Как генетические варианты, связанные с болезнью человека начинают стать обнаружили, она становится все более важным разработать системы, позволяющие быстро оценить биологическое значение этих выявленных вариантов. Этот протокол описывает методы для оценки функции человеческого гена во время женского мейоз, я с помощью мыши ооцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С помощью мыши яйцеклеток для оценки человеческого гена функции во время мейоза я
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриональных анеуплоидия является основной причиной генетических бесплодия в организме человека. Большинство из этих событий происходят во время женского мейоз, и хотя положительно коррелирует с возрастом матери, возраст только не всегда прогнозировать риск возникновения анеуплоидных эмбриона. Таким образом варианты гена может приходится неправильные хромосома сегрегации при женских. Учитывая, что ограничен доступ к человеческой яйцеклетки для исследовательских целей, серия анализов были разработаны для изучения функции человеческого гена во время мейоза, я с помощью мыши ооцитов. Во-первых матричная РНК (мРНК) гена и вариант гена интереса являются microinjected в профазе I арестован мыши ооцитов. После предоставления времени для выражения, ооциты синхронно выпускаются в meiotic созревания для завершения мейоза я. Путем пометки мРНК с последовательностью флуоресцентные репортер, такие как Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), локализация человеческий белок может быть оценена в дополнение к фенотипические изменения. Например, прибыль или потеря функции могут расследоваться путем создания экспериментальных условиях, которые бросают вызов продукт гена исправить meiotic ошибки. Хотя эта система является выгодным в расследовании человеческий белок функции во время женских, адекватной интерпретации результатов следует провести учитывая, что выражение протеина не на местных уровнях и, если не контролируется для (т.е. постучал out или вниз) мышиных гомолог также присутствуют в системе.
Введение
Бесплодие является состоянием, которое влияет на 10-15% населения репродуктивного возраста 1, из которых почти половина искать лечение 2. Хотя этиология бесплодия разнообразны и во многих случаях многофакторного, наиболее распространенных генетических аномалий в организме человека является эмбриональных анеуплоидия 3. Анеуплоидия определяется как отклонение (прибыль или убыток) правильное количество хромосом в клетке. Феномен анеуплоидия в человеческих эмбрионов является общим и увеличивается с возрастом матери 4,5. Четыре рандомизированных контролируемых клинических испытания показали, на благо выбор только хромосомно нормальных (euploid) эмбрионов для передачи матки, потому что эта стратегия привела к увеличению имплантации ставки, низкими выкидыш и более короткое время для для достижения беременности- 6,-7,-8,-9. Таким образом понимание этиологии человека анеуплоидия может иметь важные последствия в репродукции.
Хотя предимплантационной генетическое тестирование для aneuploidies является полезным в лечении бесплодия, глубокое понимание как aneuploidies происходят по-прежнему отсутствует. Широко признается, что существует позитивная корреляция meiotic aneuploidies (родилась в ходе гамет производства) и возраст матери, однако, некоторые женщины настоящее эмбриональных анеуплоидия ставок, которые отклоняются от средней ставки для их возраста 4. Эти случаи показывают, что возраст только не всегда прогнозировать риск возникновения анеуплоидных эмбриона. Другие факторы могут играть свою роль в повышении риска эмбриональных анеуплоидии, например варианты гена.
Ключевым аспектом расследования потенциального вклада вариант гена к анеуплоидии во время мейоза ооцитов состоит в разработке системы быстро оценить ген петельной функция. Этические ограничения и ограниченный доступ нецелесообразно выполнять эти эксперименты с использованием человеческих яйцеклеток. Эти проблемы можно обойти с помощью мыши ооцитов, и здесь ряд анализов для оценки функции человеческого гена во время мейоза я описаны. По microinjecting, матричная РНК (мРНК) кодирования для вариант гена интереса, локализация человеческий белок в мыши яйцо можно визуализировать и используется для определения, если внематочная выражение дикого типа и мутировавших человеческого белка приводит к любой Фенотипические изменения, которые могут привести к анеуплоидии. Эти фенотипы включают увеличение микротрубочек, которые крепятся к неправильным сестре Кинетохор и невозможность поддержки выравнивание хромосомы в метафаза мейоз I. Главное, этот протокол может использоваться для изучения выгоды и потери функции генетических вариантов путем установления конкретных экспериментальных условий такие как оспорить ключевые события в яйцеклетку мейоз шпинделя здания и хромосомы выравнивание 10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. молекулярное клонирование
- Получить полноценный кодирующая последовательность гена интереса и вектор плазмиды в vitro транскрипция (pIVT)11.
