Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание, тестирование и использование селективного микроэлектродов ионов калия в срезах тканей взрослого мозга

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57511

⸱

7 мая 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 3Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

Ионы калия способствует покоя мембранного потенциала клеток и внеклеточной концентрации K+ является регулятором важнейших клеточных возбудимости. Мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Использование таких электродов позволяет измерение электрически вызвала динамика концентрации K+ в взрослых срезах гиппокампа.

Аннотация

Ионы калия значительный вклад покоя мембранного потенциала клеток и, таким образом, внеклеточной концентрации K+ является важным регулятором возбудимость клеток. Изменены концентрации внеклеточного K+ влияют покоя возбудимости потенциал и клеточные мембраны, сдвигая равновесие между закрытые, открытые и инактивированных государствами для напряжени тока зависимых ионных каналов, которые лежат в основе потенциал действия инициирование и проведение. Следовательно это ценный непосредственно измерить внеклеточного K+ динамика в области здравоохранения и государства в больными. Здесь мы опишем, как сделать, калибровки и использовать монополярной K+-селективный микроэлектродов. Мы развернули их ломтиками взрослого мозга гиппокампа для измерения электрически вызвала динамика концентрации K+ . Разумное использование таких электродов является важной частью инструментария, необходимых для оценки сотовой и биофизические механизмы, которые управляют внеклеточной концентрации K+ в нервной системе.

Введение

Концентрации ионов калия жестко регулируется в головном мозге, и их колебания оказывают мощное влияние на мембранного потенциала покоя всех клеток. С учетом этих критических взносов важная цель биологии является определить сотовой и биофизические механизмы, которые используются жестко регулировать концентрацию K+ в внеклеточного пространства в различных органах тела1 , 2. важным требованием в этих исследованиях является способность точно измерить концентрации K+ . Хотя многие компоненты, которые способствуют калия гомеостаза в мозге в здоровых и больных государства были определены3,4,5, далее прогресс замедлился ввиду специализированного характера подготовка выборочной микроэлектродов иона калия измерения. Микроэлектродные датчики представляют собой золотой стандарт для измерения K+ концентрации в пробирке, фрагменты тканей и в естественных условиях.

Новые подходы для K+ мониторинга находятся в стадии разработки, с помощью оптических датчиков, однако они не обнаружить концентрации биологически соответствующий диапазон K+ или у не были проверены полностью в биологических системах, хотя первоначальные результаты появляются многообещающие6,,78. По сравнению с оптическими датчиками, микроэлектродов принципиально ограничены для измерения точки источника ионов, хотя массивы электродов может улучшить пространственное разрешение9. Эта статья сфокусирована на сингл бочковая микроэлектродные датчики для мониторинга динамики K+ .

В этой работе, мы докладе подробные ступенчатой процедуры сделать K+ селективный микроэлектродов, используя ionophore на основе valinomycin калия, который позволяет весьма избирательно (104 раза K+ к избирательности Na+ ) K+ движение через мембраны10. Естественно-происходя полипептид, valinomycin действует как K+ проницаемых поры и облегчает стекают K+ электрохимических градиента. Мы также описывают, как для калибровки электродов, как хранить и использовать их и, наконец, как развернуть их для измерения K+ динамика концентрации в кусочки острый гиппокампа мозга от взрослых мышей. Использование таких электродов вместе с генетически измененных мышей, которые не имеют конкретных ионных каналов, предлагается регулировать внеклеточного K+ динамика должна выявить клеточных механизмов, используемых нервной системой для управления окружающего концентрация K + в внеклеточной окружение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Национальный институт здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных и были утверждены Комитетом исследований животных канцлера университета Калифорнии, Лос-Анджелес. Все мыши были размещены с продуктов питания и воды доступны ad libitum в среде свето тени 12 h. Все животные были здоровыми без очевидных поведенческих изменений, не участвовали в предыдущих исследованиях и были принесены в жертву во время свет цикла. Данные для экспериментов были собраны от взрослых мышей (6-8 недель для всех экспериментов).

