Методическая статья

Строительство синтетических Фаговые отображается ВСБ библиотеки с учетом разнообразия

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57357

⸱

1 мая 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Antibody Engineering, Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University, 2Banting and Best Department of Medical Research, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 3Department of Molecular Genetics, Terrence Donnelly Center for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает подробную процедуру на строительство библиотеки отображается Фаговые синтетических антитела с учетом разнообразия. Синтетические антитела имеют широкое применение от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии.

Аннотация

Ежегодно растет спрос на моноклональных антител (mAbs) в фундаментальных исследований и медицины. Гибридомной технологии был доминирующим методом развития МАБ начиная со своего первого доклада в 1975 году. Как альтернативная технология ФАГ методы отображения для развития МАБ становятся все более привлекательными, поскольку Humira, первым антителом, фаг производные и один из бестселлеров mAbs, был одобрен для клинического лечения ревматоидного артрита в 2002 году. Как не животного на основе технологии развития МАБ, фаг дисплей обходит иммуногенность антигена, гуманизации и животных обслуживания, которые требуются от традиционных гибридомной технологии на основе антител развития. В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Этот протокол состоит из: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча урацил содержащих одноцепочечной ДНК (дю ssDNA); 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белка на основе A/Л энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия.

Введение

mAbs имеют широкое применение, начиная от фундаментальных исследований для диагностики заболеваний и терапии. Начиная с 2016 года более чем 60 mAbs были одобрены Соединенных Штатов продовольственной и наркотиков администрации (АППМ) для клинического лечения аутоиммунных заболеваний, рака и инфекционных заболеваний в1,2.

В 1975 году Колер и Мильштейн сообщили, что техника для непрерывного поколения антител одного клоновых специфичности от клеточного источника называют «hybridomas» и этот метод впоследствии стать краеугольным камнем в медицине и промышленности3 ,4. Поколение mAbs этот метод требует различные шаги, в том числе производство антигена, мыши иммунизации, извлечения лимфоцитов B, слияния клеток B с миеломой клетки сформировать Бессмертный hybridoma клетки, клон выбор и для терапевтического применения, Гуманизация требуется избежать человеческих антител анти мыши (HAMA)4,5. Однако для этой технологии, антигены, включая токсины, патогенов и высоко сохраненных белков являются относительно неэффективными в провоцировании в vivo иммунный ответ для mAb производства5.

В 1978 году Хатчинсон et al. сообщили об использовании олигонуклеотида для прямого мутагенеза остатков в одноцепочечной бактериофага вирус6. В 1985 году Смит сообщила, что иностранные гена фрагменты могут сливается в рамке с гене шифруя протеин пальто Фаговые III и таким образом могут быть отображены на поверхности Фаговые без ущерба для его инфективности7. Эти новаторские работы заложили фундамент для последующего строительства библиотек ФАГ отображается антител в иммунной, наивно, и синтетические формы с форматами переменной фрагмент одной цепи (scFv) и антиген связывая фрагмент (ФАБ) для терапевтических МАБ развития8,9. С технической точки зрения ФАГ дисплей на основе антител развития предлагает дополнительный подход к развитию на основе гибридомной МАБ, которые могут помочь обойти ограничения, которые могут представлять некоторые антигены и гуманизации процесса гибридомной полученные антител часто требуют5. По состоянию на 2016 6 Фаговые дисплей производные mAbs были одобрены на рынке, включая Humira, один из самых успешных mAbs, используется для лечения ревматоидного артрита, и многие кандидаты Фаговые отображения полученных антител в настоящее время находятся на различных стадиях клинических расследование10.

Для иммунной и наивно Фаговые антитела библиотек, разнообразие взаимодополняемости определение регионов (CDR) в легких и тяжелых цепи является производным от природных иммунной репертуар (т.е., от клетки B). В противоположность этому разнообразие CDR-файлов в библиотеках антитела синтетических Фаговые полностью искусственный. Синтетические подходы к построению библиотеки обеспечивают точный контроль над дизайн последовательности разнообразия и предлагают возможности для механистический исследования структуры антител и функционировать11,12. Кроме того рамки для синтетических библиотек может быть оптимизирована до строительства библиотеки для облегчения вниз по течению, крупномасштабного промышленного развития11,12.

В 1985 году, Канкел сообщили одноцепочечной ДНК (ssDNA) на основе шаблона мутагенеза подход эффективно представить сайт направленных мутаций в бактериофага M1313. Этот подход был впоследствии широко используется для строительства ФАГ отображается библиотек. Химически синтезированные олигонуклеотиды ДНК предназначена внести разнообразие в Fab CDR включены в phagemid с шаблоном позвоночника антитела. В этом процессе phagemid выражается в урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) и олигонуклеотиды отожженная на CDR и продлил синтезировать двуцепочечной ДНК (dsDNA) в присутствии Т7 ДНК-полимеразы и T4 ДНК лигаза. Наконец сгенерированный ds ДНК может быть введено в Escherichia coli электропорации.