Примечание: Полнометражные cDNA клоны являются коммерчески доступными от различных поставщиков или могут быть получены через обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (ПЦР). Национальный центр биотехнологии информации (NCBI) онлайн-ресурс предоставляет Стенограмма последовательностей генов из нуклеотидов и выразил последовательности отмеченных (EST) баз данных. Для удобства белка визуализации и анализа уровни выражения, fusion для зеленого флуоресцентного белка (ГФП) или другой подходящей флуоресцентные тег может быть пожеланным клонирования стратегии. - Используя проверенные стратегии клонирования, вставьте кодирующая последовательность гена интереса в регионе несколько клонирования pIVT. Подробное описание молекулярного клонирования и необходимые шаги были ранее описанных 12.
Примечание: Если продукт гена Фьюжн должна создаваться, быть уверены, что клонирование в рамках надлежащего чтения. - Последовательность конструкцию Глобин Праймеры для обеспечения правильного гена вставки, надлежащего фьюжн в кадр, и что не полимеразы индуцированной точечные мутации были созданы.
Примечание: Если не предоставляется оборудование секвенирования ДНК Сэнгер, многие компании предлагают недорогих вариантов секвенирования ДНК. - Mutagenize ДНК, если создание единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) или вставки/удаления (INDELS). Мутагенез ДНК описано в шагах 1.5-1.7 ниже. Для одичал тип конструкций перейдите к шагу Линеаризация 1.7.
- Дизайн праймеров мутагенеза и завершить реакции PCR мутагенеза для создания мутантных конструкции за производителя протокол. ПЦР опосредованной сайт Направленный мутагенез был ранее описанных 13. Кроме того многие компании предлагают сайт Направленный мутагенез комплекты, которые включают протоколы.
- Преобразование mutagenized ДНК в бактериальных хоста. Изолировать и очищения плазмиды.
Примечание: Многие компании делают наборы, которые можно использовать для легко изолировать и очистить плазмида ДНК. Следуйте производителей протокол соответственно. При использовании штамм грамотрицательных бактерий например E. coli, рекомендуется использовать комплект, который удаляет эндотоксинов. - Последовательность изолированной ДНК бактериальных трансформантов, используя стандартные секвенирования ДНК Сэнгер для подтверждения введения желаемого SNP или INDEL.
- Линеаризации конечных продуктов с использованием единого энзима ограничения пищеварение очищенная ДНК.
Примечание: PIVT вектор содержит несколько одно фермента, вырезать сайты, перечисленные в карте плазмида Addgene 14. - Убедитесь, что продукт является линейной через электрофорез геля агарозы. Методология для электрофореза геля агарозы ранее были определены 14.
Примечание: Для всех оставшихся шагов, используйте советы накапайте барьер (фильтр) и РНКазы бесплатные материалы для обеспечения производства стабильное, высокое качество РНК. - Очищают переваривается продукта с использованием проверенных ДНК очистки протокол или комплект, а элюировать в 30 мкл РНКазы/DNase свободной воды.
Примечание: Кремний матрица спина, на основе столбцов наборы рекомендуются для высокого качества, очищенная ДНК. Следуйте производителей протокол соответственно. - В пробирке транскрибировать ДНК полимеразы T7 после производителя протокол.
