Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол в массовое производство сайленсинга генов мышиных НК-клеток с помощью свободной подачи дифференциации системы для механистический исследование в пробирке и в естественных условиях.

Аннотация

Природные убийца (НК) клетки принадлежат к врожденной иммунной системы и первой линии борьбы против рака иммунной защиты; Однако они подавляются в микроокружения опухоли и основной механизм по-прежнему во многом неизвестным. Отсутствие последовательной и надежным источником НК-клеток ограничивает ход исследований NK клеток иммунитета. Здесь мы приводим в vitro систему, которая может обеспечить высокое качество и количество костного мозга-производные мышиных NK клеток при условии подачи бесплатно. Что еще более важно мы также продемонстрировать, что малых интерферирующих РНК опосредованной генов успешно тормозит созревание клеток NK E4bp4-зависимых с помощью этой системы. Таким образом этот роман в vitro NK клеток дифференциации системы это решение биоматериала для исследования иммунитета.

Введение

Прогрессии рака в значительной степени зависит от опухоли микроокружения^1,2, включая хост производные immunocytes, например, НК-клеток. Несколько исследований показали, что клетки внутриопухолевых негативно коррелируется с^3,прогрессии опухоли⁴. Кроме того клинические исследования показали, что НК клеточной терапии приемных возможная стратегия для рака^5,6,,78,9. NK на основе ячеек Рак иммунотерапия недавно была предложена в качестве терапевтического вариант для солидных опухолей, но существуют проблемы из-за секрецию цитокинов иммуносупрессивных и Даунрегуляция активации лигандами в микроокружения твердых опухолей ^10,11. Преобразование фактор роста β (TGF-β) было предложено играть подавляющих роль в канцерогенеза, но парадоксально раковые клетки также производят TGF-β1 поддержать опухоли развития^{12,13,14 , 15}. Фонд TGF-β сигнализации можно подавить цитолитических активности НК-клеток через вниз регулирует отзывчивость интерферона и CD16-опосредованной интерферона гамма (ИФН γ) производство в vitro^{16,17, 18}.

Хотя нарушение TGF-β сигнализации в микроокружения опухоли может быть одним из возможных путей для устранения рака, полностью блокируя TGF-β сигнализации вызовет аутоиммунных заболеваний из-за его противовоспалительные функции, о чем свидетельствует разработка ¹⁹модели неблагоприятные побочные эффекты, включая внутрирастительного воспаления, сердечно-сосудистых дефектов и аутоиммунные заболевания в мыши. Таким образом понимание механизма работы TGF-β-опосредованной иммуносупрессия приведет к идентификации доступных терапевтических мишенью для лечения рака.

Для выяснения молекулярные события, необходимые для развития клеток NK, Williams et al. создал систему в пробирке для дифференциации мышиных костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток в NK клеток²⁰. Эта система во многом облегчает механистический исследование развития НК клеток, включая выявление Роман прародителями NK клеток²¹. Однако, предшественники костного мозга следует культивировали в системе с поддержкой OP9 стромальные клетки как фидер слоя^20,21, и этой неоднородной ячейки населения во многом ограничивает дальнейшее применение гена-срыве инструменты (например, малых интерферирующих РНК опосредованной генов) конкретно применительно к дифференциации НК-клеток.

Здесь мы описываем фидер бесплатная система, которая была разработана путем дальнейшего изменения системы в vitro Williams et al²⁰. В нашей системе OP9 клетки стромы фидер не требуются, и вместо OP9, условно средних используется не затрагивая дифференциации NK клеток в пробиркеи это недавно привести нас к раскрыть, что способны содействовать прогрессии рака через TGF-β подавление развития НК E4bp4-зависимых клеток в микроокружения опухоли²². Эта новая система успешно обеспечивает фон, свободной метод для выяснения молекулярный механизм развития НК клеток при определенных условиях (например, высокая TGF-β1, сайленсинга генов малых интерферирующих РНК опосредованной, и т.д.) в пробирке.

Протокол

Протокол для получения и дифференциации костного мозга-производные NK клеток (БМ-NK) основывается на ранее опубликованные методы^20,21,22. Все процедуры с мышей были утверждены экспериментальные Комитет животных этики (AEEC) в китайском Университете Гонконга.

1. Подготовка условной средней OP9

1. Культура линии клеток стромы мышиных OP9 в альфа MEM, содержащий 20% FBS, 100 ед/мл пенициллин G и стрептомицина 100 мкг/мл при 37 ° C в атмосфере увлажненный воздух/CO₂ (95%: 5%).
   1. Подсчет количества ячеек с Горяева, затем семян 2 x 10⁶ клеток OP9 для каждого 75 см² культуры колбу с 15 мл среды. Культура для 48 ч.
   2. Когда культура достигает 80% слияния, мыть флакон с 10 мл PBS и добавляют 20 мл простого альфа MEM среды (без FBS и антибиотиков) за флакон.
2. Собрать OP9 состояние среды от культуры колбу на 24 ч, очистить ячейки мусор с 0,25 мкм фильтром Полиэфирсульфон (PES) и сохранить на 4 ° C (использование в течение 2 недель).