1. Подготовка выборочного микроэлектродов K+

  1. Silanization боросиликатное стекло
    1. Извлеките достаточно стеклянные капилляры из упаковки и положите в 50 мл Конические трубки. Заполните Конические трубки к началу 1 М HCl. мыть электродов с нежным агитации в одночасье HCl или как минимум 6 часов.
    2. Кратко промыть капилляров с 70% этанола и затем высушить полностью на 100-120 ° C для 6-8 часов. Храните промывают капилляров в контейнерах с осушителем сульфат безводный кальций на срок до 4 недель до дальнейшего использования.
    3. До silanization натягивают капилляров штрафа отзыв с помощью съемника микроэлектродные. Микроэлектродов, которые мы используем, примерно 2-5 микрон в диаметре. Всегда обрабатывайте промывают капилляров с перчатки, как масла из кожи может мешать silanization.
    4. Место микроэлектродов в стеклянной посуде, таким образом, чтобы электроды повышаются снизу для предотвращения поломки подсказка. Исправьте микроэлектродов к контейнеру с помощью автоклавируемый ленты или аналогичных клейкой лентой.
    5. Удаление приблизительно 0,5 мл раствора silanization 5% dichlorodimethylsilane (DDS) из его контейнера, с помощью метода замены азота (см. Рисунок 2). Заполнить баллон с газом азота и присоединить шприц или трубки и иглы в шар. Вставьте иглу в контейнер DDS при оформлении DDS в отдельном шприц через больше иглы.
    6. Применять раствор silanization каплям советы пипетки и немедленно покрытия. Поместите контейнер, содержащий микроэлектродов раствором silanization в подогретым Печи лабораторные (170-180 ° C) для 10-12 часов, или на 200-220 ° C за 30 минут
    7. После инкубации Выключите духовку и затем удалить пластину из духовки. Будьте осторожны при удалении пластину из инкубатора, как это очень жарко. Место пластину на скамейке при комнатной температуре за 10-15 минут, чтобы позволить посуда для охлаждения.
    8. Удаление микроэлектродов от пластины (с помощью лезвия или лезвия скальпеля для перерезал ленту) и поместите их в осушитель заполненные герметичном контейнере. Silanized микроэлектродов оставить свободной влаги может использоваться до 1 недели после silanization.
  2. Грунтовка электродов
    1. Подготовить Стоковый раствор K+ ionophore коктейль: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1,2-диметил-3-нитробензола, 2% w/v калия tetrakis(4-chlorophenyl) Борат11. Это решение является слабый желтый цвет. Храните в герметичном, непрозрачный контейнер при комнатной температуре. Если правильно хранить это решение может длиться несколько месяцев.
    2. Подготовьте раствор 10 мм HEPES 300 мм NaCl при рН 7,4 в буфер. Исправьте электрода в зажим и обратной засыпки с буферизованного NaCl, используя кончик Микрофилл 28G, подключенных к шприцу. Отмечают, что физиологический раствор, достиг конца кончик микроэлектродные. Убедитесь, что микроэлектродные бесплатно большие пузыри, которые могли бы препятствовать ток.
    3. Разорвать наконечник электрода для приблизительно 10-20 мкм, используя тупой стороной скальпелем или лезвием бритвы.
    4. С помощью микропипеткой, применять небольшие капельки (~0.1 мкл) K+ ionophore возле кончик микроэлектродные. Если электрод был должным образом silanized капли будет поглощена в сломанной кончик. Заполнения электрода для 1-2 мм с ionophore K+ и удалить излишки с помощью папиросной бумаги.

2. Калибровка селективного микроэлектродов K+

  1. Приготовление калибровочных растворов
    1. Подготовка решений различных концентраций KCl в равных осмолярности, искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО), заменив NaCl с KCl. Мы использовали 0.1, 1, 4.5, 10 и 100 мм K+ фаго, для калибровки электродов. Рецепты для решения этих калибровки, перечислены в таблице 1.
ХимическаяМВТОкончательный мм0,1 мм [K +]1 мм [K +]4.5 мм [K +]10 мм [K +]100 мм [K +]
(г / моль)
NaCl58,44варьируется1.51 g1.50 g1,44 г1.4 g0,345 г
ДКК1 М складеварьируется20 мкл200 мкл900 мкл2 мл20 мл
CaCl2 1 М складе2400 мкл
2 MgCl 1 М складе1200 мкл
NaH2PO4 119.981.20.29 g
NaHCO3 84.01260,437 g
D-глюкоза180.16100,360 g
Водыq.s. 200 мл

Таблица 1. Решения для калибровки калия

  1. Микроэлектродные калибровка
    1. Пузырь все решения с 95% O2/5% CO2 по крайней мере 20 минут до начала эксперимента. Начать perfusing Ванна с 4,5 мм [K+] фаго со скоростью 3 мл в минуту. Поместите K+ селективный электрод в держатель электрода, придает headstage электрода на манипулятор. Этот headstage подключен к соответствующей усилителя. Вставьте наконечник электрода в perfusate баня.
    2. Обеспечение Ag/AgCl электродов земли купается в том же решении и что устойчивый поток. Применить калибровочные растворы на основе поэтапного и запишите потенциальные изменения в mV через электрода. Подождите потенциал на электрода для достижения стабильного значения перед переходом к следующему решению
    3. Измерьте изменение напряжения устойчивое состояние в ответ на применение калибровочные растворы электрода. Убедитесь, что наклон электрода ответ по крайней мере 52 и не более чем 58 МВ в журнал изменений в [K+].