- Очищают и элюировать РНК в 30 мкл РНКазы/DNase свободной воды с использованием кремния матрица спина на основе столбцов нуклеиновой кислоты очистки комплекта после производителя протокол.
- Выполните с помощью формальдегида для подтверждения окончательный размер продукта РНК денатурируя геля агарозы. 1.13-1.22 ниже 14см. (Рис. 1).
- Подготовить гель нагреванием агарозы 1 g 72 мл воды пока растворится, а затем охладить до 60 ° C.
- Подготовка 10 X швабры работает буфер, добавляя MOPS 0,4 М (рН 7,0), ацетат натрия 0,1 М и 0,01 М ЭДТА.
- Добавьте 10 мл 10 X швабры работает буфер и 18 мл 37% формальдегида (12,3 М) в охлажденный агарозы решение.
- Каста гель, поливая агарозы решение в гелеобразующий контейнер. Расческой достаточно большим, чтобы вместить 10 мкл. После того, как гель поставила и твердой на ощупь, осторожно снимите гребень.
- Соберите геля в баке электрофореза, и добавить достаточно 1 X швабры идущий буфер, обеспечение гель покрыта полностью.
- Подготовьте образец РНК путем добавления 1 мкг РНК 0.5 X томов формальдегида содержащих загрузки красителя.
- Добавьте бромид ethidium решение РНК в концентрации 10 мкг/мл.
- Денатурируйте РНК образец решения при 70 ° C за 5 мин.
- С помощью стерильного, 10 мкл фильтр советы, нагрузка 5 мкл маркер молекулярного веса и 5 мкл РНК представленном(ых) в отдельной скважины геля и electrophorese на 5 V/см до тех пор, пока краска мигрировали по крайней мере две трети длины геля.
- Визуализируйте РНК в геле на осветитель транс УФ. Убедитесь, что РНК правильного размера, сравнивая маркер молекулярного веса.
- Чтобы измерить концентрацию и чистоту РНК, передачи 1.2 мкл очищенный РНК, используя стерильные 10 мкл фильтр советы на УФ спектрофотометр.
Обратите внимание, что РНК высокого качества должны иметь коэффициенты поглощения A260/280 (1,8-2,2) и 260/230 (> 1.7) соответственно. - Использование 10 мкл фильтр советы, аликвота оставшиеся очищенный РНК в стерильных 0.5 мкл пробирок (3-5 мкл/трубка). Хранить трубы-80 ° c до готовности для микроинъекции.
Примечание: Концентрация окончательный инъекции 500 нг/мкл является оптимальной отправной точкой. Рекомендуется для разбавления 1:2 в РНКазы бесплатно H20 до микроинъекции уменьшить липкость РНК в пипетку микроинъекции РНК.
2. Кинетохор микротрубочек насадку пробирного
- Ооциты делят на равные группы для микроинъекции.
Примечание: Ооцитов сбора, передачи, микроинъекции и meiotic созревания был описан подробно JoVE ранее 15. - Microinject одной группы с экспериментальной мРНК и другие группы с WT управления и PBS или Gfp мРНК.
Примечание: 500 нг/мкл является концентрация инъекции рекомендуется начать с 10. Picoinjector может использоваться для управления впрыска сумм. Объем впрыска 5-10 пл рекомендуется 15. - С помощью руки или рот, эксплуатируемых дозирования аппарат, где стекло Пипетка открытие это немного больше, чем диаметр ооцитов (100-150 мкм), ооциты передачи в 100 мкл капля milrinone свободной культуры среднего в чашке Петри охваченных эмбриона качество нефтепродуктов и инкубировать яйцеклеток для 7 ч при 37 ° C в 5% C02 позволяет достаточно созревания до метафазы мейоз и я (встретил я) 15.
- После инкубации, используя же аппарат пипетку выше, передачи яйцеклеток в центр ну орган культуры блюдо, содержащий 700 мкл предварительно охлажденные минимальных основных СМИ (MEM) коллекции среды в центре хорошо и 500 мкл H20 в внешнего кольца и Поместите блюдо на льду за 7 мин.
