Методическая статья

Кинетическая на основе флуоресценции Ca2 + мобилизации Assay для определения G белка в сочетании рецепторов агонистов, антагонисты и аллостерический модуляторы

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56780

⸱

20 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

В этой статье

Краткое содержание

Описанные сотовой assay предназначен для идентификации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4)-взаимодействующих агентов, которые подавляют или стимулировать, либо конкурсной или allosterically, внутриклеточный Ca2 + релиз, инициированных CXCR4 активации.

Аннотация

G белок рецепторы (GPCR) имеют большое значение для фармацевтической промышленности, как они участвуют в многих болезней человека и включают в себя хорошо проверенных цели для терапевтической интервенции. Открытие соединений свинца, включая малые синтетические молекулы, которые специально препятствуют функции рецепторов, является важным первым шагом в разработке лекарств и опирается на чувствительных, конкретные и надежный анализов на основе ячеек. Здесь, мы описать кинетические сотовой пробирного с флуоресцентные индикация, предназначена главным образом для выявления рецептор специфических антагонистов, которые тормозят внутриклеточных Ca2 + релиз вызывали после активации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) путем его эндогенного лиганда, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12). Основным преимуществом этого метода является, что он также позволяет скрининг соединений, наделенных агонистических свойств (например, соединения, вызывая увеличение внутриклеточной Ca2 + концентрации в отсутствие CXCL12) или соединений Модулирует функции рецепторов через взаимодействие с аллостерический привязки сайтов (то есть, положительные и отрицательные аллостерический модуляторы (ПАМС и NAMs, соответственно)). С другой стороны autofluorescent соединений может мешать пробирного индикация, препятствуя интерпретации надежных данных. Скорее этот assay может осуществляться, с минимальной адаптации, как открытие assay дженериков для многих других GPCR, из которых Активация приводит к выбросу внутриклеточных Ca2 +.

Введение

GPCR являются важным надсемейства клеток поверхности белков, которые активируют каскады трансдукции сигнала внеклеточных лигандов привязки. Они могут быть активированы широкий спектр стимулов, включая пептиды, белки гормоны, биогенные амины и липиды, что приводит к инициации различных внутриклеточных сигнальных путей и в конечном итоге биологических реакций1,2 . Кроме того GPCR участвуют во многих, если не все, развития и физиологических процессов и многих заболеваний человека связаны с неблагополучной GPCR сигнализации или рецептор гиперэкспрессия. GPCR, поэтому среди самых проверенных фармакологических целей в медицине1,3.

Как правило рабочий процесс обнаружения наркотиков ХВГФ начинается с сотовой скрининг анализов, способствующих выявлению соединений, таких как малые молекулы, моноклональных антител и пептиды, которые можно модулировать активность конкретного GPCR. В GPCR лекарств, что существует множество различных типов анализов для поиска таких соединений большинство из которых являются совместимыми с середины - для высокопроизводительного скрининга кампаний. Наиболее часто используемые анализы включают в себя эксперименты связывания рецептора, флуоресценции или свечения на основе обнаружения колебания уровня так называемых вторичных посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (AMP)), фенотипические анализы отбор проб и β-arrestin набора assays4. Выбор для конкретного типа assay может зависеть от нескольких факторов, но также определяется предварительного знания, касающиеся сигнальных свойства данного GPCR. Агонист, привязка к ХВГФ вызывает конформационные изменения, катализирующих обмена дифосфат (ВВП) гуанидина для гуанидина трифосфата (GTP) на α-субъединица гетеротримерные G белков. Впоследствии Gα-GTP Субблок дистанцируется от субъединицаβγ G, и оба подразделения будут инициировать дальнейшие сигнальных путей. Гидролиз GTP-молекулы и последующего повторного ассоциации Gα- ВВП и Gβγ подразделений будет восстановить G-белка в ее неактивной конформации5,6. Основываясь на последовательность сходства субъединицы Gα определены различные типы G белков (Gs, G,i, Gq, G12/13)7. Сигнализации через Gα Субблок дает подняться несколько типичных ответы, такие как увеличение (через Gs) или уменьшить (через G,я) ЦАМФ производства и внутриклеточных Ca2 + мобилизации (через Gq)5 ,7. Gβγ субблоков могут также заставить внутриклеточные эффекторные пути. Например, после активации G,я-спаренных GPCR, Gβγ может непосредственно стимулировать фосфолипазы С (PLC-β) производить инозитол трифосфата (IP-3), который вызывает выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов7 . После активации рецептора являются фосфорилированных GPCR, GPCR киназ (GRK), что способствует взаимодействию с β-arrestins. Этот процесс завершается G белка сигнализации и приводит к рецепторов десенсибилизации и в конечном итоге интернализации. Β-arrestins также возможность формирования различных молекулярных комплексов, которые могут вызвать другие сигнальные пути, независимо от сигнализации8G-белка.

