Визуализации тканей сетчатки может предоставить информацию одной ячейки, которые не могут быть собраны от традиционных биохимических методов. Этот протокол описывает подготовка конфокальная томография сетчатки кусочки от данио рерио. Флуоресцентный генетически закодированный датчики или индикатор красители позволяют визуализации многочисленных биологических процессов в типах различных клеток сетчатки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетчатка является сложной ткани, которая инициирует и интегрирует первые шаги видения. Дисфункция клеток сетчатки является отличительной чертой многих ослепительный заболеваний, и будущее терапии зависят от основных договоренностей о как различные сетчатки, что клетки нормально функционировать. Получение такой информации с биохимическими методами оказалось сложным делом, потому что вклад конкретной ячейке типов уменьшаются в обстановке клеток сетчатки. Живой сетчатки изображений может предоставить представление многочисленных биологических процессов на субклеточном уровне, благодаря растущее количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчиков. Однако этот метод до настоящего времени была ограничена головастиков и личинки данио рерио, внешнего слоев сетчатки изолированных сетчатки или ниже резолюции томография сетчатки в живых животных. Здесь мы представляем метод для создания живых ex vivo сетчатки фрагменты из взрослых рыбок данио для живых изображений через confocal микроскопии. Эта подготовка дает поперечные срезы со всех слоев сетчатки и большинство типов клеток, видимые для выполнения конфокальный изображений эксперименты с использованием перфузии. Трансгенные данио рерио выражая флуоресцентные белки или биодатчики в типы конкретных сетчатки клетки или органеллы используются для извлечения информации одной ячейки из нетронутыми сетчатки. Кроме того фрагменты сетчатки могут быть загружены с флуоресцентный индикатор красители, Добавление метода универсальность. Этот протокол был разработан для визуализации Ca2 + в zebrafish конус фоторецепторов, но с надлежащей маркеры могут быть адаптированы для измерения Ca2 + или метаболитов в клетки Мюллер, биполярных и горизонтальные клетки, микроглии, Амакриновые клетки или сетчатки клетках ганглия. Пигментный эпителий сетчатки удаляется из кусочков, поэтому этот метод не подходит для изучения этого типа ячейки. С практикой это возможно для создания последовательных фрагментов из одного животного для нескольких экспериментов. Эта адаптируемых техника предоставляет мощный инструмент для ответа на многие вопросы о биологии клетки сетчатки, Ca2 +и энергетического гомеостаза.
Введение
Данио рерио (Danio рерио) стала широко используется в медицинской и базовые научные исследования1, из-за ее небольшого размера, быстрое развитие и позвоночных органов и систем. Естественный прозрачности данио рерио личинок в сочетании с установленными методами для трансгенез позволили подробные визуализации клеточных процессов в живых животных. Количество генетически закодированный флуоресцентные биодатчики были направлены конкретные данио рерио клеток, чтобы обнаружить Ca2 + 2, перекись водорода3, apoptotic активации4 и5СПС.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были утверждены университета Вашингтона институциональных животное уход и использование Комитета.
1. Подготовка животных и оборудования
Примечание: Пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), это темный лист ткани вокруг снаружи сетчатки, чьи пигментация может скрывать сетчатки особенности и повреждать ткани когда конфокальное изображение ex vivo. В темноте НПП данио рерио отказался от сетчатки; Темный адаптировать рыбы для облегчения будущего удаления НПП от сетчатки до нарезки и обработки изображений.
- Передавать нереста бак с водой рыбы, рыбы и затем обернуть нереста танк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Стабильные позиционирования и поперечной ориентации фрагменты являются ключом к успешной изображений с инъекций или перфузии фармакологических агентов. Тщательно изучить и изменить срезов до конфокальная томография при необходимости обеспечить всех слоев сетчатки видны (рисунок 2A, фрагмент ii). Если фрагмент поворачивается слегка вперед (рис. 2A, ломтик iii), связки внешних слоев будут видны и небольшие поправки могут быть сдела.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ex vivo томография сетчатки Ломтики свежих данио рерио оказался универсальный инструмент для изучения фоторецепторных биологии20,21,22и является уникальным в том, что он позволяет анализ единичных клеток в зрелых, полностью дифференцированные сетчатки. С практикой можно проводить несколько экспериментов с ткани от одной рыбы, даже с использованием последовательных фрагментов из той же части сетчатки. Помимо проблемы и п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Ральф Нельсон и Daniel Possin для продуманного руководства при разработке этот протокол и Eva мА, Эшли Джордж и Гэйл Стэнтон для формирования стабильных данио рерио трансгенных линий. Работа была поддержана NSF GRFP 2013158531 для м.г., низ NEI 5T32EY007031 туалетное и м.г. и EY026020 J.H. и с.б.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| данио рерио | Вашингтонский университет Саут-Лейк Юнион Акватикс Запасы | поддерживаются внутри компании как стабильные трансгенные линии | |