Примечание: Рекомендуется предварительно chill MEM СМИ и центр хорошо орган культуры блюда при-20 ° C для по крайней мере 20 минут до начала лечения яйцеклеток. - Исправьте яйцеклеток, передачи их с помощью пипетки аппарат в хорошо прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл параформальдегида 2% в ПБС втечение 20 мин при комнатной температуре.
- Используя же Пипетка аппарат, передачи яйцеклеток в еще один колодец на место пластину, содержащие 400 мкл блокирующие решение (PBS + 0,3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0,02% НАН3) и хранить при 4 ° C до готовности для обработки иммуноокрашивания.
Примечание: для хранения яйцеклеток на 4 ° C, Стекло покровное пятно пластины с парафина для предотвращения испарения. - С помощью же пипеткой аппарат, ооциты передачи на новый колодец в месте пластины содержащие 400 мкл permeabilization раствора (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% НАН3) и инкубации при комнатной температуре 20 мин переноса ооцитов быстро через три капель 400 мкл блокирование решение для удаления любых остатков моющего средства.
Примечание: 9-Ну прозрачного стекла пятна пластины хорошо работает для перемещения групп через несколько процедур на одной тарелке (шаги 2,4-2,5). - Выполните остальные процедуры immunocytochemistry в камере увлажненные, защищенный от света при комнатной температуре. Использование средних пластиковый контейнер выстроились с влажной салфетки и накрыть алюминиевой фольгой.
- С помощью пипетки аппарат, передачи ооциты 30 мкл преграждая разрешение на крышке 96-луночных пластины и место в зале увлажненные за 10 мин.
Примечание: Капли помещаются в круговой отступы на плите. - Ярлык центромеры и шпинделя, используя пипетку аппарат, передачи ооциты 30 мкл блокирование раствор, содержащий анти прицентромерного антигена (ACA, гребень) (1:30) и тубулин анти ацетилированные (1: 1000) и проинкубируйте по крайней мере 1 час.
- Промойте ооциты путем передачи через капли три 30 мкл преграждая разрешение для 10 мин.
- С помощью пипетки аппарат, переноса ооцитов 30 мкл падение блокирования решения, содержащие вторичные антитела бесплатными для антител, используемые выше (античеловеческие IgG 1: 200, анти мыши IgG 1: 200) и инкубировать в течение 1 ч.
- Повторить 3, 10-мин полоскания в 30 мкл преграждая разрешение, как описано в шаге 2.11.
- Переноса ооцитов, используя пипетку аппарат, в 3-5 мкл монтажа средних содержащие DAPI (5.9 мкг/мкл) на стекло микроскопа.
- 4 место небольшой капли (размер булавочную головку) вазелин на углах крышку выскальзования для предотвращения дробления яйцеклетки.
- Осторожно поместите крышку выскальзования-вазелин стороне вниз на слайд.
- Уплотнение coverslip края с очистить лак и дайте высохнуть на 5 мин.
- Хранить слайды на 4 ° C, в защищенном от света, до обработки через confocal микроскопии.
Примечание: Обеспечить преломления матчей монтажа средних и coverslip, Микроскоп целей используются. Рекомендуемые монтажные материалы ранее были описаны 15. - Изображение ооцитов, используя цель x 40-63 на конфокального микроскопа, захватив небольшие шаги (≤ 1 мкм) в плоскости z, оптимизированный для рабочих цель и изображения на весь регион метафаза шпинделя.
Примечание: Убедитесь, что изображение все 3 каналы, основанные на конкретных вторичные антитела, используемые на шаге 2.11. Изображения в среднем ≥ 4 и зум 3 идеальны для надлежащей резолюции. 1 Размер шага мкм обеспечивает четкие визуализации микротрубочек и kinetochores в ооцитов мыши. Процедура для захвата изображений будет варьироваться от Микроскоп Микроскоп. Обратитесь к руководству конфокальный пользователя производителей для конкретных шагов по настройке параметров микроскопа. - Определите статус вложений Кинетохор микротрубочек, с использованием изображений программное обеспечение, следуя шаги 2.21-2.23 ниже.