В подсемейство хемокиновых рецепторов, Gя-спаренных CXCR4 является GPCR, вызвавший большой интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. Учитывая ее созданы роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вирусный вход и инфекции, соединений, ориентация CXCR4 были первоначально разработаны как анти-ВИЧ наркотиков кандидатов9. Совсем недавно растущее количество доказательств указал на важную роль для CXCR4 опухолей и рака метастаз, что делает его хорошо проверенных терапевтических цели в онкологии, а также в10. CXCR4 высоко выражается в более чем двадцати видов человеческих раковых и выживание клетки опухоли контроля, распространение и миграции, а также ангиогенез опухоли, относящиеся10. Антагонисты CXCR4 различных химических классов ранее были описаны11,,12, но только малые молекулы, которые AMD3100 в настоящее время одобрен для использования в клинике как агент мобилизации стволовых клеток, используемый во время лечения лимфомы и больных миеломой13,14. Клинические испытания проводятся для оценки безопасности и эффективности нескольких других антагонистов CXCR4 в различных заболеваний человека, но с особым упором на онкологии12. Учитывая многие потенциальные приложения CXCR4 антагонистов, поиск новых соединений с улучшенные фармакокинетические свойства, повышение биодоступности или потенциально меньше побочных эффектов является оправданным.

Здесь, кинетическая на основе флуоресценции сотовой пробирного главным образом используется для экрана для соединений, способных ингибирующих CXCR4 описан. Флуоресцентный измерение этого метода основано на преходящее повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + вызывали после активации CXCR4 к его эндогенного агонист, хемокиновых лигандом CXCL12 (ранее известный как стромальные клетки получены фактор 1α ( SDF1-α)) и потенциальные ингибирование этой CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ конкретных соединений. В этот assay клетки человека глиобластома U87, стабильно выражая человека рецептор CXCR4 используются. В то же время эти клетки отсутствие эндогенного выражение CXCR7, связанной с хемокиновых рецепторов, которая также связывает CXCL1215,16,17. CXCR7 ранее также доказано быть способны формировать гетеродимерами с CXCR4, тем самым модуляции сигналов свойства этой последней рецептор18. Колебания уровня внутриклеточного Ca2 + опосредовано CXCR4 контролируются путем загрузки CXCR4+ клеток с эфира fluo-2 acetoxymethyl (AM), клетки проницаемой высоким сродством флуоресцентные Ca2 +-привязка красителя. FLUO-2 утра является одной длины волны флуоресцентные молекула, которая может быть возбужден в 490 Нм, в то время как его флуоресценции выбросов измеряется в 520 Нм. Этот флуоресценции выбросов увеличивает Ca2 + привязки, с большим динамическим диапазоном между Ca2 +-связанные и свободные государства. Увеличение флуоресцентного сигнала преходящими, происходящих в течение интервала времени несколько минут и потом будет распадаться. Пик высота Флуоресцентные выбросов еще коррелирует с уровнем активации рецептора. Сам генотипирования с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции, оснащена камерой активизировались CCD (ICCD), которая обладает интегрированной системы дозирования, которая позволяет стандартизация дозирования шаги в assay (см. Таблицу материалы) . Кроме того одновременное измерение флуоресцентного сигнала на всех скважинах Гонав является еще одним ключевым преимуществом флуоресценции Reader, которая используется. Во время первой частью соединений под следствием (например, группа малых молекул в фиксированной концентрации или в серии разрежения) добавляются к fluo-2 утра assay загружен CXCR4+ U87 клетки следуют ~ 10 мин инкубационный период во время которой потенциальные агонистических эффект соединений непрерывно измеряется в режиме реального времени. Затем, эндогенного агонистов (т.е., CXCL12) добавляется к клетки вызывают CXCR4-опосредованной преходящее повышение уровня внутриклеточного Ca2 +. В ходе этой части assay может оцениваться потенциальной антагонистической активности проверенных соединений. Схематический обзор общего процесса анализа представлена на рисунке 1.