Высокое разнообразие, фаг отображается библиотека строительство, электропорация высоковольтные двухкомпонентная смесь электро компетентных клеток и ковалентно закрытой круговой dsDNA (CCC-dsDNA) должен быть подготовлен тщательно. Сидху et al. изменения подготовки электро компетентных клеток и ДНК от традиционных методов и значительно улучшенная библиотека разнообразия14.

В этом протоколе мы описываем метод для построения синтетических ФАГ отображается Fab библиотек с различий можно получить с одного электропорации 1010 9-10. Рисунок 1 показывает обзор строительства библиотеки, в том числе: 1) электро компетентных клеток высокой эффективности подготовки; 2) добыча dU-ssDNA; 3) метод Канкел основе олигонуклеотида Направленный мутагенез; 4) электропорации и расчет размера библиотеки; 5) белок A/Л-на основе ELISA для складывания и функциональное разнообразие оценки; и 6) анализ последовательностей ДНК разнообразия. Штаммов, реагенты и оборудование, перечислены в таблице материала. Таблица 1 показывает установки реагента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Стерильные советы фильтр должен использоваться во всем при работе с Фаговые чтобы избежать загрязнения пипеткой пистолет и окрестностях. Асептические области или капот должны использоваться при обработке с бактериями и ФАГ экспериментов. Фаговые эксперимент области должен быть очищен с помощью 2% лаурилсульфат натрия (SDS) следуют на 70% спирте во избежание загрязнения ФАГ. Для изготовления серийных разведений в настоящем Протоколе, должны использоваться новые советы для каждого разведения.