Примечание: Следующие шаги описывают эту процедуру с использованием изображений J (НИЗ) бесплатно загружаемое программное обеспечение, однако, может использоваться альтернативный изображений программное обеспечение. Статус вложений, типы ранее были определены 16 . - Открыть изображение, перетащив файл в J изображение панели инструментов.
- В открытом z серии сделайте все каналы видимым (ДНК, Кинетохор и шпинделя), нажав «объединить каналы», доступных в раскрывающемся меню «изображение» на вкладке «Цвет» sub.
- Используя переключатель в нижней части изображения, переместить через каждый z ломтик и определить Кинетохор микротрубочки вложение. Подробные вложение, которое ранее были описания описал 16
3. хромосомы выравнивание вызов Assay
- С помощью пипетки аппарат, как описано в шаге 2.3, переноса ооцитов в 100 мкл капля milrinone свободной культуры среднего по нефти и инкубировать яйцеклеток для 7 h позволяет достаточно созревания до метафазы мейоз и я (встретил я) как описано в шаге 2.3 17 .
Примечание: Процедуры сбора, микроинъекции и созревания ооцитов были изложены ранее 15. Обратитесь к протокол assay вложений в шагах 2.1-2.2 для элементов управления и концентрации РНК микроинъекции. - Использование же пипеткой аппарат, ооциты передачи в центр ну органной культуры блюдо содержащий 700 мкл питательной среды, содержащие monastrol [100 мкм] в центр хорошо и 400 мкл H20 в окружающих кольцо и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.
- Промыть monastrol путем переноса ооцитов, используя пипетку аппарат как выше, через три капли 100 мкл CZB питательной среды и затем передать яйцеклеток в новый центр ну орган культуры блюдо содержащий 700 мкл культуры среднего + MG132 [5 мкм] за 3 ч в центре кольцо. Добавьте 400 мкл H20 внешнего кольца.
- Исправьте яйцеклеток путем передачи их, используя пипетку аппарат, в колодец прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл 2% параформальдегида в PBS для 20 мин при комнатной температуре.
- После фиксации, переноса ооцитов, используя пипетку аппарат, в новой скважины прозрачного стекла пятна пластины, содержащие 400 мкл блокирования решения и хранить при 4 ° C до обработки для иммуноокрашивания.
Примечание: для хранения яйцеклеток на 4 ° C, Стекло покровное пятно пластины с парафина для предотвращения испарения. - Разрушения и этикетки ооциты через immunocytochemistry, как описано в шагах 2.6-2.16.
- Изображение яйцеклеток с помощью цель x 40-63 на конфокального микроскопа, захватив < 1 мкм шаги в плоскости z, убедившись, что изображения на весь регион метафаза шпинделя.
- Определить выравнивание хромосомы статус открытия файлов изображений с помощью визуализации программного обеспечения.
Примечание: Следующие шаги описывают эту процедуру с использованием изображений J (НИЗ) бесплатно загружаемое программное обеспечение, однако, может использоваться альтернативный изображений программное обеспечение. - Перетащите изображение в изображении J Панель управления.
- В открытом z серии, используйте инструмент точка (доступен, нажав точку пиктограмму на панели управления изображения J) для обозначения точки в конце каждого шпинделя полюса в их соответствующих z ломтик, поместив инструмент над полюсом шпинделя в изображении и нажав на изображение. Добавьте эти точки региона интерес (ROI) менеджер, нажав Command + t на клавиатуре.
- Определите конкретные координаты для каждой позиции, набор в шаге 3.10, выделив конкретные точки в менеджере ROI и нажав кнопку измерения. Это даст результаты таблица, содержащая координат x и y для каждой точки. Это будут точки X1, Y1 и X1, Y2, соответственно.