Хотя этот Ca2 + мобилизации assay главным образом были использованы для выявления и определения ингибирующее потенции конкурентоспособных CXCR4 антагонистов (например, соединения, препятствующие эндогенного агониста для привязки и стимулировать рецептор), он также можно определить агонистами рецепторов и, Кроме того, соединения, прилагать свои функции путем связывания на аллостерический участках (например, сайты, которые топографически отличается от привязки сайта orthosteric, оккупирована эндогенного агонист). К последней категории соединений примеры аллостерический агонисты и пам и NAMs19,20. Тогда как антагонисты рецепторов конкретных, а также NAMs будет препятствовать CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, СМУУ усилит этот ответ (см. также обсуждение раздела). Хотя assay описаного конкретно цели CXCR4, предполагается, что этот метод может применяться для других GPCR с минимальным оптимизации усилий, по крайней мере если они сигнала через освобождение внутриклеточных Ca2 +.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все шаги, описанные в разделах 1 и 2 проводятся в стерильных условиях в поток Ламинарный шкаф.

1. поддержание U87. CD4.hCXCR4 клетки

  1. Рост клеток в колбах T75 культуры при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
    Примечание: В пробирке клеток линии используется в этот протокол является линия клеток глиобластомы U87, стабильно выражая Кластер дифференцировки 4 (CD4) и человека CXCR4 и был ранее описанных17. Поверхности выражение клеток CD4 и CXCR4 непрерывно контролируется проточной цитометрии и уровни выражения остаются неизменными с течением времени (~ 100% CD4+ и ~ 100% CXCR4+ клеток). Подробное описание поколения используется клеточной линии и процедуры потока цитометрии расследовать рецептор выражение уровня не находится в пределах сферы применения данного протокола.
    1. Субкультура клетки на 80-85% confluency. Разрешить все реагенты до комнатной температуры (RT) до культивирования клеток.
    2. Удалите с кондиционерами питательной среды из клеток и мыть монослое клеток с 5 мл фосфатный буфер (PBS).
    3. Добавить 3 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и распределить его равномерно по монослое клеток. Затем удалите избыток трипсина ЭДТА и инкубировать до 5 мин при 37 ° C, до тех пор, пока клетки начинают отсоединить.
    4. Добавьте 10 мл свежего полный рост средних (Дульбекко орла изменения среднего (DMEM) + 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) + 0,01 М HEPES + соответствующий выбор агентов). Ресуспензируйте клетки, нежно закупорить вверх и вниз. Суспензию клеток передавать стерильные 50 мл трубки.
    5. Подсчитать количество жизнеспособных клеток с помощью метода выбора. В случае клеток глиобластомы U87, жизнеспособность обычно достигает ~ 100%.
      Примечание: Числа клеток может быть определено несколькими способами. Мы регулярно использовать систему анализа автоматизированные ячейки, основанные на Трипановый синий окрашивание (см. Таблицу материалы) согласно его стандартная обработка процедуры, но другие манеры должны работать одинаково хорошо.
    6. Добавить 2 x 10-6 или 3 х 106 клеток (жизнеспособные) окончательный объем 25 мл свежего роста средних в колбе T75 культуры и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
      Примечание: Если используются 3 х 106 клеток клетки достигнет confluency 80-90% после 2 дней. Если используются 2 x 106 клеток, они будут достигать же confluency после 3 дней. Темпы роста клеток должны сначала определяться эмпирически, если используются другие клеточные линии.

