Методическая статья

Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак

DOI:

10.3791/57012

⸱

20 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology, Johannes-Gutenberg University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology, Technical University of Munich Medical Center, 3Department of Otorhinolaryngology, Ludwig-Maximilian-University Medical Center, 4Department of Otorhinolaryngology, University of Goettingen Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем эволюции на основе сфероида, трехмерный в vitro модель, которая позволяет нам проверить текущий стандарт экспериментальной терапии схем для головы и шеи плоскоклеточный рак на клеточных линий, направленных на оценку терапии восприимчивость и сопротивления на первичной клетки от человеческих образцов в будущем.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущие варианты лечения для продвинутых и рецидивирующий головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) заключить излучения и химио лучевой подходы с или без хирургического вмешательства. Хотя схемы химиотерапии на основе платины в настоящее время представляют золотой стандарт с точки зрения эффективности и даны в подавляющем большинстве случаев, новых схем химиотерапии, а именно появляются иммунотерапии. Однако трудно предсказать и остаются недостаточно понятны ответов и терапии сопротивление механизмы либо режим химиотерапии. На сегодняшний день известны широкие вариации химиотерапии и радиационной механизмов сопротивления. Это исследование описывает разработку стандартизированных, высокой пропускной способности в vitro пробирного оценить ответ HNSCC клеточной линии для различных схем терапии и, надеюсь, на первичной клетки от отдельных пациентов как инструмент будущего для персональной опухоли терапии. Assay предназначен для интеграции в стандартный алгоритм контроля качества для HNSCC пациентов в нашем центре третичной медицинской помощи; Однако это будет предметом будущих исследований. Техническая осуществимость выглядит многообещающим для начальных ячеек от биопсии опухоли от фактической пациентов. Затем образцы передаются в лабораторию. Биопсия механически отделены следуют ферментативного пищеварения. Клетки затем культивировали в ультра-низкой адгезии клеток культуры флаконов, способствующих воспроизводимость, стандартизированных и спонтанного формирования Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Сфероидов затем готовы быть подвержены химио лучевой протоколы и протоколы иммунотерапия при необходимости. Окончательный размер жизнеспособность и сфероида показатели восприимчивости терапии и поэтому может быть втянутыми в рассмотрение в будущем для того, чтобы оценить ответ вероятно терапии пациентов. Эта модель может быть ценным, экономически эффективным инструментом к персонализированной терапии рака головы и шеи.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Голова и шея плоскоклеточный рак (HNSCC) является шестым наиболее распространенных рака во всем мире с ростом случаев инфицирования слизистой оболочки вируса папилломы человека (ВПЧ) инфекции связанные патогенеза, рядом с большинством случаев, вызванных чрезмерным никотина и алкоголя потребление 1,2. Хотя небольшие опухоли и неинвазивного этапов, как правило, хорошо поддается лечению с хирургическое иссечение, обычно в сочетании с шейки матки лимфодиссекции, лечение для расширенного этапа и рецидивирующий HNSCC остается сложным из-за вторжения агрессивным опухоль с Метастатические распространение и устойчивость к радиации и химиотерапии протоколы3,4,5,6,,78. Недавние исследования показывают высокую изменчивость клеточном фенотипу и суб характеристика циркулирующих и распространение раковых клеток только начался9,10. Ранее вера твердых, форма опухоли массы пришлось пересмотреть в свете последних исследований в прошлом лет11,12,13,14. Нынешние подходы для характеристики опухоли и выявление ключевых мутаций может определить несколько генов, которые, кажется, быть связаны с терапии сопротивление, но остаются дорогостоящих подход. Кроме того знание генотип не обязательно позволяют надежное прогнозирование фенотипа и его лечение реакции.

Там было несколько достижений в улучшении общей и безрецидивной выживаемости для расширенный этап и повторяющихся болезней. Никотин - а также связанные вирус карциномы текущие варианты лечения Помимо хирургии заключите агрессивной радиационной и химиотерапии на основе платины схемы. Там были последствия для различных ответов между ВПЧ отрицательных и положительных карцинома; Однако это еще не приведет к изменению в целом руководящие принципы терапии. Устойчивость к радиации и химиотерапии является широко распространенным явлением во всех стадиях опухоли и существует на основе платины химиотерапии также, как для целенаправленной терапии (анти-EGFR; рецептор эпидермального фактора роста) и недавно новые ингибирование контрольно-пропускного пункта15. Неэффективные лучевой и химиотерапии приходят высокой ценой значительных пациента заболеваемости с точки зрения дисфагии, мукозит, сухость во рту и риск снижения функции почек или сердца среди других. Прогнозирование терапии реакции предварительное решение концепции общей терапии для каждого отдельного пациента, как представляется, решающую цель, предотвращая концепции ненужных лечения, побочные эффекты и расходы.