- Далее определите значение true Z координата. Это делается путем умножения числа срез конкретных z-среза в z стека, в котором была определена полюс шпинделя (т.е. фрагмент #2 из 6) что каждой конкретной точке в стек толщиной (т.е. 1 мкм) (пример: фрагмент 2 x 1 мкм = 2). Это будут точки Z1 и Z2 соответственно.
- Определить длину шпинделя с помощью теоремы Пифагора уравнения (б2 +2 = c2) с использованием ранее определенных x, y и z координаты от шагов 3.11-3.13. Для каждого шпинделя конечной длины соотвествует:
√((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - Определите midzone шпинделя. Рассчитывается как одна половина длины шпинделя. Используя инструмент «линия» в изображении J, нажав на значок линии на панели инструментов изображения J Нарисуйте линию, которая составляет от одного полюса шпинделя до midzone шпинделя. Длина будет отображаться на панели инструментов J изображения.
- Определите статус хромосомы выравнивание путем оценки хромосома расстояние от шпинделя midzone, используя средство измерения строки. Используя инструмент линия доступна, щелкнув значок линии на панели инструментов изображения J, нарисуйте линию от midzone шпиндель для хромосомы. Длина будет отображаться на панели инструментов J изображения. Хромосомы, больше, чем 4 мкм от шпинделя midzone считаются выровненными 18.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После в vitro транскрипция РНК высокого качества будет иметь отношение A260/A280 (1,8-2,2) и ≥1.7 отношение A260/A230 когда измеряется с помощью спектрофотометра. Изображение на рисунке 1 показана миграция в vitro-производится РНК на денатурируя геля агарозы после электрофореза. Группа, которая смазывается в шаблон или образец, который имеет несколько размеров полос может указывать загрязнение или деградации образца. Кроме того несколько пол...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Из-за быстрого и увеличение идентификации человеческих генетических вариантов, связанных с болезнью важно, что созданы системы для оценки их биологическое значение. Понимание функции протеина в человека мейоз создает особые проблемы, потому что человеческие яйцеклетки являются драгоценные и редкие и человеческой спермы не поддаются генетические манипуляции. Ооцитов мыши являются ценным для оценки человека ген петельной функции 10,23системы млекопитающих модель. Э...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательский грант от американского общества репродуктивной медицины и Чарльз и Johanna Busch Мемориальный фонд по Rutgers, государственного университета NJ к A.L.N. к.с. был поддержан грант от N.I.H. (F31 HD0989597).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 мл Seal-Rite PCR tube | США Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X Загрузка ДНК Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-луночная стеклянная пятенчатая пластина | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Альбумин из бычьей сыворотки | Сигма-Олдрич | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 конъюгированный антимышиный IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 разведение |
| Alexa-fluor-633 конъюгированный античеловеческий IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 разведение |
| ампициллина | VWR | AA0356 | |
| Антивибрационный стол | Technical Manufacturing Corp | любой стандартной модели | |
| Антиацетилированный тубулин антитело | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) антитела | Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Барьерные (фильтрующие) наконечники для дозаторов | Thermo Scientific | AM12635 | Убедитесь, что они совместимы с пипетками вашей марки. Они совместимы с дозаторами марки Eppendorf. |
| Дегидратированные питательные среды BD Difco: LB Агар, Миллер (Luria bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Дегидратированные питательные среды: LB Бульон, Миллер (Luria bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Капиллярная трубка | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well чашка для культуры органов | VWR | 25381-141 | |
| CO2 | Для инкубатора | ||
| Конфокальный микроскоп | Zeiss | любой стандартной модели | |
| Центрифуга (с возможностью охлаждения) | Thomas Scientific | любая стандартная модель | |
| Покровное стекло 11 x 22 мм | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Покровные стекла | Thomas Scientific | 6663-F10 | толщина будет варьироваться для конкретных микроскопов |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Цифровая сухая ванна | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high Фермент для клонирования верности | Agilent | 600400 | Для клонирования ДНК |
| Ферменты для линеаризации pIVT | New England Biolabs | NdeI или KasI могут быть использованы | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Можно использовать любой флуоресцентный микроскоп | ||