2. Заполнение ячеек для Ca2 + мобилизации Assay

  1. На дне клетки пассированый (день 0), пальто со стенами черный 96-луночных плит с четкими снизу (см. Таблицу материалы) с 0,1% раствор желатина для облегчения клеток вложение.
    Примечание: Покрытие 96-луночных пластин с желатином может опустить, если предварительно покрытых плитами, которые являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы), используются. Рекомендуется оценить использование предварительно покрытых пластин вместо ручной покрытие для каждой ячейки строки под следствием продолжения с протоколом.
    1. Готовят раствор желатина, добавив 1 г желатина до 100 мл PBS для получения 1% раствора. Развести в 10 x с PBS перед дальнейшим использованием. Для повышения растворимости желатина, тепло решение 37 ° C.
    2. 100 мкл раствора 0,1% желатина на хорошо 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов. Проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  2. В то же время готовить клетки для посева в 96-луночных пластины с покрытием.
    1. Отсоединить клетки от культуры колбу, Ресуспензируйте их в свежих роста среднего и считать их с помощью Трипановый синий окрашивания метода.
    2. Спин вниз клетки в 50 мл трубки 5 мин на 400 x g на RT.
    3. Ресуспензируйте клетки в свежих роста среднего (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, не антибиотики) для получения плотность клеток 0.1 x 106 (жизнеспособные) клеток/мл.
  3. Удалите раствор желатина из плит со стенами черный с четкой нижней, переворачивая пластину и сушки на ткани. Добавьте 200 мкл/хорошо PBS для удаления избыточного желатина и снова Переверните пластину.
  4. Отказаться от 200 мкл суспензии клеток (соответствующий 0,2 x 105 клеток) за хорошо в пластину 96-луночных желатин покрытием (теперь одна эта пластинка будет далее именоваться пластину «измерения»).
  5. Инкубируйте пластину на ночь при 37 ° C и 5% CO2.

3. Загрузка клеток с флуоресцентные Ca2 + -чувствительных краситель

  1. В день 1 выполняют фактическое Ca2 + мобилизации assay, начиная с загрузкой в сеяный клеток с флуоресцентные Ca2 +-связывание красителя fluo-2 AM.
    1. Подготовьте аналитический буфер путем добавления 40 мл HEPES (1 М) 200 мл Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS, 10 x, не фенола красного, не бикарбонат натрия). Добавление ультрачистая вода для получения окончательный объем 2 Л и добавить 4 g бычьим сывороточным альбумином (БСА). Растворите BSA через магнитные перемешивания. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 (с NaOH) и фильтр решение.
      Примечание: Во время все следующие шаги используется тот же буфер, именуемые «assay buffer».
    2. Подготовить раствор (4 мм диметилсульфоксида (ДМСО)) флуоресцентных Ca2 +-чувствительных красителя fluo-2 AM. Избегайте чрезмерного воздействия света. Растворить 1 мг fluo-2 утра (молекулярный вес: 1 061 г/моль) в 235.6 мкл ДМСО.
    3. Подготовка рабочего раствора fluo-2 AM. Для одной пластины 96-луночных пробирного смесь 12,5 мкл раствора fluo-2 AM штока (4 мм) и 12,5 мкл неионогенных ПАВ полиола (например, плюрониевого f-127) раствор (20% вес/объем в ДМСО, смотрите Таблицу материалы). 22 мкл этой смеси, 11 мл пробы буфер в 15 мл. Конечная концентрация fluo-2 AM-4 мкм.
      Примечание: Неионогенных ПАВ используется как агент Дисперсия для улучшения водный растворимость fluo-2 утра и, в последствии, для повышения нагрузки ячейки. Чтобы солюбилизировать последнего сурфактанта в ДМСО, тепло образца при 37 ° C и перемешайте регулярно, чтобы получить однородный раствор.
    4. Удалите среднего роста от ранее в сеяный клеток в пластину 96-луночных измерения, переворачивая пластину и сушки на бумажное полотенце.
    5. 100 мкл загрузки раствор красителя на хорошо с помощью многоканальных дозаторов и проинкубируйте 45 мин на RT в темноте.

