Здесь мы представляем протокол для увеличения производства Химера без использования нового оборудования. Изменение простой ориентации эмбриона для инъекций может увеличить количество зародышей и потенциально сократить сроки передачи микрофлорой.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Транс внутренняя ячейка массы впрыска эмбриональных стволовых клеток приводит к более высоким ставкам химеризма
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В целях повышения эффективности в деле создания генетически измененных мышей через клетки ES методологии мы представляем адаптация к нынешнему Протоколу инъекции бластоциста. Здесь мы приводим простой поворот эмбрион, и инъекции через транс-внутренней клеточной массы (TICM) увеличение доли химерных мышей от 31% до 50%, без дополнительного оборудования или дальнейшей специализированной подготовки. 26 различных инбредных клонов, и 35 всего клоны были введены в течение 9 месяцев. Существует никакого существенного различия в беременности или скорость восстановления эмбрионов между традиционными инъекций методы и TICM. Таким образом без каких-либо крупных изменений в процессе впрыска и простого позиционирования бластоцисты и инъекций через ICM, выпустив ES клеток в полость blastocoel потенциально может улучшить количество химерных производства и последующего микрофлорой передачи.
Введение
Почти 25 лет создание генетически целенаправленные мышей был медленный процесс, часто препятствует узкое место на этапе микроинъекции клеток бластоцисты ES для поколения микрофлорой, препровождающее химер. Последние достижения, включая ТРИФОСФАТЫ/Cas91,2 ориентации в клетки ES и высок объём ES клеток поколения консорциумов как комп, улучшили поколения/наличие генетически модифицированных ES клеток. Однако поколение микрофлорой химер остается узким местом в создании генетически измененных мышей от этих клеток ES3,4. Высок объём ES клеток поколения проек....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все операции были проведены как часть нормальной эксплуатации объекта NIEHS Knock Out мыши Core. Все мышей держали на 12:12 ч света: темные цикл и были кормить диете из низ-31 и воды ad libitum. Все эксперименты были проведены в соответствии с животное уход и использование Комитета национального института окружающей среды медицинских наук.
1. животных подготовка
- Порода мышей доноров, В6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j. самок мышей на 8-10 недель возраста, естественно B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j. самцов мышей от 8 до 26 недель возраста. Вилки визуально проверьте следующее утро (E0.5).
- Порода получателей мышей, Швейцарский Уэбстер....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Лечении линия клетки как случайный эффект, смешанные эффекты линейная модель была использована для анализа данных в программном обеспечении (например, SAS (версия 9.2)). Каждый анализ, контролируемых количество эмбрионов переведены и линии клеток. Второй анализ, также контролируется количество детенышей, которые выжили.
Для этого исследования, каждая линия клетки ES и клон был введен как с традиционными, так и TICM методы, черед.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Долго думал, что любое нарушение ICM может привести к смертности, в самом деле, текущий бластоциста микроинъекции протоколы еще предупредить этот12,13. То, что мы показали здесь, что микроинъекции через ICM не наносит ущерба эмбриона и увеличивает доходность химер.
Точный механизм этого эффекта выявлено не было. Однако механические нарушения ICM и сопутствующие Гипобласт, следует увеличить масштабы интеграции клетки ES в новообразованн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано [в частности] интрамуральных исследовательской программы NIH, Национальный институт экологических наук о здоровье. Особая благодарность Shyamal Peddada для статистического анализа. Мы также хотим поблагодарить Хамфри Яо, Гэри птица и Yuki Arao для обзора этой рукописи и Франко мая за его неизменную поддержку и консультации.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Игла для инъекций ES Cell | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | лоты должны быть индивидуально протестированы на совместимость с ES Cell. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| β-меркаптоэтанол | Sigma | M7522 | |
| Микроманипулятор | Leica | Микроманипулятор | |
| микроинжектор | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Микроскоп | Leica | DM IRB | |
| 4 скважинная чашка | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 мм тарелка | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J | Jackson Labs, Бар-Харбор, штат Мэн, США | 000058 | |
| Швейцарские мыши Webster | Taconic, США | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | П50Г-0-30-Ф |
Ссылки
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6), 823-826 (2013).
- Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
