс и пробоподготовки, не сообщили ни не описаны в литературе.

Этот протокол предназначен для оказания помощи исследователям, имеют доступ к Малди масс-спектрометром и которые намерены генерации пространственной информации применительно к био молекула интерес¹⁹. По сути MALDI MSI является формой гистологическое обследование, не полагаться на антитела или пятна².

Protocol

Предупреждение: Все применимые меры предосторожности следует использовать при выполнении этой процедуры, в том числе с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ) (например, лаборатории пальто, нитриловые перчатки, защитные очки, и т.д.)

1. Подготовка реагенты и оборудование

1. Подготовка решений
   1. Подготовить 500 мл жидкости в Карнуа, смешать 100% этанола (EtOH), хлороформе и уксусной кислоты кристаллизированной в 6: v/v/v соотношении 3:1 в чистой стеклянной бутылке Schott.
   2. Чтобы сделать жидких нитроцеллюлозы (NC), Растворите NC мембраны (часто используется в Западный blotting) в аккуратные ацетон, путем нежный агитации, до конечной концентрации 40 мг/мл.
2. Подготовка слайдов NC покрытием
   1. Используйте методику, аналогичную той, которая используется для подготовки крови мазки на гистологическом²⁰ подготовить NC покрытием слайды.
   2. Пипетка 40 мкл жидкое НК на один край проводящих Индий оксид олова (ITO) микроскопа. Используя обычные стекла микроскопа, NC под поверхностное натяжение перетащите слайд для создания даже тонкой пленки покрытия.
   3. Разрешить NC высохнуть при комнатной температуре 20 s и затем хранить до тех пор, пока требуется при комнатной температуре. Хранения образцов в этих условиях может быть бессрочным тканях поддерживаются и свободной от пыли.
      Примечание: Этот метод подготовки более известный как «тонкий фильм» и даст равномерное покрытие, которое опирается на вязкость НК, а также ее отсутствие поверхностного натяжения для самостоятельной уровня на слайде. Только уход, который следует использовать при подготовке слайды не двигаться слишком быстро, который создаст полосы NC, а не полный охват.
      Предупреждение: Как жидкое НК очень быстро сохнет, важно работать быстро, чтобы избежать высыхания решение, прежде чем он был должным образом распространился. Следует также позаботиться при обработке NC в жидком состоянии, как он представляет собой весьма энергичный соединение и не должен связаться с источником зажигания для предотвращения взрыва зажигательной. NC также подвергается эндотермических переходы при сушке и может вызвать ожоги холодной, если разрешено приехать в длительный контакт с кожей или перчатках. Чтобы свести к минимуму все риски, только небольшие суммы должен быть подготовлен на каждом (< 1 мл рекомендуется). После высыхания при комнатной температуре. Однако NC может оставаться взрывоопасной, когда присутствует в больших количествах.
3. Создание пользовательских пара камер
   1. Вырежьте кусок толстой промокательной бумаги с ножницами, достаточно большой, чтобы поместиться в нижней половине стандартные пластиковые Петри (94 мм диаметром и толщиной 3 мм).
   2. Разрежьте бумагу, оставляя прямоугольной полосой в центре, такого же размера как микроскопа, оставляя достаточно избыток, так что бумага будет сохранять свою позицию в Петри (дополнительный рис. 1).

2. Подготовка разделов ткани

1. FFPE ткани²¹.
   1. Выберите желаемый ткани блока и раздел на 12 мкм толщина в стандартной скамейке навесные микротома и плавать горе на NC предварительно покрытая ITO слайды.
   2. Опускайте слайды в свежих ксилол для удаления остатков парафина на 2 мин и повторите операцию во второй раз.
      Примечание: Если парафин блок особенно широко распространенной или ткани является относительно небольшим по сравнению с блоком парафина, образцы можно подогревать при 60 ° C таять большинство прочь перед стиркой в ксилоле.
   3. Мыть deparaffinized образцы, погрузив слайды в градуированных растворителей серии: 70% v/v EtOH/вода, 100% EtOH, Карнуа жидкости, 100% EtOH, ультра-чистой воды и 100% EtOH. Продолжительность каждого погружения должно быть 30 s, за исключением Карнуа в жидкость, которая должна длиться 2 мин.
      Предупреждение: Карнуа жидкости и ксилол должны храниться и использоваться в вытяжного шкафа, как они высоко токсичен при вдыхании.
2. Формалин Исправлена замороженные (FFF) ткани
   Примечание: Образцы должны уже быть заморожены, надлежащим образом в зависимости от типа образца.
   1. Сбалансировать блока ткани при рабочей температуре микротом для 20 минут²².
      Примечание: Уравновешивания температура зависит от типа ткани.
   2. В разделе ткани, используя микротом на 12 мкм и оттепели Маунт секции на заранее подготовленные NC покрытием Ито слайд.
   3. Храните слайды в вакуумный сушильный шкаф на скамейке в темноте.
      Примечание: Образцы можно хранить в течение нескольких недель в этих условиях.
   4. Стирать образцы в градуированных растворителей серии, как указано на FFPE ткани (2.1.3).
      Примечание: Нет необходимости для шага deparaffinisation ксилол как образец не внедрены.

3. метиленовой Crosslink гидролиз

1. Загрузите образец слайдов (FFF или FFPE) в поле пластиковых слайд, который наполнен 20 ммоль трис HCl (рН 8,8) к вершине. Уплотнение коробки и поместите его в водяной бане, содержащий 500 мл воды, позволяя поле коснуться дна. Затем тепло его 15 мин при температуре 120 ° C в скороварке, которого можно достичь рабочее давление 70 кПа.
2. Удалите слайды, дать им остыть и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение 15 мин.

4. ткань пищеварение

1. После гидролизованный, пальто образцы с 10 мкл раствора (1 мг/мл) трипсина в ультра-чистой воды, путем дозирования 10 мкл раствора на кромку ткани, затем, используя тот же Совет пипетки, перетащить дроплет по всей поверхности ткани под поверхностью напряжение.
   Примечание: Не поцарапать поверхность ткани с кончиком пипетки и за распространение фермента за пределами края ткани.
2. Разрешить образцы высохнуть при комнатной температуре.
3. После высыхания, смонтируйте образцов внутри верхней палаты ранее созданный паров (ткани вниз) с лентой автоклава на либо краю слайда (дополнительный рисунок 2).
4. Пипетка 600 мкл раствора, содержащего смесь 1:1 v/v 100% ацетонитриле и 50 мм бикарбонат аммония осторожно прижмите палец промокательной бумаги в нижней части Петри, до тех пор, пока палец, как представляется, быть равномерно влажным.
5. Место в верхней половине камеры пара на нижней половины, обеспечение бумага палец и образец слайдов выровнять совершенно и уплотнение камеры вокруг экватора с парафином фильм.
6. Оставьте на ночь образца в инкубаторе 37 ° C разрешить полный пищеварение.

5. Матрица покрытие через сублимации

1. После переваривается, взвесьте образец слайда на microanalytical баланс 5-значный.
2. Маунт слайд на охлаждения палец сублимации аппарата и закрепите его с медной лентой, таким же образом, как описано для камеры пара (дополнительный рис. 3).
   Примечание: Чтобы гарантировать, что слайд связывается равномерно охлаждения палец, слой медной лентой помещается в нижней части охлаждения палец до уровня поверхности. Это гарантирует, что слайд равномерно охлаждается, что приводит к даже осаждения матрицы.
3. Место 300 мг матрицы α-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) в чашку Петри стекла в нижней части камеры и распространение равномерно, чтобы создать тонкий слой кристаллов матрицы.
4. Соберите sublimator и зафиксируйте две половинки с зажимом подкова. Приостановите собран блок 15-20 см над песочной ванны, разогретую на 220 ° C, поместив его в металлическом кольце подключен к стенд реторты.
5. Подключите камеру к источнику вакуума, включите вакуум и позволило стабилизировать до ~ 25 mTorr за 5 мин.
6. Пакет охлаждения палец на вершину со льдом и добавить 50 мл воды. Разрешить аппарат урегулировать еще 5 минут, прежде чем продолжить.
7. Нижняя палата на поверхность песка, гарантируя песок полностью контакты в нижней части камеры и оставить его на 45 минут, чтобы создать идеальное покрытие 0,22 мг/см²
   : Уход следует проявлять осторожность при обработке стекла в высоком вакууме, как любые повреждения аппарата, хотя эвакуированы, может привести к катастрофический провал стекло камеры.
8. После 45 минут удалите камеры из песочной ванны путем повышения металлическое кольцо и вентиляционные камеры.
   Примечание: После того, как палата была вентилируемые, слайд должны быть удалены очень быстро, как воды в воздухе начнет конденсироваться на замораживание палец и образец слайдов.
9. Удалить слайд и взвесить его, чтобы убедиться, что был достигнут желаемого покрытия.
   Примечание: Если был достигнут недостаточно покрытие, просто повторите процесс сублимации для слайда до тех пор, пока был достигнут желаемого покрытия толщиной.

6. рекристаллизации

1. После Сублимированные, смонтировать образец слайда внутри верхней палаты ранее созданный паров, как описано ранее (ткани вниз).
2. Пипетка 600 мкл раствора, содержащего смесь 1:1 (v/v) 100% ацетонитриле и 0,1% v/v trifluoroacetic кислоты в воде тщательно на промокательную бумагу в нижней части Петри обеспечить ровное покрытие.
3. Соберите палата, обеспечение бумага вкладка и Микроскоп слайд отлично выровнять и оставить в инкубатора 37 ° C за 1 ч.
   Предупреждение: Не запечатывайте камеры.
   Примечание: После порошкообразные, обычно желтый оттенок матрицы следует изменить на белый, выглядят менее блестящими и появляются очень даже. Это означает, что перекристаллизации была выполнена правильно.
4. Образец теперь готов для анализа.

7. приборостроение

1. Сканирование слайдов в планшетный сканер для создания цифровых изображений.
2. Загрузить образец в масс-спектрометр, а затем проанализировать с помощью соответствующего программного обеспечения платформы.
3. Анализ образцов в режиме reflectron положительный ион с массовых спектр 750-3500-Да, с разрешением пятно, которое применимо к желаемому результату. В большинстве случаев 20-50 мкм растровое ширины достаточно, однако, как мало, как 10 мкм могут быть используется¹⁵.
   Предупреждение: MALDI УФ лазеров являются источником ионизирующего излучения и не должны рассматриваться непосредственно. Убедитесь, что лазер содержится в инструмент экранирования до операции.

Results

Если после правильно, этот протокол производит изображения, которые явно представляют собой грубые морфология ткани без каких-либо царапин или других деформаций (рис. 1). Идеальный проверки для правильно выполненных пробоподготовку, является способность различать различные физические структуры, изменив молекулы, Просмотрели (рис. 2).

Хорошее руководство для определения ...

Discussion

Этот протокол был разработан для получения максимального дохода ionizable молекулярных видов устраняя делокализация аналитов. Ключевые факторы связаны с использованием же основополагающий принцип при применении матрицы, переваривание образца, или recrystallizing после сублимации²⁴; а именно, что даже осаждения паров, матрица или в противном случае, должен быть создан и поддерживается. Дозирование растворителей смывки для перекристаллизации и пищеварение, равномерно под образца, предотвращает любые...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Криомикротом	Leica	CM3050	Для препарирования и среза тканей.
Микроскоп оксида индия и олова предметные стекла	Bruker	8237001	Для подготовки и среза ткани.
Баночки для коплина	Sigma Aldrich	S5516	Для подготовки и среза тканей.
Скороварка	Kambrook	KPR620BSS	Для подготовки и среза ткани.
Сублиматор	Chem Glass	NA	Для процедуры сублимации. Похож по дизайну на CG-3038, однако был изготовлен на заказ.
Песочная ванна	NA	NA	Для процедуры сублимации. Мелкосортный речной песок выдерживается в фальцевой алюминиевой фольге, полученной извне, а не от какой-либо конкретной компании
Glass Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS70165100	Для процедуры сублимации.
Вакуумный насос	NA	NA Для	процедуры сублимации. Поставляется в качестве запасной части от старого масс-спектрометра
Холодная ловушка	Chem Glass	CG-4510-02	Для процедуры сублимации.
Конфорка	John Morris	EW-15956-32.	Для проведения процедуры сублимации.
Пластиковая чашка Петри	Sigma Aldrich	Z717223	Для процедуры сублимации.
37 ° C инкубатор	NA		NA Для проведения процедуры сублимации. Не применимо, инкубатор не стерилен и старше 30 лет;
Промокательная бумага	Sigma Aldrich	P7796	Для процедуры сублимации.
Нитроцеллюлоза	Sigma Aldrich	N8395	Для мойки слайдов.
Ацетон	Sigma Aldrich	650501	Для мытья горок.
Xylene	Sigma Aldrich	214736	Для мытья горок.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Для мытья стекол.
70% EtOH	Sigma Aldrich NA		Для мытья стекол. Сделано в лаборатории из 95% стокового этанола
Хлороформ	Sigma Aldrich	C2432	Для мытья горок.
Ледяная уксусная кислота	Sigma Aldrich	ARK2183	Для промывки горок.
Tris HCL pH 8,8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Для протеолитического расщепления. Порошок изготовлен до 1М с последующим уравновешиванием с 32% HCl до PH 8,8
Milli Q Ultra-Pure Water	Sigma Aldrich	NA	Для протеолитического расщепления. Очистка выполняется в домашних условиях с помощью сарториальной системы очистки воды
Ammonium Bircarbonate	Sigma Aldrich	A6141	Для протеолитического расщепления.
Трипсин	Сигма Олдрич	T0303	Для протеолитического расщепления.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Для рекристаллизации.
Ацетонитрил	Sigma Aldrich	1.00029	Для рекристаллизации.
Трифторуксусная кислота (ТФК)	Sigma Aldrich	302031	Для рекристаллизации.