Мы стремились создать модель для проверки конкретного пациента лечение восприимчивость к текущей стандартной химио излучения, которые могут быть интегрированы в регулярных и контролем качества онкологического лечения алгоритм с точки зрения технической стоя. Далеко целью было использовать модель без использования сильно изменены и возрасте клеточных линий, как плохо они представляют собой фактические человека опухолевых клеток без их изменчивости и неоднородности, как мы знаем теперь, при создании протокола было сделано в различных клеточных линий. Быть независимым только от коммерчески доступных клеточных линий, мы недавно успешно созданы промежуточные клетки линии, называется «Пика» от первичных клеток HNSCC от человека опухоли образцов с сохранение клеточных маркеров на его поверхности и ограниченные отрывки 16. это PiCa клеточной линии должны служить подготовка к разработке модели на дороге к позже после испытания с свежими человеческих раковых клеток с биопсий опухоли. Было показано, что клетки в трехмерной клеток культур по-разному реагируют и более в естественных условиях-как для отправления рака наркотиков, чем тех, кто растет в монослои17,18,19,20 ,21, главным образом благодаря сохранению мигрирующих и суб дифференциация свойств определенных ячеек подмножеств22,23,24. Здесь мы описываем протокол на основе сфероида, трехмерные модели из промежуточных клеточных линий и первичного человека плоскоклеточный рак ячейки и способы как интегрировать такую модель в лечение рака головы и шеи хирург, онколог ( Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все исследования, показано в этой рукописи, а именно использование образцов человека опухоли, защищены и в согласии с предыдущими решениями от медицины Университета Майнца/Университет Мюнхена медицинский центр по этике. Пациентов дали осознанного согласия согласно национальных правовых руководящих принципов, согласившись научного использования избыточного биологического материала, который был получен в ходе их лечения. Исследование проводилось во исполнение всех институциональных, национальные и международные руководящие принципы для благополучия человека.

1. Принимая биопсия опухоли головы и щеколда плоскоклеточный рак

  1. Выполнять общие (пропофолом и/или севофлуран, расслабляющий мышцы агент) или местные инфильтрат (2% ultracaine, адреналин) / поверхности (xylocaine) анестезии в операционной комнате или ЛОР кресло экспертизы. Визуализировать массы опухоли в устной полости, глотки, гортани, других частях верхнем тракта пищеварения и дыхания с стандартной операционной инструментов и, при необходимости, под микроскопом.
  2. Возьмите биопсии свежие опухоль от периферии раковые новообразования с тупым или режущие инструменты. Избегайте центр поражения результате обильные некроза в этой области. Поместите полученные ткани в стерильный контейнер с натрия хлорида изотонический раствор.
  3. После биопсии, гемостаз при необходимости выполните, например., с устройством биполярный или монополярная коагуляция, помимо использования сосудосуживающих веществ.
  4. Принесите биопсия опухоли, использоваться для экспериментов культуры клеток непосредственно в прилегающие Лаборатория тракта. Отправьте другой биопсий тумора pathologist как обычно, чтобы исключить рак.
  5. Убедитесь, что лаборант готова для обработки образца непосредственно.