3. Подготовка фрагментов острых гиппокампа мозга

  1. Подготовка решений ломтик
    1. Подготовка 500 мл сахарозы резка решение состоит из: сахароза 194 мм, 30 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 10 мм D-глюкоза, 1 мм MgCl2, 1,2 мм NaH2PO4и 26 мм NaHCO3, 290-300 мОсм, насыщенных с 95% O2 и 5% CO2.
    2. Подготовка 1-2 литра раствора (ФАГО) запись состоит из: 124 мм NaCl, 4,5 мм KCl, 1 мм MgCl2, 10 мм D-глюкоза, 2 мм CaCl2, 1,2 мм NaH2PO4и 26 мм NaHCO3; pH 7,3-7.4 (после восходящей), 290-300 мОсм, насыщенных с 95% O2 и 5% CO2. Заполнить стакан, содержащий мозга ломтик держатель камеры с записью решение и держать его на 32-34 ° C. Заполните vibratome камеры с ледяной воды слякоть.
  2. Подготовка острый срез
    1. Глубоко анестезировать мыши, поместив его в колпаке, заряжен с 2-3 мл изофлюрановая. Проверьте для ног щепотку рефлекс и если не отвечают, быстро обезглавить его с помощью пару острых ножниц или гильотинные как животных протокол требует.
    2. Сделайте 2-3 см разрез, используя ножницы из хвостовой части черепа отрезать головы вдоль средней линии. Хотя вручную втягивать кожу головы, сделайте два горизонтальных разрезов 1 см от затылочного по бокам черепа. Затем, с помощью тонкой ножницы, разрез длина реза черепа, вдоль средней линии от задней части черепа в нос.
    3. С помощью тонкой щипцы, вставлены рядом срединной, отозвать резаная черепа в двух частях. Извлечь мозга мыши из черепа и использовать лезвие для удаления мозжечка и обонятельные луковицы, которые соответственно расположены в хвостовой и ростральной части мозга. Это может быть идентифицирован большие трещины, которые отделяют их от коры.
    4. Смонтируйте блок мозга на vibratome лоток с помощью супер клей. Заполните vibratome лоток с ледяной резки решения.
    5. Вырежьте из разделов ткани на корональных плоскости на 300 µm толщиной. Обычно 6 корональных гиппокампа фрагменты могут быть собраны.
    6. После каждого раздела режется, немедленно передать ломтики срез, холдинг стакан, нагретой до 32-34° C. Сохранить разделы при этой температуре 20 мин перед удалением стакан, содержащий разделы и место это при комнатной температуре для по крайней мере 20-30 минут до начала записи.

4. Измерение динамики электрически вызвала K+

  1. Настройка подготовки фрагмента
    1. Осторожно поместите Ломтик мозга в ванне с помощью пипетки Пастера и осторожно удерживать его на месте с платиновым арфы с нейлоновой струны.
    2. Обеспечьте советы биполярного электрода стимулирования параллельны друг другу и уровне с плоскостью среза. Медленно в течение 6-7 секунд, вставьте электроды CA3 пласт radiatum около 40-50 мкм глубоко, чтобы стимулировать Шаффер коллатералей. В корональных секций CA3 примерно определяться как части гиппокампа надлежащего сбоку слоя клеток гранул в гиппокампе genu, с radiatum пласта, падение медиальной и брюшной слоя пирамидальных клеток.
    3. Осторожно вставьте K+-селективный электрод в СА1 пласт radiatum около 50 мкм глубокие, снижая электрод медленно над примерно 3-4 секунды. Разрешить потенциал стабилизации через электрод перед применением стимуляцию на срез: обычно это занимает 5-10 минут. Если фрагмент экспонатов спонтанного изменения внеклеточного K+ затем отменить и повторить этот процесс с новым фрагментом.
  2. Мера вызвала релиз K+
    1. Примените поезда электростимуляции (8 импульсов), вручную удручает триггер стимулятор при цифровой записи ответов. Примените стимуляции на 10 Гц и 1 мс импульса, начиная 10 µA стимул амплитуды.
    2. Применить увеличение амплитуды стимуляции, 2 раза, до обнаружения максимальная амплитуда ответа K+ . Если вы не видите никакого ответа, переместите позицию K+ электрода ближе к месту стимуляции в 100 мкм с шагом
    3. Определите амплитуды стимул, который производит половину максимального реагирования. По нашему опыту это между 40-160 МКА, в зависимости от качества подготовки, возраст животного, и расстояние между электроды стимуляции и селективный электрод K+ .
    4. В же фрагмента, используя амплитуда стимул на один шаг меньше амплитуды, которая производит половину максимального реагирования (например если 80 МКА производит половину максимальные ответ, используйте 40 МКА) применять поезда стимулом увеличения числа импульсов. Первоначально мы использовали поезда 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 импульсов.
    5. Чтобы подтвердить, что K+ сигналы являются посредничестве потенциал действия стрельбы электрически стимулировали ванны коллатералей Шаффер, применяют 0,5 мкм TTX в фаго 10 минут и повторите протокола стимуляции. Не вызвала ответы должны соблюдаться.
    6. После окончания эксперимента срез, подтверждают электрода сохранил свою чувствительность путем повторной калибровке электрод в калибровочные растворы и обеспечение ответ не отошел на более чем 10% от первоначальных калибровки