1. Подготовка электро компетентных клеток кишечной палочки SS320

  1. Предварительно теплой LB/tet агар плита (подготовлены и хранятся на 4 ° C для менее чем 1 - неделя старый) при 37 ° C инкубатор для 1 ч. использовать стерильные прививка цикла или стерильной наконечник, чтобы полоска из глицерина запас E. coli SS320 клеток на подогретым LB/tet агар пластину в Зиг заг direc Тион нежно вдоль поверхности пластины. Инкубируйте пластину на инкубатора 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  2. Следующий день, используйте стерильные прививка петлёй или стерильной подсказка выбрать хорошо разделенных одной колонии вдоль линии Зиг заг и инокуляции в 10 мл 2YT/tet среды в 50-мл круглым дном трубки окунать цикла в средних и помешивая кратко.
  3. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для около 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала). Монитор ОД600 в 2 ч. В этот период, предварительно теплой 5 фунтов/tet агар плит (подготовлены и хранятся на 4 ° C на менее чем 1 - неделя старый) в 37 ° C инкубатор для по крайней мере 1 час.
  4. Добавить 20 мкл M13KO7 вспомогательный Фаговые из лаборатории запасов с титр около 1 x 1013 колонии, формировать группы (cfu) / мл в 180 мкл стерильных 1 X PBS в газобетона 1.5 мл пробирок подготовить 10 десятикратный серийных разведений.
  5. Аликвота 4 мл газобетона и жидких 2YT Топ агар в 5 X 14 мл раунд нижней трубы, маркировать каждую пробирку с одной разбавления от пятого до девятого десятикратный разбавления, соответственно и инкубировать в инкубаторе 65 ° C для поддержания 2YT Топ агар в жидком состоянии.
  6. Смесь 500 мкл журнала фазы E. coli SS320 клеток в M13KO7 трубу разрежения (выбрать пятый десятикратный разбавления до девятого десятикратный разрежения) и инкубировать в инкубаторе 37 ° C за 5-10 мин.
  7. Во время инкубации шаг 1.6 передачи 2YT Топ агар с шагом 1,5 до комнатной температуры (RT), чтобы охладить на около 5 мин до 42 ° C. Использовать внутреннюю запястье для проверки температуры 2YT Топ агар; Она должна оставаться в жидком состоянии. Передачи каждой разбавления смеси с шагом 1,5 для каждого соответствующего 2YT Топ агар трубки. Завинтите крышку пробирки и перемешать, повернув вниз несколько раз осторожно и кратко избежать пузырь поколения.
  8. Осторожно налить каждой смеси вдоль края предварительно теплой плиты агара LB/tet (от шага 1.3) и наклонной пластины слегка, чтобы полностью и равномерно Залейте смесь пластину избегая введения пузыри. Держите пластины на RT около 5-10 мин, чтобы затвердеть Топ агар в пределах каждой пластины и инкубировать 2YT Топ агар пластины при 37 ° C ночь для около 15-18 h.
  9. Выбрать пластину разбавления после ночи роста от шага 1.8 с около 100-200 среднего размера, один, хорошо разделенных таблички для прививки доска. Использование одной стороны провести пластину агар против источника света и с другой стороны держать пипетку пистолет загружен с наконечником долго стерильной пипеткой с вертикально ножом в топ агар и собирать один и хорошо разделенных зубного налета.
    1. Наклонной наконечник пипетки слегка отделить Топ агар с номерным знаком. Пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы выбить агар с налета в 14-мл круглым дном культуры трубу предварительно загружены с 1 мл среды 2YT/Кан/tet (см. таблицу 1).
    2. Повторите эту процедуру, чтобы выбрать 3-5 бляшек в общей сложности. Цель выбора несколько бляшек — для обеспечения успешной прививки, как доска может быть слабый и относительно небольшой по сравнению с колонии бактерий. Растут бляшки за 8 ч при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
  10. Перенесите трубку выращивания культуры в 50 мл 2YT/Кан/tet среды в недоумение флакон 250 мл. Растут при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 12 ч.
  11. Прививать три 2-L озадачен флаконы содержащие 900 мл superbroth/tet/Кан среды с 5 мл на ночь культуры. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для 6-7 ч до600 ОД около 0,6-0,8.
  12. Холод три колбы бактериальной культуры в ледяной бане на 5 мин с нежным постоянно крутятся вручную. Следующие шаги должны быть сделано в холодной комнате, на льду, с prechilled решения и оборудование.
  13. Использование оптической плотности ткани полотенце для просушки внешнее стекло каждого колбу; одной рукой наклонной газобетона центрифуге 1-Л бутылку на скамейке и с другой стороны залить средство мягко от каждого колбу в каждой бутылке центрифуги.
  14. Спина на 5000 × g и 4 ° C на 10 минут, чтобы Пелле бактерии.
  15. После центрифугирования осторожно декантируют супернатант в стакан газобетона отходов 5-L.