4. Подготовка 96-луночных полипропилена плиты, содержащие хемокиновых лигандом CXCL12 или соединения под следствием

  1. Получите раунд полипропилена (PP) 96-луночных поддоны (см. Таблицу материалы).
    1. Разрешить Стоковый раствор CXCL12 (1 мг/мл) и Стоковый раствор соединений под расследование, чтобы сбалансировать на RT.
      Примечание: В ультрачистая вода дополнена 0,01% Tween20 и хранятся при температуре-20 ° C как одноразовые аликвоты готовится Стоковый раствор CXCL12.
    2. Подготовить 5 x концентрированный раствор CXCL12 в assay buffer (250 нг/мл, которая равна 31,25 Нм) и 5 x концентрации разбавления каждого соединения (в assay buffer).
    3. Отказаться от акций решения в соответствующие пластины 96-луночных согласно макет предопределенные пластины. Отказаться от 75 мкл/хорошо в пластину, содержащие CXCL12 («плита хемокиновых»), обойтись 50 мкл/хорошо в пластину, содержащих соединения («составные Латы»).
      Примечание: Оба соединений и CXCL12 наконец станет разбавленной 5 x после розлива в пластину измерения. Важно также включить отрицательный контроль скважины, содержащие только Пробирная буфер в составной плиты, а также пластину хемокиновых. Также положительный контроль скважины должны быть включены (т.е., колодцы с CXCL12 в пластину хемокиновых, но с Пробирной буфера в соответствующий скважинах составной плиты).

5. протокол настройки на Считыватель микропланшетов флуоресцирования

Примечание: Считыватель микропланшетов флуоресценции, используемые в настоящем Протоколе передается в Таблицы материалов.