2. изоляция клетки костного мозга мыши

1. Усыпить 12-недельных C57BL/6J мышь с Пентобарбитал передозировки (100 мг/кг, внутрибрюшной инъекции). Подтвердить смерть отсутствие дыхания, а затем урожай бедренной кости с хирургического ножа режущего развязках между костями и удалите остальные мышцы с лезвием, нежный царапин.
2. Место кости в центрифуге Тюбик 50 мл, содержащие охлажденные стерильные альфа MEM и затем выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета.
3. Удалить альфа MEM среднего и промыть кости с 70% этанол 30 s.
4. Вымойте кости с ледяной стерильные PBS дважды, чтобы очистить оставшиеся этанола.
5. Передача в раствор, содержащий 5 мл ледяной PBS кости, и осторожно раздробляет кости с пестиком (не растирать их).
6. Агитируйте кости осторожно, закрученной пестик для выпуска клеток костного мозга в PBS. Соберите содержащий клетки костного мозга PBS в новых центрифуг Тюбик 50 мл.
7. Повторите шаг 2.6 для четыре раза, до тех пор, пока костных фрагментов стать горит белым цветом.
8. Центрифуга для трубки на 465 g x 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
9. Ресуспензируйте лепешка с 18 мл стерильной дистиллированной воды и дайте ему постоять 30 s для удаления красных кровяных клеток.
10. Добавить 2 мл ледяной 10 X PBS для остановки реакции, затем фильтр смесь через сито ячейки 70 мкм, чтобы удалить лизированных красных кровяных клеток.
11. Центрифуга для трубки на 465 g x 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с 20 мл ледяной PBS.
12. Вымойте клетки, повторив шаг 2.11 во второй раз.
13. Перевести ячейку Пелле на Петри блюдо стерильные с 10 мл OP9 условного среды с шагом 1,2 100-мм дополнены 20% FBS и смесь 0,5 нг/мл мышиных IL-7, 30 нг/мл мыши СКФ и 100 ед/мл мышиных flt3L.
14. Инкубировать блюдо при 37 ° C с 5% CO₂ на 2 ч. Передача неприсоединенной клетки в новый контейнер культуры на плотности тарелок 5 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл (количество клеток Горяева с исключения Трипановый синий) с той же средней формулы как шаг 2.13 и инкубировать при 37 ° C с 5% CO₂.
15. День 4 изменить состояние культуры OP9 условного средний дополнены 20% FBS и 2 000 ед/мл мышиных Ил-2.
16. Обновите питательной среды каждые 3 дней; Зрелые клетки могут получены 7 день и квалифицированных как в разделе 4.

3. малых интерферирующих РНК опосредованной глушителя генной дифференциации НК-клеток

1. Премикс управления (NC) малых интерферирующих РНК или чушь с агентом трансфекции согласно руководству продукта.
2. Выполните шаг 3.1 в любой момент времени, начиная с дня 0.
3. Добавьте 50 Нм siRNA или смеси НК клеток от шага 2.14.
4. Повторите шаг 3.1 на каждый средней закуска (например, день 0, 4 и 7) до экспериментальной конечной точки.

4. анализ дифференцировки клеток NK с помощью проточной цитометрии

1. В соответствующее время точке собирать подвеска дифференциации клеток и мыть с ледяной PBS.
2. Закрепите клетки клетки фиксации буфера согласно руководство по продукции.
3. Вымойте фиксированные ячейки с ледяной PBS и затем Ресуспензируйте 1 х 10⁶ клеток в 100 мкл потока буфера пятнать цитометрии содержащий Cy3-конъюгированных анти мыши NKp46 и PE-конъюгированных антител CD244 анти мыши в коэффициенте разбавления 1: 100.
4. Пятно образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
5. Ресуспензируйте окрашенных образцов с 300 мкл PBS, а затем приобрести данных СУИМ и анализировать с Cytobank платформы²⁰ (http://cytobank.org/).

Результаты

Представитель результаты получаются после описанных протокол. Всего костного подвеска клеток выращивали под фидер бесплатно дифференциации системы 11 дней; день 7, по сравнению с количество общего числа клеток в день 0 (рис. 1A) было отмечено значительное увеличение темпов распространения. Зрелые НК-клеток с высоким соотношением ядерной в цитоплазматической и морфология цитоплазме гранулы богатые были найдены 6 день в системе (

Обсуждение

В настоящей работе мы описали новый метод для производства костного мозга-производные мышиных NK-клетки в пробирке. Клетки фидера в оригинальной системы^21,22 успешно заменены условной средней OP9 клеток, которые во многом увеличена стабильность системы дифференциации. Кроме того система может производить высокого количества и чистоту Зрелые NK клеток в vitro , а также в vivo анализов, которые могут облегчить механистический исследования...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клеточная линия OP9	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, без нуклеозидов	Gibco	22561021
фетальная сыворотка крупного рогатого скота	Gibco	10500064
PBS, pH 7,4	Gibco	10010049
рекомбинантная мышиная IL-7	PEPROTECH	217-17
рекомбинантная мышиная SCF	PEPROTECH	250-03
рекомбинантная мышиная Flt3-лиганд	PEPROTECH	250-31L
Рекомбинантный мышиный IL-2	PEPROTECH	212-12
Липофектамин RNAiMAX Реагент для трансфекции	Invitrogen	1377815
IC Fixation Buffer	eBioscience	00-8222-49
Буфер для окрашивания проточной цитометрией	eBioscience	00-4222-26
PE-конъюгированный антимышиный CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-конъюгированный антимышиный NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense control (NC)	Ribobio	siN05815122147
миРНК против мыши E4BP4 мРНК	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& первичный;