  16. Заполните каждый флакон со 100 мл стерильной фильтрации 1,0 мм HEPES, рН 7,4 и добавить панель газобетона магнитные переполох в каждой бутылке для помощи в Пелле ресуспендирования в 200 об/мин. Вихрем и выбить всю гранулы от стены бутылку каждые несколько минут во время магнитная перемешивании. После того, как гранулы растворяется, заполните каждую бутылку с еще 400 мл стерильной фильтрации 1,0 мм HEPES, рН 7,4.
  17. Центрифуга на 5000 × g и 4 ° C на 10 мин Decant супернатанта, сохраняя перемешать бар в бутылке.
  18. Повторите шаги 1.16 в 1.17 один раз.
  19. Ресуспензируйте каждой гранулы в 500 мл с помощью панели перемешать стерильной фильтрации, 10% сверхчистого глицерина. Вихрем и выбить всю гранулы от стены бутылку каждые несколько минут во время магнитная перемешивании.
  20. Центрифуга и сцеживаться как шаг 1.17. Повторите шаг 1.19 один раз. Для удаления панели перемешать используйте длинные руки газобетона щипцы.
  21. Центрифуга на 5000 × g и 4 ° C на 15 мин Decant супернатант и удалите все оставшиеся следы супернатант с каждой бутылки центрифуги с пипеткой.
  22. Добавление одной бутылки 3,0 мл 10% сверхчистого глицерина и нежно ресуспензируйте гранулы, закупорить. Передать следующей бутылке подвеска и повторять до тех пор, пока все гранулы высокомобильна и объединены в одном флаконе. Примерно в 6 мл высококонцентрированных клеток, полученные с титр около 3 x 1011 кое/мл.
  23. Предварительно охладите газобетона microcentrifuge 1,5 мл трубки и ящик для хранения одной 96-луночных трубы без разделителей в-80 ° C для по крайней мере 1 час перед этот шаг. Переведите предварительно охлажденные microcentrifuge трубы холодной комнате на льду до закупорить аликвоты гранул суспензии клеток. Использование пипетки для аликвота 350 мкл суспензии клеток в каждую пробирку microcentrifuge 1,5 мл.
  24. Перенесите аликвоты в контейнер box пены заполнены с жидким азотом для flash замораживания (3-5 мин).
    1. Транспорт в коробе с жидким азотом в морозильной камере-80 ° C (см. шаг 1,23).
    2. Удалить поле хранения пробки microcentrifuge 1,5 мл из морозильной камеры-80 ° C (см. шаг 1.23) и поставить на льду.
    3. Быстро используйте металлические сетки сита аликвоты из жидкого азота и поместить их в поле хранилище трубки. Хранить при температуре-80 ° C.
      Предупреждение: Жидкий азот может вызвать ожоги, и необходимо позаботиться для защиты безопасности. Используйте phagemid Fab позвоночника для проверки эффективности подготовленных электро компетентных клеток (Fab позвоночника phagemid запас должен быть в ультрачистая вода (MilliQ) на 400 нг/мкл). Размораживание 1 мкг phagemid Fab позвоночника в 10 мкл ультрачистая вода и 350 мкл Алиготе электро компетентных SS320 на льду и prechill кювет электропорации 0,2 cm разрыв на льду.
  25. Добавить электро компетентных клеток SS320 350 мкл 10 мкл ДНК после оттаивания и перемешать, закупорить несколько раз при сохранении смеси на льду. Избегайте введения пузыри.
  26. Предварительно теплой 15 мл SOC среды в 50-мл пробирку в ванну воды 37 ° C для по крайней мере 30 минут до электропорации. Передача смеси 360 мкл кювет и выполнять электропорации следуя инструкциям производителя.
  27. Сразу же спасти клетки после электропорация, добавив 1 мл подогретым SOC средних (от шаг 1.27) и закупорить. Передавать средства из кювета 125 мл флакон предварительно загружены с 5 мл подогретым соц.
  28. Промойте кювет дважды, каждый раз с 1 мл раствора подогретым SOC среднего и передать 125 мл флакон среднего (см. шаг 1.27). Добавьте подогретым SOC среднего окончательный объем до 125 мл флакон 10 мл.
  29. Инкубируйте 10-мл клеточной культуры для 30 минут при 37 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  30. Сделайте серийных разведений определить эффективность трансфекции и M13KO7 до инфекции.
    1. Используйте многоканальные пипетки для добавления 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одного столбца 96-микрорезервуар плиты.
    2. Сделать 8 десятикратно серийный разведения: передача 20 мкл культуры из шага 1.29 к первой скважины пластины, микс, закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Пластина 10 мкл каждого последовательного разрежения на LB/карбюратора, LB/Кан и LB/tet пластины в двух экземплярах.
    4. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Формула расчета эффективности: предполагается, что M — средняя колонии номер отсчитывается от разбавленных раза 10N (N — от 1-8). E. coli SS320 электро компетентных клеток эффективность трансфекции phagemid Fab позвоночника от LB/карбюратора пластины равноN + 3 М X 10 кое/мкг. M13KO7 предварительно инфекции оценивается от соотношения колоний в LB/Кан и LB/tet. Процент клеток E. coli SS320 компетентным transfected с phagemid Fab позвоночника оценивается от соотношения колоний в LB/карбюратора и LB/Кан.