  1. Сначала включите кулер единица флуоресценции пластины читателя и затем на флуоресценции читатель сам. Позвольте начать за несколько минут и откройте системного программного обеспечения.
  2. Создайте протокол assay, с помощью перетаскивания и меню, которое включает в себя следующие шаги:
    1. В диалоговом окне «Параметры» выберите «Read_Mode» с длиной волны возбуждения: 470-495 Нм; Длина волны излучения: 515-575 Нм.
      Примечание: Выбранный волнах подходят для использования с Ca2 +-чувствительных краситель fluo2.
    2. Включить поле «Mix с TF» (жидкости) для автоматического смешивания соединений в пластину соединения, которые будут поставлены в источник 2 позиции устройства (см. шаг 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой скважине автоматически наддува и смешанные три раза. Отрегулируйте высоту наконечники на 20 мкл ниже уровня жидкости. Установите скорость аспирации и дозирования по 50 мкл/сек.
      Примечание: Высота наконечники относится к тому, что осталось под пипеткой советы. Например если скважины составной плиты содержат 50 мкл, высота 30 мкл соответствует 20 мкл ниже уровня жидкости. Объем составные решения, принятые смешивать, скорость смешивания, позиция пипеткой советы во время смешивания, и количество циклов смешивания все регулируется с помощью программного обеспечения.
    3. В диалоговом окне «Передача жидкости» определить что 20 мкл каждого колодца от составной плиты будет передаваться в пластину измерения. Поместите наконечники на 20 мкл ниже жидкости поверхности, то есть, на высоте 30 мкл при аспирации соединений и высота 60 мкл во время отпуска в пластину измерения. Установите скорость аспирации на 50 мкл/с и скорость подачи 25 мкл/сек.
      Примечание: Составные табличка содержит 50 мкл раствора на хорошо (см. шаг 4.1.3), таким образом, высота 30 мкл соответствует позиции 20 мкл ниже уровня жидкости. Пластину измерения будет содержать 80 мкл аналитического буфера за хорошо (см. шаг 6.3), таким образом, высота 60 мкл соответствует аналогичной позиции советов.
    4. Нажмите кнопку «Чтение с TF». Во время первого интервала выберите 60 гласит (флуоресцентные измерения) с временем чтения интервал 1 s. определить, что 10 гласит записываются перед подачей соединений в пластину измерения, и 50 читает потом. Определить второй интервал с чтения интервал 30 s и 18 читает.
      Примечание: Во время этого шага флуоресценции будет измеряться кинетически (промежутки времени) на ~ 10 мин в целом.
    5. Включите кнопку «Вымыть советы» в протоколе три раза. В рамках каждой стирки шаг, выберите тип жидкости: жидкость (ультрачистая вода) или жидкости B (на 70% спирте), количество циклов стирки (1), насос скорость (быстро), и количество штрихов (5) во время каждой мыть шаг.
      Примечание: Во время первого и последнего мыть шаг жидкости A используется, во время второй мыть шаг жидкость, которую B используется.
    6. Включите функцию «Пауза дозаторов». Установите дозаторов для остановки на 300 s.
      Примечание: Включив этот шаг в протоколе, дозаторов головы, которая интегрирована в считывающее устройство флуоресценции пластины, паузу на 5 мин перед продолжением протокол.
    7. Включить поле «Mix с TF» разрешить автоматическое Перемешивание раствора CXCL12 в хемокиновых пластины, которая будет располагаться в источник 3 позиции устройства (см. шаг 6.4). Выберите 15 мкл раствора в каждой скважине автоматически наддува и смешанные три раза. При аспирации и смешивания позиция пипеткой советы 20 мкл ниже уровня жидкости. Скорость аспирации и дозирования устанавливается 50 мкл/сек.
      Примечание: Аналогичные как шаг 5.2.2, эти параметры можно отрегулировать.
    8. В поле «Передача жидкости» последующих определить что 25 мкл от каждой хорошо из хемокиновых плита будет передаваться в пластину измерения. Позиция советы 20 мкл ниже жидкости поверхности, то есть, на высоте 55 мкл при аспирации от хемокиновых пластина, которая содержит 75 мкл/хорошо (см. шаг 4.1.3) и в высоту 80 мкл во время отпуска в пластину измерения. Установите скорость аспирации на 50 мкл/с и скорость подачи 25 мкл/сек.
    9. Включите кнопку «Чтение с TF». Во время первого интервала выберите 145 читает с чтения интервал 1 s. определить, что 5 гласит записываются перед подачей CXCL12 в пластину измерения, и 140 читает потом. Определить второй интервал с чтения интервал 6 s и выберите 20 читает.
      Примечание: Вместе взятые, на протяжении всего протокола записываются 243 читает (флуоресцентные измерений): 78 на этапе 5.2.4 и 165 во время шага 5.2.9.
    10. Подобный шаг 5.2.5, включают в себя кнопку «Вымыть советы» три раза в протоколе.
      Примечание: Включая этот шаг в конце протокола позволяет, что советы могут быть повторно использованы для выполнения другой пробирного без необходимости изменения советы.
  3. Установите температуру устройства при 37 ° C, нажав кнопку «Установить этап температуры» и выбрав пункт 37 ° C.