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для селективного измерения внеклеточного K+мы подготовили ионоселективного микроэлектродов, покрытые гидрофобные слоя через silanization чистой боросиликатного стекла пипеток (рис. 1A). Это покрытие позволяет ionophore K+ , содержащих valinomycin отдых на кончике электрода и разрешить только K+ потока через узкое отверстие в электрода (рис. 1B). После грунтования электродов с засыпана физиологичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, который мы здесь описывать позволила нам оценить динамику K+ в ответ на электрической стимуляции Шаффер залогов в острой срезах гиппокампа от взрослых мышей. Наш метод подготовки K+ Ион селективного микроэлектродов похож на ранее описанные процедуры12,13,14,15. Однако этот метод имеет преимущества по сравнению с альтернативными электрод конфигурации в том, что это б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Khakh лаборатории было поддержано MH104069 низ. Mody лаборатории было поддержано NS030549 низ. J.C.O. Спасибо Grant(NS058280) обучения NIH T32 нейронных микросхемы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ВибратомDSKМикрослайсер Zero 1
Мышь: C57BL/6NTac инбредные мышиTaconicStock#B6
МикроскопOlympusBX51
Электродный съемникSutterP-97
Ag/AgCl измельченная гранулаWPIEP2
pCLAMP10.3Молекулярные устройстван/д
Пользовательский микрофил 28G наконечникМировые прецизионные инструментыCMF28G
Вольфрамовый стерженьA-M Systems716000
Биполярные стимулирующие электродыFHCMX21XEW(T01)
Изолятор стимуловМировые прецизионные инструментыA365
Трава S88 СтимуляторТравяные инструменты КомпанияS88
Пипетки из боросиликатного стеклаМировые прецизионные приборы1B150-4
A to D платаDigidata 1322AAxon Instruments
Усилитель сигналаMulticlamp 700A или 700BAxon Instruments
HeadstageCV-7B Cat 1Axon Instruments
Патч-компьютерDelln/a
Sodium ChlorideSigmaS5886
Хлорид калияSigmaP3911
HEPESSigmaH3375
Бикарбонат натрияSigmaS5761
Одноосновной фосфат натрияSigmaS0751
D-глюкозаSigmaG7528
Хлорид кальцияSigma21108
Хлорид магнияSigmaM8266
валиномицинSigmaV0627-10 мг
1,2-диметил-3-нитробензолSigma40870-25 мл
Тетракис калия (4-хлорфенил)боратSigma60591-100 мг
5% диметилдихлорсилан в гептанеSigma85126-5ml
TTXКайман Chemical Company14964
Соляная кислотаSigmaH1758-500mL
СахарозаSigmaS9378-5кг
Пипетка МикроманипуляторSutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200
ОбъективOlympusPlanAPO 10xW

Ссылки

  1. McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
  2. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).
  3. Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  4. Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).
  5. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
  6. Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).
  7. Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
  8. Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
  9. Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
  10. Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
  11. Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
  12. Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
  13. Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
  14. MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
  15. Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
  16. Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
  17. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058(2015).
  18. Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
  19. Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Приготовление срезов мозгаэлектрофизиологическая регистрацияизмерение внеклеточного калияизготовление микроэлектродовкалибровка ионофорастимуляция среза гиппокампаактивация коллатералей Шаффераанализ по уравнению Нернстаприменение TTX
Создание, тестирование и использование селективного микроэлектродов ионов калия в срезах тканей взрослого мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.