2. Подготовка урацил содержащих ssDNA (дю ssDNA) из шаблона Phagemid

Примечание: A ранее сообщалось, что ВСБ позвоночника phagemid был использован как шаблон для dU-ssDNA подготовка15. Архитектура phagemid Fab позвоночника показана на рисунке 2. Набор спин плазмида (QIAprep спина M13) используется для извлечения dU-ssDNA с незначительными изменениями.

  1. Предварительно теплой LB/cmp пластины (подготовлены и хранятся на 4 ° C на менее чем 1 - неделя старый) в инкубаторе 37 ° C за 1 ч. полоска из глицерина запас E. coli CJ236 клеток (или другой штамм dut−/ung−) с стерильных петли или советы на подогретым плиту LB/cmp. Инкубируйте пластины при 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  2. Выберите единую колонию с стерильных наконечником и инокуляции в 2 мл 2YT/cmp среды в 14-мл полипропиленовые раунд снизу трубку.
  3. Инкубируйте в среду при 37 ° C с встряхивания на 200 rpm для 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала).
  4. Добавить 5-10 мкл Фаговые Fab позвоночника шаблона в культуру и инкубировать при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин за 30 минут, чтобы позволить Фаговые инфекции.
  5. После инкубации используйте стерильные оконечности полоска из 10 мкл культуры на подогретым плиту LB/карбюратора при 37 ° C. Инкубируйте при 37 ° C ночь для около 12-15 h.
  6. Выберите единую колонию E. coli CJ236 phagemid содержащий Fab позвоночника для прививок закваски по 3 мл 2YT/карбюратора/cmp в 14-мл полипропиленовые раунд снизу трубку и расти при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 12 ч.
  7. Прививать 0,3 мл закваски в 30 мл 2YT/карбюратора/cmp в недоумение бутылка 250 мл.
  8. Инкубируйте культуре клетки при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm для 3-4 ч до од600 на около 0,4-0,8 (фаза роста журнала).
  9. Добавить M13KO7 (Лаборатория штока, титр приблизительно 1 x 1013 кое/мл) в культуру от шаг 2.8 с разносторонностью инфекции (МВД) примерно 10 и окончательный титр M13KO7 является 1 x 1010 кое/мл.
  10. Инкубируйте на 200 об/мин, 37 ° C в течение 1 ч.
  11. Пелле культуры центрифугированием в 50 мл раунд снизу, на 5000 × g и 25 ° C в течение 20 мин.
  12. Декант супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 30 мл свежего 2YT/карбюратора/Кан/уридина. Перенесите ресуспендирования в новой озадачен бутылка 250 мл.
  13. Инкубируйте на 200 об/мин и 25 ° C для 22-24 ч.
  14. Передача культуры из шага 2.13 в 50-мл раунд снизу трубку и центрифуги культуры на 12000 g × 20 мин отделить Фаговые супернатанта от бактериальных клеток Пелле. Передача Фаговые супернатант в новый раунд снизу трубку 50 мл и добавить 1/5 окончательный объем раствора ПЭГ/NaCl ускорять ФАГ. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду для 30 минут, чтобы осадить Фаговые частицы.
  15. Оставшиеся супернатант аспирационная центрифуги на 12 000 × g и 4 ° C на 30 мин Decant супернатант и центрифуги на 4000 × g и 4 ° C на 2 мин.
  16. Ресуспензируйте Фаговые Пелле в 2 мл стерильной фильтрации 1 X PBS и передачи microcentrifuge 1,5 мл трубки. Центрифуга на 12000 g × 5 мин в benchtop microcentrifuge удалить любые оставшиеся бактериальных мусора и передать новые трубы 1,5 мл microcentrifuge супернатанта ФАГ и хранить при 4 ° C.
  17. Проверка эффективности включения урацила в E. coli CJ236 через бок о бок сравнение с E. coli SS320.
    1. Добавьте 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одной строки 96-луночных плиты.
    2. Сделать десять 10 серийный разведения: передачи 20 мкл Фаговые супернатанта первой скважины пластины, смешивать, закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Добавить 10 мкл Фаговые из восьми последних серийных разведений заразить 90 мкл CJ236 E. coli и E. coli SS320 в фазе журнала (OD600 = 0,4-0,8). Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут с нежным встряхивания.
    4. Пластина 10 мкл от последовательного растворения каждой инфекции E. coli CJ236 и SS320 E. coli на тарелках 2YT Carb в двух экземплярах.
    5. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    6. Формула расчета титр: предполагается, что M — средняя колонии номер отсчитывается от разбавленных раза 10N (N — от 1-10). Титр кишечной палочки CJ236 или E. coli SS320 равноN + 2 M X 10 кое/мл. Оцените эффективность урацила инкорпорации от соотношения титр кишечной палочки CJ236 и SS320 E. coli .
  18. Добавить 1/100 объем буфера осадков Фаговые MP в Фаговые супернатант в 1,5 мл microcentrifuge трубы и поверните вниз осторожно смешать несколько раз. Инкубируйте на RT для по крайней мере 2 мин Фаговые частицы осаждаются из питательной среды, и таким образом, облачно раствор должен быть видимым в данный момент.
  19. Применить образец из шага 2.18 плазмида спин столбцу (например, QIAprep) в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Связывающая способность столбца один спин на ssDNA может достигать по крайней мере 10 мкг. Центрифуга на 6000 × g и 25 ° C за 30 s в benchtop microcentrifuge. Выбросите проточный, который находится в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Фаговые частицы остаются связанными к матрице столбца на данном этапе.
  20. Добавьте в столбец 0,7 мл UT-MLB Фаговые лизис и привязки буфера (см. обсуждение) и Инкубируйте на RT для по крайней мере 1 мин.  Центрифуга на 6000 x g и 25 ° C для 30 s и отмены потока через.
  21. Добавить еще один 0,7 мл буфера UT-MLB и Инкубируйте на RT для по крайней мере 1 мин.
  22. Центрифуга на 6000 × g для 30 s. отклонения потока через. На данном этапе протеин пальто Фаговые отделяется от dU-ssDNA, которой остается привязанным к матрице столбца.
  23. Добавление 0,7 мл мыть содержащие этанола буфера PE следуя инструкциям производителя. Центрифуга на 6000 g × 30 s и отмены потока через.
  24. Повторите шаг 2.23, затем еще раз центрифуги на 6000 g × 30 s, чтобы удалить остаточные буфера PE.
  25. Передать новой трубки 1,5 мл microcentrifuge столбца и добавьте 100 мкл буфера EB (10 мм Tris· CL, рН 8,5) к центру колонки мембраны.
  26. Инкубируйте на RT 10 мин и центрифуги на 6000 × г за 1 мин до элюировать dU-ssDNA. Приблизительно 1,5-2,5 мкг/мл dU ssDNA культуры могут быть получены.
  27. Анализировать eluted дна electrophoresing 1 мкл на агарозы 1%, TAE гель. ДНК должен появиться как преимущественно однодиапазонный с не мазать.
  28. Определение концентрации ДНК путем измерения оптической плотности на nanodrop спектрофотометром в 260 Нм (260 = 1.0 для 33 нг/мкл ssDNA). Типичные dU-ssDNA концентрации находятся в пределах 200-500 нг/мкл.

3. Канкел метод на основе олигонуклеотида Направленный мутагенез

Примечания: Это целесообразно проводить мелкомасштабные реакций до полной шкалы реакций для обеспечения качества мутагенных олигонуклеотида и реакции компонентов. Мультфильм Канкел метода на основе олигонуклеотида направлены мутагенеза показано на рисунке 3. В CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3 регионов вводятся различные аминокислоты разнообразности с IMGT нумерация номенклатуры16 (Таблица 2). Теоретические аминокислоты разнообразие каждой CDR, Общая теоретическая аминокислоты разнообразия и последовательности олигонуклеотида, перечислены в таблице 2.