6. Запуск Assay флуоресцирования

  1. После измерения пластина инкубировали с загрузкой буфер для 45 мин (см. шаг 3.1.5), удалить буфер, перевернув пластину и сушить на ткани.
  2. Вымойте посеян клетки путем добавления 150 мкл/хорошо аналитического буфера и инкубировать в течение 2 мин.
  3. Снова удалите буфер, перевернув пластину. Добавьте 80 мкл/хорошо аналитического буфера с многоканальные пипетки.
  4. Положите все пластины в устройство в их соответствующие позиции: составные источник 2 позиции, хемокиновых пластины на источник 3 позиции и измерения крышку на позицию чтения. Поставьте коробку черного советы в источник 1 советы позиции. Устройства дверь и проинкубируйте 5 мин перед продолжением протокол.
  5. Выберите кнопку «Протокол сигнала тест» для определения фона относительной легких единиц (RLUs) и отклонение люминесцентная через пластину. Новое окно хлопнет вверх. Выберите «Проверить сигнал».
    Примечание: Во время этого шага, фон RLUs, определяются ICCD камеры, которая интегрирована в отсеке оптика флуоресценции считывающее устройство. Эти RLUs в результате возбуждения Ca2 +-чувствительных краситель (fluo-2), светоизлучающие диоды (СИД) (Светодиодные выходной волны 470-495 нм). 8000-10000 RLUs значений хорошо подходит для этого приложения. RLUs может при необходимости, адаптировать путем изменения интенсивности возбуждения (выберите Exc. интенсивности), или ворота камеры (выберите ворота открыты). Расхождение над пластину в идеале должно быть менее 7,5%.
  6. Выберите «Обновление», если получены значения фон 8000-10000 RLUs. Сохраните основной протокол, нажав на кнопку Сохранить.
    Примечание: Поступая таким образом, параметры протокола тест сигнала будет переноситься основного протокола.
  7. Запуск анализа, нажав на кнопку «RUN».