| вазелин вазелин | Fisher Scientific | 19-090-843 | для шприца с вазелином |
| 3 мл шприц со скользящим наконечником | Fisher Scientific | 14-823-436 | для шприца для вазелина |
| 20 г 3,8 см игла с скользящим наконечником | Fisher Scientific | 14-826-5B | для вазелина шприц |
| простой 7 см X 2,5 см предметное стекло для микроскопа | Fisher Scientific | 12-550-A3 | для препарирования наглазника, камера для нарезки |
| Seche Vite прозрачный лак для ногтей | Amazon | B00150LT40 | для камеры для нарезки |
| 18 мм X 18 мм #1 стеклянные покровные стекла | Fisher Scientific | 12-542A | для визуализации |
| лестницы без ароматизаторов стоматологический воск | Amazon | B01K8WNL5A | для визуализации лестниц |
| двухлезвийных бритвенных лезвий | Stoelting | 51427 | для среза |
| тканей тканевый слайсер с цифровым микрометром | Stoelting | 51415 | для срезки тканей |
| фильтровальная бумага - белая сетка смешанная целлюлоза, диаметр 13 мм, 0,45 &; m размер пор | EMD Millipore | HAWG01300 | фильтровальная бумага для крепления сетчатки |
| 10 см чашка | Петри Fisher Scientific | FB0875712 | для эвтаназии, вскрытия, визуализации лестницы в сборе |
| 15 см деревянная аппликаторная палочка с плоским наконечником | Fisher Scientific | 23-400-112 | для проволоки петля для глаз инструмент |
| 30г (диаметр 0,25 мм) вольфрамовая проволока | Fisher Scientific | AA10408G6 | для проволочная петля петля |
| D-глюкоза | Sigma Aldrich | G8270 | компонент исходного раствора добавки |
| L-лактат | натрия Sigma Aldrich | L7022 | компонент исходного раствора добавки |
| пируват | натрия Sigma Aldrich | P2256 | компонент исходного раствора добавки |
| L-глутамин | Sigma Aldrich | G3126 | компонент исходного раствора добавки |
| L-глутатион, восстановленный | Sigma Aldrich | G4251 | компонент исходного раствора добавки |
| L-аскорбиновая кислота | Sigma Aldrich | A5960 | компонент исходного раствора |
| добавки NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | компонент раствора Рингера |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | компонент раствора |
| РингераCaCl2 · 2H2O | Sigma Aldrich | C3881 | компонент раствора Рингера |
| 2PO4Sigma | Aldrich | S8282 | компонент раствора Рингера |
| MgCl2 · 6H2O | Sigma Aldrich | M0250 | компонент раствора Рингера |
| HEPES | Sigma Олдрич | H3375 | компонент раствора |
| Рингера трис основание | Fisher Scientific | BP152 | компонент Na+ свободный раствор Рингера |
| 6 N HCl | Fisher Scientific | 02-003-063 | компонент Na+-free раствор Рингера |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5655 | компонент Na+-free раствор Ringer's solution |
| 50 мл коническая центрифужная пробирка | Denville Scientific | C1062-P | контейнер для решения Ringer's |
| ножницы Vannas - 8 см, угловые лезвия 5 мм | World Precision Instruments | 501790 | микроножницы для рассечения наглазника |
| швейцарский пинцет - #5, 11 см, прямой, 0,06 X 0,07 мм наконечники | World Precision Instruments | 504510 | тонкие щипцы для рассечения наглазника и манипуляций с ломтиками |
| однолезвийные бритвенные лезвия | Fisher Scientific | 12-640 | для рассечения наглазника и обрезки фильтровальной бумаги |
| EMD Миллипоровые фильтрующие щипцы | Fisher Scientific | XX6200006P | плоские щипцы для работы с влажной фильтровальной бумагой |
| C12 558/568 BODIPY | Fisher Scientific | D3835 | окрашивает живые ядра клеток; Инкубатор 5 & микро; г/мл в течение 15 мин при комнатной температуре |
| йодида пропидия (PI) | Fisher Scientific | P3566 | окрашивает ядра мертвых клеток; инкубировать 5 & микро; г/мл в течение 20 мин при комнатной температуре |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | окрашивает ядра живых клеток; инкубировать 5 & микро; г/мл в течение 20 мин при комнатной температуре |
| тетраметилродамин, метиловый эфир (TMRM) | Fisher Scientific | T668 | окрашивает функциональные, отрицательно заряженные митохондрии; инкубировать 1 нМ в течение 30 мин при комнатной температуре |
| в камере для перфузии тканей | Cell MicroControls | BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] | камера визуализации для инъекций или перфузии |
| 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-дезоксиглюкоза (NBDG) | Scientific N13195 | перорально данио-рерио за 30 минут до эвтаназии | |
| Olympus лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | Olympus | FV1000 | конфокальный микроскоп для визуализации флуоресценции срезов с разрешением одной клетки |
| Карбонилцианид 3-хлорфенилгидразон (CCCP) | Sigma Aldrich | C2759 | экспериментальный реагент, который аблицирует митохондриальное дыхание; обработать ломтики до конечной концентрации 1&микро; |
| M миниатюрный аспиратор | позиционер Cell MicroControls | FL-1 | для перфузионного |
| перфузионного коллектора, коллектор газового барботера, клапан потока, держатель шприца 60cc | Warner Instruments | различные | для перфузии |
Ссылки
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