  1. Фосфорилирование олигонуклеотида с T4 полинуклеотид киназы
    1. Объединить 0,6 мкг мутагенных олигонуклеотиды, призванных мутировать одного CDR, с 2 мкл 10 X буфер ТМ, 2 мкл 10 мм АТФ и 1 мкл 100 мм DTT. Добавьте сверхчистого H2O общего объема 18 мкл в 1,5 мл. Для строительства библиотеки 4 фосфорилирование отдельных и параллельных реакций настроены соответствующий CDRH1, CDRH2, CDRH3 и CDRL3, соответственно.
    2. Добавить 20 U (2 uL) T4 полинуклеотид киназы каждой трубки и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C (реакция 1 в таблице 3). Использование немедленно для отжига.
  2. Отжиг олигонуклеотиды в шаблон
    1. До 20 мкг dU-ssDNA шаблона добавьте 25 мкл 10 X ТМ буфера, 20 мкл каждого решения фосфорилированных олигонуклеотида, и особочистых H2O конечный объем 250 мкл в 0,5 мл. Хорошо перемешайте и перевести на 0.20 мл ПЦР пробирок (по 50 мкл) в реакции 2 в таблице 3. Эти количества ДНК обеспечивают молярное соотношение 3:1 между олигонуклеотида и шаблон, предполагая, что длина олигонуклеотида и шаблон составляет 1: 100.
    2. Инкубировать реакции в машину ПЦР на 90 ° C на 3 мин, 50 ° C на 3 мин и 20 ° C за 5 мин.
  3. Ферментативного синтеза CCC-dsDNA
    1. В 250 мкл отожженная олигонуклеотида/шаблон смесь добавьте 10 мкл 10 мм АТФ, 10 мкл dNTP смеси 25 мм, 15 мкл, 100 мм DTT, 30 Вайсс T4 единиц ДНК лигаза и 30 U Т7 ДНК-полимеразы как реакция 3 в таблице 3.
    2. Инкубируйте реакции в 1,5 мл при 20 ° C на ночь.
    3. Вымойте и сконцентрировать синтезированных CCC-dsDNA в 0,5 мл центробежного фильтра устройства с мембраной размер поры 30 кДа на RT.
      1. Передать ночи реакционную смесь на устройство фильтра и добавьте сверхчистого H2O 400 мкл окончательный объем. Спина на 14 000 × g 10 мин; объем составляет менее 50 мкл.
      2. Отменить через поток, 400 мкл сверхчистого H2O в фильтр и спина на 14 000 × g за 10 мин.
      3. Повторите шаг 3.3.3.2 еще раз.
      4. Переверните фильтр в чистой microcentrifuge трубки для восстановления CCC-dsDNA. Спина на 1000 g × 2 мин; восстановленный том обычно составляет около 20-40 мкл. Восстановленные CCC-dsDNA могут быть использованы непосредственно для электропорации кишечной палочки или заморожены при-20 ° C для последующего использования. Обычно 20-40 мкг CCC-ДНК могут быть получены.
    4. Electrophorese 1.0 мкл eluted реакция продукта наряду с дю ssDNA шаблон для визуализации результатов реакции.

4. электропорации и расчет размера библиотеки

  1. Холод очищенный CCC-dsDNA (20 мкг в максимальный объем 50 мкл) в пробки microcentrifuge 1,5 мл и разрыв 0,2 см кювета электропорации на льду.
  2. Предварительно теплой 20 мл SOC СМИ в 50-мл полипропиленовые конические пластиковых пробирок на водяной бане 37 ° C по меньшей мере 30 мин.
  3. Оттепель 350 мкл Алиготе электро сведущее Escherichia coli SS320 на льду. Добавьте клетки ДНК и перемешать тщательно, закупорить несколько раз. Избегайте введения пузыри.
  4. Передача смеси кювет и выполнять электропорации следуя инструкциям производителя. Например когда используется система электропорации BTX ECM-630, соответствующие параметры являются прочность поля 2.5 кв, 125 Ω сопротивления и 50 МКФ емкости.
  5. Сразу же спасти electroporated клетки, добавив 1 мл подогретым SOC средних и передачи в 17 мл SOC среды в 125 мл флакон. Промойте кювет дважды с 1 мл SOC средних и передачи же колбу (окончательный объем составляет 20 мл).
  6. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C с встряхивания на 200 об/мин.
  7. Определите эффективность электропорации.
    1. Добавьте 180 мкл 2YT СМИ в каждой скважине одного столбца 96-микрорезервуар плиты.
    2. Сделать 8 десять раз серийный разведения: передачи 20 мкл 20 мл культуры первой скважины пластины, смешать с закупорить и передать следующий 20 мкл смеси хорошо. Повторите этот шаг до конца последовательным разрежения.
    3. Пластина 10 мкл каждого из серийных разведений на одну плиту LB/карбюратора в двух экземплярах. Пластина 100 мкл, оставшиеся от каждого из серийных разведений на отдельных пластин LB/карбюратора для колонии Фото кросс проверить. Эти пластины также предоставит единый клонов для анализа ELISA и последовательности (см. раздел 5).
    4. Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    5. Подсчет колоний от 10 мкл дубликатов на пластину LB/карбюратора. Предположим, что M является средняя колонии, число подсчитанных на 10N раз LB/карбюратора пластины (N-1-8). Общая библиотека размер равен 2 М X 10N + 3 колоний.
  8. Алиготе культуры от шага 4.6 одинаково в два 2-L озадачен колбы, каждый содержащий 500 мл 2YT/карбюратора/Кан среды для поколения библиотека ФАГ.
  9. Инкубируйте при 37 ° C при встряхивании в 200 rpm на ночь для около 16 h.
  10. Передача культуры двух бутылки 1-L газобетона центрифуги и центрифуги для 30 мин при 12000 х g при 4 ° C.
  11. Супернатант передать два новых газобетона центрифуге 1-Л бутылок и добавить 1/5 окончательный объем раствора ПЭГ/NaCl ускорять ФАГ. Инкубируйте на льду за 30 мин.
  12. Центрифуги для 30 мин при 12000 х g и 4 ° C. Тщательно сцеживаться супернатант и не мешать Пелле ФАГ. Спиновые 1 мин на 4000 x g и удалить оставшиеся супернатант с пипеткой.
  13. Ресуспензируйте Фаговые лепешка с 20 мл стерильной фильтрации 1 ПБС буфере и передачу новой 50 мл трубки.
  14. Пелле нерастворимый центрифугированием 5 мин на 12 000 × g и 4 ° C. Супернатант передать новый 50-мл.
  15. Измерить концентрацию Фаговые спектрофотометр (OD268 = 1.0 для решения 5 X 1012 Фаговые/мл).
  16. Отрегулируйте Фаговые концентрации до 5 X 1012 Фаговые/мл в 1 X PBS с 10% сверхчистого глицерина.
  17. Аликвота 1 мл раствора ФАГ в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Используйте библиотеки немедленно для сдвига или хранить при температуре-80 ° C.