| Формальдегид (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Формальдегид РНК загружающий краситель | Ambion | 8552 | |
| Матовый предметный стекал для микроскопа (незаряженный) 25X75 мм | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Полноразмерные клоны | Можно получить у любого поставщика, который предоставляет открытое чтение каркасные клоны | ||
| Гель электрофорез Аппарат | Bio-Rad | любой стандартной модели | |
| Стекло Пастер Пипец | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Глобин Форвард Праймер для pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Можно приобрести у любой компании, которая производит на заказ олигонуцелотиды | ||
| Обратный праймер Globin для pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Можно приобрести у любой компании, которая производит олигонуцелотиды | ||
| на заказ Держа пипетки | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Увлажненная камера | Tupperware можно использовать | ||
| Illustra Ready-To-Go Бусины ОТ-ПЦР | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Инкубатор | любой стандартной модели с CO2 и технологией с водяной рубашкой | ||
| Инвертированный микроскоп | Nikon Instruments | Любая стандартная модель | |
| Image J (NIH) Программное обеспечение | NIH | Программное обеспечение для анализа изображений | |
| Крышка 96-луночной пластины | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Пробирка с низкой адгезией 0,5 мл | США Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Программное обеспечение для анализа последовательностей | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Предметные стекла микроскопа | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Маркеры РНК тысячелетия-формальдегид | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Ресуспендирование в ДМСО при 2,5 мМ |
| минеральном масле | Sigma-Aldrich | M5310 | Используется только эмбриотестированный, стерильно отфильтрованный |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Ресуспендия в ДМСО при 100 мМ |
| Мундштук | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 бак | для антивибрационного настольного | ||
| лака для ногтей; Прозрачный | Любой прозрачный лак для ногтей можно использовать | ||
| NanoDrop Микрообъемный УФ-Вид спектрофотометр | Thermo Scientific | любой стандартной модели | |
| NorthernMax 10X Денатурирующий гель Буфер | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Беговой буфер | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Беговой буфер | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Чашка для культивирования органов 60x15 мм | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | ||
| Термоамплификатор PCR | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| чашка Петри 139 мм | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Чашка Петри 35 мм | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Чашка Петри 60 мм | Falcon BD | 351007 | |
| пикоинъектор | XenoWorks Digital Микроинъектор | любой стандартной модели | |
| Пуллер для пипеток | Flaming-Brown Micropipette | puller Модель P-1000 | |
| pIVT плазмида | AddGene | 32374 | Пустой вектор подходит для экспрессии ооцитов. |
| Сыворотка крови беременной кобылы Гонадотропин | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | очистка до 20 мкл плазмидной ДНК |
| QIAquick ПЦР набор | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II набор для сайт-направленного мутагенеза | Agilent | 200523 | набор для мутагенеза для вставок и делеций |
| Quikchange lightning многосайтовый набор направленного мутагенеза | Agilent | 210512 | набор для мутагенеза для изменения одного участка |
| Ножницы (Тонкая точка) | Инструменты для тонкой науки | 14393 | |
| Ножницы (Средняя точка) | Инструменты для тонкой науки | WP114225 | |
| Тюбик для микроцентрифуги Seal-Rite 1,5 мл | США Научный | 1615-5500 | |
| Нагреватель | любой стандартной модели | ||
| Спектрофотометр (Нанокапля) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Стереомикроскоп | любой стандартной модели | ||
| Эффективность субклонирования DH5a Компетентные клетки | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Шприц | BD Bioscienes | 309623 | 1 мл, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine высокой производительности набор для транскрипции РНК с крышкой | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| пинцет (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Diстиллированная вода | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Бромид этидия 10 мг/мл | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite трансиллюминатор | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Монтаж Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
Ссылки
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