2. обработка образца тумора

  1. Поместите образец опухоли на поверхность подходящим и стерильные и нарезать его тщательно с стерильным скальпель одноразовый как можно меньше.
    Предупреждение: Убедитесь, что статус инфекционных и передаваемых через кровь заболеваний хорошо документированы и техник в внимание учреждений стандартные протоколы для предотвращения иглы stick или резки травмы с потенциально биологически опасных пациентов материала и протоколы следовать после возможной травмы.
  2. После достаточного механического разделения основной ткани, положить ткань во флакон, содержащий коллагеназы I / II и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Сито через стрейнер клеток Сокол 70 мкм и мыть подвеска с Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS).
  3. После успешного разъединения и последующие стирки место суспензии, содержащей 1-2 × 106 клеток в T75 колбы культуры клеток (75 см2) расти в суб confluency в 5% CO2 и температуре 37 ° C. Этот шаг может занять до 10 дней.
    1. Использовать специальные кератиноцитов питательной среды, состоящей из следующих: 125 мл Дульбекко модифицированная орлы среднего (DMEM), 250 мл кератиноцитов дополняет среды (дополняться среднего, состоящий из 500 мл среды SF кератиноцитов, 15 мг гипофиза крупного рогатого скота экстракт (BPE), 2,5 мл пенициллина/стрептомицина, 150 нг рекомбинантного человеческого эпителиального фактора роста (EGF), 516 мкл 300 мм CaCl2, запасов смеси должен быть подготовлен заранее), 125 мл F12 питательные смеси, 10 мг BPE (0,75 мл), 75 нг рекомбинантного человеческого EGF (2 мкл) , 3,75 мл 200 мм L-аланил-L-глютамин-дипептид (таблица материалов).

3. Заполнение ячеек в ультра-низкой адгезии клеток культуры пластин

  1. Подтверждают рост опухолевых клеток под микроскопом. Подсчитать ячейки в культуре (первичный или клеточные культуры) и семян 5000 первичной опухоли клетки или клетки 1,000-2,000 промежуточных клеточной линии / линия другие клетки в 200-300 мкл СМИ (шаг 3.2.) в ультра-низким сцеплением пластины с вогнутой, круглые днища (96-луночных).
  2. Культура клетки на 5% CO2 при 37 ° C и в равных частях DMEM и сократимость эпителиальных клеток среднего (BEGM), плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина, пируват натрия 1%, 1% несущественные аминокислот, 1% L-глютамин (шаг 2.3.). Если используются клеточные линии, средства массовой информации на основе DMEM является достаточным.
    1. Выполните изменения средств массовой информации каждый день. Обратите внимание не аспирационная сфероида с пипеткой во время изменения средств массовой информации. Культура сфероидов до уровня роста, как descibed в 3.3 достигается (примерно 7-10 дней).
  3. Подтвердите спонтанное сфероида формирования под микроскопом, ищет Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Исключите скважин с нерегулярными или нескольким сфероида формирования от дальнейшего расследования.
    Примечание: Сфероидов должны быть видны невооруженным глазом, тоже, содействия дальнейшей обработки и средства массовой информации изменения, как описано ниже.

4. выявление сфероидов смешанных стандартных или экспериментальных опухоли терапии

  1. Выбор режима желаемого терапии. Дизайн достаточно большими управления группы, которые позволяют сравнения лечения для без лечения сфероидов или получения только частичное терапии лечения, напримерсфероидов. излучение в одиночку. Размер группы элементов управления зависит от конструкции экспериментальной группы и не может быть определена повсеместно.
  2. Обмен средств массовой информации к средствам массовой информации с добавками, смысл СМИ с химиотерапевтические или моноклональные антитела в желаемой концентрации. Добавление цисплатина в концентрациях мкм 2,5/5/10 или 5-fluoruracil (5-фу) на 30 мкм.
    Примечание: Для высокой пропускной способности экспериментов или большой группы размеров/большое количество групп, один можно использовать автоматического дозирования робот, как мы далее устанавливают в экспериментах.
  3. Кроме того излучают пластины культуры клеток с сфероидов на 2 гр, с помощью подходящего излучения.
    Предупреждение: Уважение института протоколы относительно предотвращения вредного облучения работников. Работать только с назначенными и обученных техников по руководящие принципы радиационной защиты. При желании добавьте химиотерапевтические как описано до 4.2. После этого.
  4. Инкубируйте клетки для 24 ч в условиях ранее описанных культуры (37 ° C, шаг 3.2).
  5. После инкубации продолжить культуры клеток для по крайней мере 6 дней с изменениями средств массовой информации каждый день.