5. качество оценки белок А / Л прямой привязки ELISA пробирного и последовательности

  1. Случайным образом выберите 96 одного колоний на табличке LB/карбюратор от шага 4.7.3 в 96-глубокие хорошо культуры пластины, содержащий 800 мкл 2YT carb в каждой скважине. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин до од600 = 0,4-0,8.
  2. Добавить 100 мкл M13KO7 (1 Х 1011 кое/мл) для каждой скважины 96-глубокой хорошо культуры пластины с многоканальные пипетки. Проинкубируйте при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин на 1 ч.
  3. Добавьте 100 мкл 2YT содержащие 10 X концентрации канамицин (500 мкг/мл) для каждой скважины с многоканальные пипетки. Инкубируйте на ночь при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин.
  4. Растворите белка L 1 мкг/мл в 1 X PBS. Слой 3/4 скважин в 384-Ну высокий связывания белков полистирольные пластины с 30 мкл/хорошо белка Л раствора. Инкубируйте на ночь при 4 ° C.
  5. Отказаться от ночи раствор для нанесения покрытия белка L от шага 5.4. Добавьте 50 мкл M-PBST (блокирующие решение) для всех скважин в 384-Ну высокий связывания белков полистирольные пластины с многоканальные пипетки. Инкубировать пластины на Гонав шейкер для 1 h на RT.
  6. Спин вниз ночь культуры от шага 5.3 в пластине глубоко 96-луночных культуры на 3000 x g 10 мин при 4 ° C. Фаговые находится в надосадке.
  7. Отмена блокировки решение от шага 5.5. Добавьте 15 мкл M-PBST и 15 мкл каждого Фаговые супернатанта (шаг 5.6) 3 L покрытием скважин белка в трех экземплярах и 1-покрытием хорошо как отрицательный контроль с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте на RT 1 h встряхивании в 200 об/мин.
  8. Отменить решение ФАГ. Промойте пластины 6 раз с 80 мкл PBST шайбой автоматизированной пластины.
  9. Добавьте 15 мкл M-PBST и 15 мкл белок А-ПХ (1:1, 500 разводят в 1 X PBS) для каждой скважины с многоканальные пипетки и Инкубируйте на RT 1 h встряхивании в приблизительно 200 об/мин.
  10. Слейте раствор белка A-ПХ/M-PBST. Вымойте тарелка 6 раз с 80 мкл PBST.
  11. Добавление подложки (30 мкл/хорошо) ТМБ с многоканальные пипетки и проинкубируйте 2-3 мин до тех пор, пока цвет развивается. Остановите реакции с 1,0 М H3PO4 (30 мкл/хорошо).
  12. Читайте пластины спектрофотометрически на 450 Нм. Позитивные клоны определяются как те, которые демонстрируют среднее соотношение ОД450 поглощения белков L скважин также больше, чем 3.0 М-PBST.
  13. В 96-глубокий, заразить 50 мкл SS320 в 2YT/tet на этапе журнала с 5 мкл же фага, используемых для ELISA (шаг 5.6) за 30 мин на RT.
  14. Добавьте 950 мкл 2YT carb в 96-глубокие хорошо из шага 5.13 и инкубировать на ночь при 37 ° C с тряску при 1000 об/мин.
  15. Экстракт phagemid ДНК мини-prep набор экстракции ДНК. Используйте вверх по течению грунтовки ВЛ (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') и VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') для анализа последовательностей для оценки разнообразия последовательности библиотеки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После схема строительство Fab библиотеки (см. рис. 1), мы подготовили помощник M13KO7 ФАГ предварительно зараженных кишечной палочки SS320 электро компетентных клеток. Эффективность этих электро компетентных клеток оценивается как 2 Х 109 cfu/мкг, когда использовался ВСБ phagemid основой для строительства библиотеки (рис. 4).

Была проведена проверка ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы построить высокое разнообразие, фаг отображается Fab библиотек, контроль качества контрольно-пропускные пункты необходимы для мониторинга различных этапов процесса строительства, включая компетентность электро компетентных клеток, качество dU-ssDNA шаблона, эффективность СТС dsDNA синтез, титр после электропорация, потрясающий складной и аминокислоты разнообразие CDR последовательности анализа клонов ФАБ ФАГ.

Высокая урожайность и чистоту dU-ssDNA имеет важное значение для высокого мутаг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признательны д-р Фредерик Fellouse из Сидху лаборатории для критических замечаний Канкел в метод основан синтетических Fab Фаговые библиотека строительство. Авторы ценят миссис Алевтина Павленко и других членов из лаборатории Сидху за ценную помощь подготовки высокой эффективности электро компетентных клеток кишечной палочки и высокое качество dU-ssDNA. Эта работа была поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (Грант №: 81572698, 31771006) для DW и ShanghaiTech университета (Грант №: F-0301-13-005) в лаборатории инженерной антител.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>Реагенты
1,0 М H<суб>3PO<суб>4ФишерAC29570
1,0 М Трис, pH 8,0Инвитроген15568-025
10 мМ АТФИнвитроген18330-019
100 мМ дитиотреитолФишерBP172
100 мМ дНТП mixGE Healthcare28-4065-60содержащий по 25 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP.
3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB)Kirkegaard & Perry Laboratories Inc50-76-02
50X TAEInvitrogen24710030
AgaroseFisherBP160
Карбенициллин, углеводSigmaC1389100 мг/мл в воде,   0,22 &m; м фильтр-стерилизованный, рабочая концентрация: 100 мкм; г/мл.
Хлорамфеникол, cmpSigmaC0378100 мг/мл в этаноле, 0,22 мкм; м фильтр-стерилизованный, рабочая концентрация: 10 мкм; г/мл.
ЭДТА 0,5 М, pH 8,0ИнвитрогенAM9620G
Гранулированный агарVWRJ637-500G
H2O2 пероксидазный субстратKirkegaard & Perry Laboratories Inc50-65-02
K2HPO4Sigma795488
Kanamycin, kanFisherAC6112950 мг/мл в воде,  0,22 μ м фильтр-стерилизованный, рабочая концентрация: 50 мкм; г/мл.
KH2PO4SigmaP22222
Na2HPO4Sigma94046
NaClAlfa AesarU19C015
NanodropFisherND2000C
NaOHFisherSS256! ВНИМАНИЕ: NaOH вызывает ожоги.
Обезжиренное сухое молокоSangon BiotechA600669
PEG-8000FisherBP233
Белок A-HRP конъюгатInvitrogen101123
QIAprep Spin M13 KitQiagen22704
QIAquick Набор для экстракции геляQiagen28706
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Рекомбинантный белок LFisher77679
T4 ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0203S
T4 полинуклеотидкиназаNew England BiolabsM0201S
T7 ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0274S
тетрациклин, тетSigmaT766050 мг/мл в воде, 0. 22 μ м фильтр-стерилизованный, рабочая концентрация: 10 мкм; г/мл.
ТриптонФишера0123-07-5
Твин-20СигмаР2287
Сверхчистый глицеринИнвитроген15514-011
УридинСигмаУ375025 мг/мл в этаноле, рабочая концентрация: 0,25 мкм; г/мл.
Дрожжевой экстрактVWRDF0127-08
НазваниеКомпания >Номер в каталогеКомментарии
Штаммы
E.coli CJ236New England BiolabsE4141Генотип: dut-  ung-  thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Используется для получения dU-ssDNA.
E.coli SS320Lucigen60512Генотип: [F'proAB+lacIq lacZΔ M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ (araABC-leu)7679 и Дельта; lacX74 galUgalK rpsL thi. Оптимизирован для высокоэффективной электропорации и производства нитчатых бактериофагов.
M13KO7New England BiolabsN0315S
НазваниеКомпания Номер в каталоге>Комментарии
Оборудование
0,2-см зазор электропорационная кюветаBTX
96-луночный 2mL Глубоколуночные планшетыFisher278743
96-луночные иммунопластины MaxisorpNunc151759
Baffled колбыCorning
Настольная центрифугаEppendorf5811000096
Центрифуга БутылкиNalgene
ECM-630 электропораторBTX
Magnetic мешалкиNalgene
Thermo Fisher центрифугаFisher
Высокоскоростной шейкерTAITEKMBR-034P Микропланшетный
шейкерQILINBEIERQB-9002
Обработчик жидкости на 96 и 384 лункиRAININ
Mutil-канальный пипеткаRAININE4XLS
Amicon обогатительная фабрикаMerckUFC803096
раствор ,

Ссылки

  1. Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
  2. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
  3. Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
  5. Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
  6. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  7. Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
  8. Sidhu, S. S. Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , CRC Press. (2005).
  9. Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
  10. Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
  11. Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
  12. Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
  13. Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
  14. Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
  15. Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
  16. Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
  17. Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
  18. Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
  19. Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
  20. Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
  21. Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
  22. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  23. Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).
  24. Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).
  25. Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring? Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
  26. Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
  27. Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492(2015).
  28. Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
  29. Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics - the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FabA L

Похожие статьи