7. анализ данных и качество

  1. После завершения анализа откройте окно «Анализ» в программное обеспечение системы.
    1. Перейдите к «Настройка исправления» и выбрать «ответ по базовой линии». Определение базовой линии 1 начать на измерения 1 и в конце измерений 5; средняя флуоресценции будет рассчитываться в каждой скважине между измерения 1 и 5.
      Примечание: Все дальнейшие измерения от конкретного хорошо разделяются это хорошо конкретных базовой линии 1.
      1. Определение базовой линии 2, чтобы начать измерение 78 до измерения 83 (CXCL12 распределяется после измерения 83; снова среднее флуоресценции рассчитывается в каждом хорошо между измерения 78 и 83 и это поправочный коэффициент применяется для всех измерений после измерение 83).
    2. Активировать галочку «Показывать в процентах» и «вычитание фона».
    3. Перейти к «Настройка кинетическая сокращение». Чтобы оценить эффект соединений на CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, выбирайте макс-мин, начиная с измерения 84 (то есть, первое измерение, после чего обойтись CXCL12) 243 (то есть, окончательный расчет).
      Примечание: Выбирая макс-мин разницу между минимальной и максимальной реакции над базовой линии между измерения 84 и сообщается 243. Если макс-мин начиная между измерения 11 и 78, сообщается разница между минимальной и максимальной реакции над базовой линии относительно базовой линии 1. Это значение может использоваться для анализа потенциальных агонистических активности соединений, см. обсуждение).
    4. Данные будут визуализированы в программное обеспечение системы. При необходимости, экспорт необработанных данных для дополнительного анализа и визуализации в других общих пакетов программного обеспечения анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эффект CXCL12 стимуляция внутриклеточных Ca2 + мобилизации в U87. CD4.CXCR4+ и U87. CD4 клеток проводилась с Ca2 + мобилизации assay. Вместо 20 мкл, комплекса тестов, обычно будет добавлен на первом шаге дозирования протокола (рис. 1), аналитический буфер был добавлен в fluo-2 утра загружен U87. CD4.CXCR4+ клетки в пластину измерения. На втором шаге дозирования, различные концентрации CXCL12 (0,2-102,4 Нм, конечная ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ca2 +-пробирного мобилизации, описанных ранее было показано, быть ценным инструментом для выявления и характеризуют антагонисты рецепторов, ориентация CXCR417. Однако, ожидается что этот метод может в целом применяться к большой группе других GPCR, которые вызывают цитозольной Ca2 + релиз после их активации, как показано для смежных хемокиновых рецепторов CCR5. Тогда как в случае CCR5 может применяться точно так же экспериментальных условиях, несколько шагов в протоколе (...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн и Geert Schoofs за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), фондах воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Fluo-2 AMAbcamab142775флуоресцентный Ca2+ чувствительный краситель
Плуроновая F-127SigmaP2443-250Gплуроновая кислота
ЖелатинSigmaG9391
AMD3100SigmaA5602-5 мгспецифический антагонист CXCR4
Маравирокдобрый подарок антиретровирусного препарата AnorMed, антагонист CCR5
Хемокиновый лиганд CXCL12PeproTech300-28A
Хемокиновый лиганд CCL5PeproTech300-06
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco (Life Technologies)10270-106
Бычья сыворотка альбумин (BSA)SigmaA1933-25G
Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM)Gibco (Life Technologies)41965-039
HBSS (10 x), кальций, магний, без фенола красныйGibco (Life Technologies)14065-049
HEPES (1 M)Gibco (Life Technologies)15630-056
Трипсин-ЭДТА (0,25 %), феноловый красныйGibco (Life Technologies)25200-056
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS)Gibco (Life Technologies)14190-094
Пробирки Falcon, 50 млGreiner Bio-One227 261
Колба для культуры тканей (T75)Corning353024
Черная пластина, 96-луночная, с прозрачным дном, с крышкойCostar/Fisher Scientific10530753пробирная пластина (96-лунка), для посева клеток
Полипропиленовые (ПП) пластиныThermo Scientific (VWR)732-2661используются для приготовления сложных планшетов и хемокина пластины, круглое дно
FLIPR Tetra высокопроизводительная система клеточного скринингаMolecular DevicesСчитыватель флуоресцентных пластин со встроенной головкой пипеттора и камерой ICCD
FLIPR Tetra LED Module 470 - 495 нмМолекулярные приборы0200-6128Светоизлучающие диоды для возбуждения флуоресцентного Са2+ чувствительного красителя
FLIPR Tetra Emission Filter 515 - 575 нмМолекулярные устройства0200-6203эмиссионный фильтр, совместимый с флуоресцентным красителем
FLIPR 96 HeadMolecular Devices0310-453696-луночная головка пипеттора, интегрированная в программный
ScreenWorksMolecular Devicesиспользуемый для анализа и визуализации данных на
анализаторе
Corning CellBIND 96 Плоские плоские микропластины из черного полистирола с прозрачным дном, с крышкой, стерильныеCorning3340с предварительным покрытием, которые могут представлять собой альтернативу ручному покрытию пробирной пластины.
пакет, жизнеспособности клеток FLIPR Tetra Vi-CELL Beckman Coulter 96-луночные пластины

Ссылки

  1. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  2. Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
  3. Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
  4. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
  5. Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, Suppl 1. S46-S55 (2006).
  6. Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
  7. Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
  8. Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
  9. Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
  10. Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
  11. Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
  12. Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
  13. Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
  14. DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
  15. Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
  16. Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
  17. Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057(2017).
  18. Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
  19. Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
  20. Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
  21. Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
  22. Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
  23. Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
  24. Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
  25. Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
  26. De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
  27. Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
  28. Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
  29. Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
  30. Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
  31. Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
  32. Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
  33. Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
  34. Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
  35. Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
  36. Wang, Z. -x, et al. Chemokine Biology - Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. Neote, K., Letts, G. L., Moser, B. , Birkhäuser Basel. 61-77 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GPCRCXCR4GPCRCXCL12

Похожие статьи