5. Оценка сфероида размер и масштабы для считывания Assay пролиферации

  1. Измерьте размер сфероида по площади после цифровой фото документации на 6 день (10 день, день 16) с помощью графического программного обеспечения (параметр 1).
  2. После центрифугирования в 520 g x 2,5 мин пластины удалите супернатант. Мыть ячейки с достаточным количеством 1 x PBS и центрифуги, пластину снова как описано, а затем удалить супернатант (PBS).
  3. Добавьте 100 мкл ферментативные клеток отряд решения каждого флакона позволяют сфероидов распустить. Инкубировать пластину для 8 минут при 37 ° C.
  4. Проверка успешного растворения сфероида под микроскопом. 100 мкл DMEM. Центрифуга пластину на 520 x g 2,5 мин удалить супернатант и приостановить клетки в 100 мкл DMEM.
  5. Выполните assay коммерчески доступных колориметрические распространения, в примере WST-8 assay на каждом флаконе согласно инструкции производителя25. Зачитал assay в читалку иммуноферментного анализа (ИФА) (параметр 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы были в состоянии сформировать можно воспроизвести сфероидов от одноклеточного суспензий, сначала из различных клеточных линий, включая проприетарные PiCa клеток линии, позднее от первичных человеческих раковых клеток, производным от свежих опухоли биопсий, как описано в Хагеманн et al . 26. Мы оценивали два установленных методов для генерации сфероида; две так называемые висит падение (HD) метод и метод ультра-низкой адгезией (Ула), причем последний оди...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы смогли установить протокол для создания воспроизводимых сфероидов из клеточных суспензий, для обеих линий клетки и в предварительных экспериментов, клетки первичной опухоли человека. Мы сначала оценить два ранее описанных методов и определили Ула метод, где используются культуры пластин с ультра-низким уровнем сцепления поверхности, чтобы быть безопаснее и надежнее для создания единого трехмерного сфероидов. Объединив две отдельные методы для пробирного считывания (размер/области и клеток жизнеспособности), этот смеша...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект финансировался Грант из университета Мюнхена (FöFoLe проекта no.: 789-781).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Dulbeccos модифицированная среда Eagles (DMEM)Biochrom, Берлин, ГерманияF 0425
Фетальная бычья сывороткаGibco Life Technologies, Пейсли, Великобритания10500-064
пенициллин/стрептомицинBiochrom, Берлин, ГерманияA2212
пируват натрияBiochrom, Берлин, ГерманияL0473
заменимые аминокислотыBiochrom, Берлин, ГерманияK0293
L-глютаминBiochrom, Берлин, ГерманияK0293
LiberaseRoche Life Sciences, Базель, Швейцария5401127001
GravityPLUS 3D платформа для культуры и анализаInSphero, Шлирен, ШвейцарияPB-CS 06-001
Пластина GravityTRAPInSphero, Шлирен, ШвейцарияPB-CS-01-001
Культуральные планшеты со сверхнизким прикреплением (ULA)Corning, Corning, Нью-Йорк, США4520
среда для роста эпителиальных клеток дыхательных путейPromocell, Гейдельберг, ГерманияC-21060
амфотерицин BBiochrom, Берлин, ГерманияA 2612
среда для роста эпителиальных клеток дыхательных путей смесь для ростаPromocell, Гейдельберг, ГерманияC39165
Тест WST-8Promocell, Гейдельберг, ГерманияPC PK-CA705-CK04
Кератиноцит SFMedium + L-глутамин 500 млInvitrogen#17005-034
Экстракт гипофиза крупного рогатого скота (BPE), 25 мгInvitrogen#37000015
Рекомбинантный фактор роста эпителия человека 2,5 &; gInvitrogen#37000015
DMEM High GlucoseInvitrogen#21068-028
Пенициллин стрептомицин 10000 ед/мл Пенициллин / 10000&микро; г/мл стрептомицинаInvitrogen#15140-122
F12 Смесь питательных веществInvitrogen#21765-029
Глутамакс (200 мМ L-аланил-L-глутамин-дипептид в NaCl)Invitrogen#35050087
HBSS (Ca, Mg)Life Technologies#14025-092(без фенола красного)
1x TrypLE Expres EnzymeInvitrogen#12604-013(без фенола красного)
Аккутаза (раствор для ферментативной отслойки клеток)Инновационные клеточные технологииCat# AT104
70 &m; m Клеточный фильтр FalconBD Biosciences, США#352350

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
  2. Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6(2012).
  3. Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
  4. Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
  5. Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
  6. Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
  7. Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
  8. Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
  9. Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
  10. Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
  11. Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
  12. Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
  13. Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
  14. Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
  15. Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
  16. Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540(2013).
  17. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
  18. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  19. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
  20. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  21. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  22. Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
  23. Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
  24. Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
  25. Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527(2012).
  26. Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
  27. Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245(2010).
  28. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  29. Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
  30. Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи