Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/57593

⸱

2 мая 2018 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для количественного определения фолликулов в яичниках культивированный молодых мышей без последовательного секционирование. Используя весь орган иммунофлюоресценции и очистки ткани, физические секционирование заменяется оптических секционирование. Этот метод пробоподготовки и визуализации обеспечивает целостность орган и облегчает автоматизированного количественного определения конкретных клеток.

Аннотация

Исследования в области репродуктивной биологии млекопитающих часто включает в себя оценку общего состояния здоровья яичников и яичек. В частности у самок, яичников фитнес часто оценивается визуализации и количественного определения фолликулов и яйцеклеток. Потому что яичник является непрозрачным трехмерные ткани, традиционные подходы требуют, кропотливо нарезка ткани в многочисленных последовательных секций для того, чтобы визуализировать клетки на протяжении всего органа. Кроме того потому что количественную оценку этим методом обычно влечет за собой, забив только подмножество разделов, разделенных приблизительный диаметр ооцитов, он подвержен неточность. Здесь Протокол описан, вместо этого использует весь орган ткани клиринга и иммунофлюоресценции пятнать мыши яичников для визуализации фолликулов и яйцеклеток. По сравнению с более традиционными подходами, этот протокол является выгодным для визуализации ячеек в яичнике по многим причинам: 1) завязи остается неизменным на протяжении пробоподготовки и обработки; 2) небольшой яичников, которые трудно секции, может рассматриваться с легкостью; 3) сотовых количественной достигается более легко и точно; и 4) весь орган воспроизведен образ.

Введение

С целью изучения клеточного состава и морфологические особенности млекопитающих яичников, ученые часто полагаются на в естественных условиях экспериментов следуют иммуногистохимического окрашивания парафина встроенных яичников. Более недавно, хотя, весь яичник органной культуры оказалась эффективной альтернативой для изучения функции яичников1,2,3,4 , потому что техника может использоваться в сочетании с лучшей визуализации и инструменты количественной оценки. Традиционно анализ морфологии яичников зависит от реконструкции трехмерной яичников архитектуры из парафина встроенных последовательных секций, но, являясь трудоемким и много времени, последовательно секционирование встроенных парафин ткани не гарантирует надлежащего реконструкции органа, и разделы часто теряются или неправильно заказаны в процессе.

Помимо технических проблем, связанных с последовательным секционирование существуют также различия в методах, регулярно используется для количественного определения фолликула номеров каждой завязи5,6. Методологические изменчивость в настоящее время используется повреждает мета анализ овариальный запас через исследования5,7. Например фолликул чисел из различных научно-исследовательских статей может варьироваться от десятикратного или более возрасте подобные развития в пределах конкретного штамма6. Эти большие различия в сообщил фолликула количественной оценки может привести к путанице и препятствуют кросс исследование сравнения. Экспериментально, традиционные подходы к количественной фолликул из последовательных секций выполняются путем подсчета фолликулов предварительно определенное количество разделов (например, каждый пятый, десятый, или другой раздел). Изменчивость в фолликул графов с помощью этого подхода возникает не только от периодичности в разделы, которые считаются, но и от вариации в разделе толщина и технический опыт в создании последовательной разделы5,6. В дополнение к его изменчивости еще один недостаток традиционных тканей секционирование является секционирование малых яичников из молодых животных особенно сложным и сильно зависит от ориентации ткани8.

Протокол ниже описывает регулярно используемых завязи культуры техника1 , но значительно улучшает количественной оценки традиционных фолликула путем замены физической секционирование с очистки ткани и оптических секционирование с помощью конфокальной микроскопии8 ,9. Очистка с помощью погружения ткани (без необходимости для транскраниальной перфузии или электрофорез) в мочевины и сорбитол-на основе решения (например, ScaleS(0)10) оказались совместимыми с иммуноокрашивания и разрешено для уменьшения Очистка время без ущерба для глубины изображения. Другие сообщили методы (например, ScaleA28,10, SeeDB11,12ClearT и12ClearT2), либо больше времени или не позволяют углубленного оптическое разрешение образца. Оптическая секционирование выгодно, потому что это менее трудоемким и поддерживает орган трехмерной архитектуры7,8. Другим преимуществом этого подхода является подготовка образцов не требует дорогостоящих реагентов для очистки ткани и может проводиться с относительной легкостью.

В частности Протокол описал был оптимизирован для искусственного мыши яичников на послеродовой день пять но был проведен на яичниках, начиная от послеродового день 0 - 10. Этот метод использует систему культуры яичников, в котором ткани естественно придает мембраны, на которой выращиваются, содействия орган обработки и манипуляции. Описываемой культуры системы может использоваться для поддержания описаны яичников на срок до 10 дней и для оценки различных экспериментальных условий могут мешать ооцитов выживания13. Количественная оценка процедура, описанная выполняется с помощью обработки пакета Фиджи-ImageJ14 изображений некоммерческого и может проводиться на большинстве персональных компьютеров. Кроме того изображения, используемые для количественной оценки можно сделать широко доступными для научного сообщества, таким образом позволяя для будущих мета анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Корнелльский университет институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) одобрил все методы, описанные здесь, по протоколу 2004-0038 к АО.

1. Подготовка документов и культуры средств массовой информации

  1. Удаление рабочей области чистой с 10% хлоркой и Разрешить отбеливателя остаться на поверхности области работы по крайней мере 5 минут. После 5 минут удалите избыток отбеливатель с чистым бумажным полотенцем и 70% этанола (EtOH). Очистить рассечения Микроскоп тщательно с 70% EtOH.
    Примечание: Важно, что по крайней мере частично стерильные, чтобы избежать загрязнения орган культур области работы.
  2. Оберните ножницы и чистые пинцет салфеткой, смоченной в 70% EtOH до момента использования.
    Примечание: Идеальный рассечение инструменты может варьироваться возраст/размер яичников. Наилучшие результаты получаются с помощью одного резкого микро рассечения ножниц, два штрафа отзыв щипцы (либо номер 5 или 55) и один микро рассекает Ирис ножниц.
  3. В конической трубки сделайте 50 мл завязи культуры средств массовой информации и тепло в ванну воды 37 ° C.
    1. Чтобы яичник культуры среднего4, дополнение 1 x минимальных основных СМИ (MEM) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 25 мм (4--(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 100 единиц/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, 0,25 мкг/мл Амфотерицин B (например, 45 мл MEM, 5 мл тепла инактивированная FBS, 1,25 мл HEPES и 0,5 мл 100 x акций и пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B).
  4. Подготовьте пластины и вставки до культуры завязи.
    1. В культуре ткани капюшоном добавьте 1 mL завязи питательной среды к пластине культуры ткани 35 мм.
    2. Предварительно вымочить вставки мембраны с питательной среды. Добавьте достаточно СМИ, обычно около 0,55 мл, 24-ну несущей пластины культуры ткани, и место клеточной культуры вставить в колодец. Убедитесь в том, что вставка мембраны затрагивает средств массовой информации.
    3. Подготовьте количество 35 мм пластин и скважин с вставками культуры клеток согласно ожидаемое количество яичников в эксперименте. Поместите пластины 35 мм, содержащие 1 мл культуры средств массовой информации и 24-ну несущей плиты, содержащие культуры средств массовой информации и вставки в 37 ° C, 5% CO2и атмосферных O2 инкубатора.
  5. Организовать плита рядом с областью диссекции и установите температуру до 37 ° C. Держите 37 ° C, 5% CO2 и атмосферных O2 инкубатора близка зале рассечение.

2. яичник диссекции и органной культуры

Примечание: Яичники могут расчлененный при комнатной температуре, пока воздействие температуры неидеальной минимальна.

  1. Усыпить самок мышей на послеродовой день 5, путем обезглавливания, одно одновременно.
    Примечание: Согласно IACUC руководящие принципы на объекте, где проводятся исследования должны проводиться эвтаназии.
  2. Spray животное с 70% EtOH. Поместите животное на вершине сухой салфеткой под микроскопом рассечение. Поместите блюдо культуры ткани 35 мм, содержащие завязи Культура СМИ недалеко от Микроскоп рассечение.
  3. С щипцами или микро Рассечение ножницами Ирис сделайте надрез через кожу животного и в брюшную полость, используя осторожность не резать в кишечник. Вытеснить кишечника из брюшной полости и найдите яичников. Экстракт яичников и поместите их в 35-мм тканевой культуры блюдо, содержащие культуры средств массовой информации.
  4. Когда яичники были расчленены от животного, увеличения микроскопа диссекции для того, чтобы лучше визуализировать яичников и любых вложенных ткани. С чистой штрафа отзыв щипцы, удалить все-яичниковой ткани, такие как Бурса и жировой ткани. Будьте осторожны, чтобы сохранить нетронутыми яичников при удалении прилагаемый-яичниковой ткани.
  5. Яичники являются изолированными, перенесите пара в предварительно замоченные клетки культуры вставки несущей пластины 24-ну (см. шаги 1.4.2 и 1.4.3) и отрегулировать громкость среды для обеспечения, что это достаточно, чтобы сохранить орган влажные (без полностью погрузив его).
    Предупреждение: Будьте осторожны, чтобы не засуните отверстие в мембране клетки культуры вставки при передаче яичников.
  6. Место описаны органов в 37 ° C, 5% CO2и атмосферных O2 инкубатора.
  7. Повторите шаги, 2.1-2.6 пока расчлененные и размещены на культуре клеток яичников каждого животного вставить 24-ну пластины, содержащие завязи питательной среды.
  8. Изменения яичников питательной среды каждые 2 дня, используя утепленные аликвоты СМИ завязи от ванну воды 37 ° C и приступить к части 3 протокола на желаемое время экспериментальные точки.

3. ткань фиксации

  1. В 15 мл Конические трубки, подготовьте параформальдегида 4% (PFA) 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) (например, добавить 2 мл 16% PFA электронной микроскопии класса 6 мл ПБС).
    Предупреждение: PFA является опасным веществом и должны быть обработаны под капотом химического.
  2. Исправьте культивировали яичников, без удаления ткани из культуры вставки, охватывая ткани с свежеприготовленный раствор 4% PFA. Уплотнение края пластины с клей (чтобы избежать испарения) и образцы на 4 ° C на ночь.
    Примечание: Чтобы облегчить обработку и целостности тканей, Избегайте, вытесняя яичников из вставки культуры клеток на протяжении всей процедуры. Культивированный яичников, придает поверхности пластины являются выгодными для обработки без повреждения или потери органа.
  3. Ополосните ткань 3 x с 70% EtOH и либо приступить к шаг 4.1 или хранить его в сцинтилляционные флаконов заполнены с 70% EtOH на 4 ° C до дальнейшей обработки.
    Примечание: При использовании ткани эндогенно выражая флуоресцентных белков, хранения образцов с 70% EtOH может значительно уменьшить сигнал. В качестве альтернативы можно промыть и хранятся в PBS с азидом натрия 0,2% (НАН3) ткани. NaN3 является, однако, высоко токсичен и представляет опасность серьезной ингаляции. Стоковый раствор в зонта и обрабатывать ношение надлежащие средства личной защиты, такие как лаборатории пальто и нитриловые перчатки.

4. Вся гора иммунофлуоресценции

  1. Место фиксированных тканей в однократном ПБС в RT минимум 4 ч до permeabilization шаг 4.3.
  2. Подготовьте раствор permeabilization и блокирования решения.
    1. Готовят раствор permeabilization, как описано. В однократном ПБС добавьте 0,2% поливиниловый спирт (PVA), 0,1% раствор (NaBH4) боргидрид натрия (от 12 wt.% в раствор гидроксида натрия (NaOH) 14 М) и 1,5% полиэтиленгликоль трет -octylphenyl эфира (неионных ПАВ детергент). В 50 мл Конические трубки, добавить 5 мл 10 x PBS, 0,1 г ПВА, 50 мкл NaBH4и 750 мкл неионных ПАВ моющего средства, а затем добавить ультрачистая вода до 50 мл и агитировать хорошо при комнатной температуре до тех пор, пока смесь не станет полностью в растворе.
    2. Подготовьте блокирующие решение, как описано. ПБС добавить 0,1% неионные ПАВ стиральный порошок, 0,15% 2,5 метров глицина рН 7,4, 10% нормальной козьего сыворотки, 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА), 0,2% НАН3, 100 единиц/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицин B. приготовить раствор из 2,5 М глицин, растворяя 93,8 g глицина в ультрачистая вода окончательный объем 500 мл (рН 7,4) и Стоковый раствор 10% НАН3 , растворяя 5 g в 50 мл сверхчистой воды; затем в 50 мл Конические трубки Подготовьте блокировки решение, добавив 5 мл 10 x PBS, 50 мкл неионных ПАВ моющего средства, 750 мкл Стоковый раствор глицина, 5 мл сыворотки коза, 1,5 г BSA, 1 мл НАН3 Стоковый раствор и 0,5 мл 100 x акций и пенициллин, стрептомицин, амфотерицин B. Окончательное решение добавьте ультрачистая вода до окончательный объем 50 мл и шприц фильтра.
  3. Удалить и сбросить ПБС из флакона, а затем добавьте достаточно permeabilization решение полностью погружаться в яичниках. Поместите образец в permeabilization растворе на орбитальный шейкер (например, nutator) при комнатной температуре в течение 4 ч.
    Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от толщины орган.
  4. Замените permeabilization решение достаточно блокирования решения полностью погружаться в яичниках. Печать флакона с пластиковой клей и оставить ткани, инкубации в течение не менее 12 ч при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
  5. Подготовка основного антитела разрежения в блокирования решения согласно таблицы производителя.
    Примечание: Обратите внимание, что не все антитела совместимы с таможенного агента. Средний объем необходимых на сэмпл составляет около 750 мкл.
    1. Для количественной оценки ооцитов, используйте TAp63 (маркер ядерных ооцитов) и MVH (цитоплазмы клетки семенозачатка маркер).
      Примечание: Антитела, которые используются в иммунофлуоресценции образы являются мыши анти p63 и кролик анти MVH). Ослабленный первичный гуморальный решение может быть повторно 2 x или больше, если хранить при 4 ° C между пятная протоколы и правильно обработаны, чтобы избежать роста бактерий.
  6. Место вставки, содержащие ткани в пластине 24-Ну и около 750 мкл раствора первичного антитела. Убедитесь, что яичников полностью погружены. Уплотнение пластины с клей к минимуму испарение и оставить ткани, инкубации в течение 4 дней при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
  7. Приготовьте моющий раствор.
    1. Приготовьте моющий раствор, как описано. Сделать ПБС, добавьте моющее неионных ПАВ ПВА и 0,15% 0,2%. В 50 мл Конические трубки добавьте 5 мл 10 x PBS, 0,1 г ПВА, 75 мкл неионных ПАВ моющего средства и ультрачистая вода до окончательный объем 50 мл.
  8. Удаление основного антитела разрежения и добавьте щедрое количество моющего раствора. Всегда убедитесь, что погружаться в яичниках. Разрешить яичников замочить в растворе на ночь при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
  9. Заменить моющего раствора и инкубировать на орбитальный шейкер 2 ч и более.
  10. Повторите шаг 4.9 одно дополнительное время.
  11. Подготовьте вторичное антитело разрежения в блокировании решения.
    Примечание: Вторичные антитела, которые используются являются анти мыши 488 Люминесцентную краску, поднятые в козла и анти кролик 594 Люминесцентную краску, поднятые в козла. Смотрите Шаг 4.5. Средний объем необходимо на сэмпл.
  12. Удаления моющего раствора из яичников и добавить раствор вторичных антител. Защищать от света (обернуть тарелку с алюминиевой фольгой) образцы и печатью пластины с клей для сведения к минимуму испарения. Проинкубируйте образцы на орбитальный шейкер при комнатной температуре в течение 2 дней.
    Примечание: Далее, защищая образцы от света с помощью алюминиевой фольгой во время всех последующих инкубации шаги.
  13. Удалять вторичное антитело решение от образцов и добавить моющий раствор. Инкубируйте на орбитальный шейкер для 8 h.
    Примечание: Если окрашивание 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), добавьте 50 нг/мл DAPI к первому шагу мыть (~ 8 ч инкубации).
  14. Замените моющий раствор для ночь мыть.
  15. При подготовке очистки раствора (см. раздел 5), заменить на ночь, моющего раствора с свежий раствор и хранить пробы на орбитальный шейкер при комнатной температуре.

5. яичник очистки и обработки изображений

  1. Подготовка ScaleS(0), очистка решения.
    1. Подготовка ScaleS(0), очистка решения10 , добавив реагенты в заданной пропорции: 40% D-(-) сорбитол (w/v), 10% глицерина, 4,3 М мочевины и 20% диметилсульфоксида (ДМСО), pH 8,1 (например в 50 мл Конические трубки, добавить 2,5 мл глицерина, 10 г сорбита , 5 мл ДМСО и 12 мл 9 M мочевины для общего объема 25 мл. Mix решение инверсии при 50 ° C за 30 мин и Дега перед использованием).
  2. Удаление моющего раствора и погрузите образцы в очистке раствора. Для лучших результатов сохранить образцы на орбитальный шейкер.
  3. Заменить решение очистки 2 x в день до тех пор, пока ткань становится прозрачным (примерно 2 дня).
  4. После очистки ткани, подготовить образец для воображения, тщательно удалив вставки мембраны, содержащий культивировали яичников с штрафом Совет скальпель и размещение образца на стеклянное скольжение.
  5. Перейти к визуализации образцы на микроскопе способны оптических секционирование.

6. яйцеклетка количественная оценка

Примечание: Существует множество различных компьютерных программ, которые способны дать количественную оценку клетки. Описанные ниже — это протокол для квантификации ооцитов, используя пакет обработки изображений-некоммерческая, Фиджи-ImageJ14.

  1. С помощью проекции плоского максимальная интенсивность Z -стек изображений серии для конкретных клеточных маркеров интерес (без DAPI канал), преобразуйте изображение в черно-белый 8-битного изображения под тип в раскрывающемся списке изображений меню.
  2. В раскрывающемся меню изображения выделите вкладку Настройка , а затем выберите порог.
  3. Вручную отрегулируйте порог до уровня, который наилучшим образом идентифицирует каждый индивидуальный ооцитов. После того, как определяется уровень, нажмите кнопку Применить для создания черно-белое изображение. После завершения, количественно образца, отделяющей используя значок овальной или Freehand .
    Примечание: Фиджи-ImageJ имеет различные параметры для тонкой настройки изображения, которое будет использоваться для количественной оценки частиц. Например, в процесс | Бинарные таб, существуют различные варианты, которые могут быть использованы для улучшения обнаружения того, что будут учитываться. На рисунке 4параметры, используемые для более индивидуализировать фолликулов был Ероде, затем заполнить дырыи наконец водосборных бассейнов.
  4. В раскрывающемся меню анализ выберите анализ частиц. Установите параметры согласно нужное разрешение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол включает 6 основных шагов после рассечения яичников, как указано на рисунке 1. Рисунок 2 , Рисунок 3 , Рисунок 4 выделить наиболее новизну этого протокола, которые включают оптимизацию ткани, очистка для яичников и цельной ткани ооцитов количественной оценки с использованием Фиджи-ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изучение mammalian воспроизведение требует использование и количественная оценка специализированных клеток, которые не регулярно поддаются клеточной культуры. Однако ex vivo культуры системы являются эффективными в сохранении яичников и фолликул жизнеспособности1,15. Во время завязи культуры ткани требует больше площадь поверхности для обмена питательных веществ путем диффузии. Таким образом 5 - дневных мыши яичников являются идеальными в размер и форму ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Ребекка Уильямс и Johanna Dela Cruz от Корнелл BRC Imaging и Эндрю Recknagel за полезные предложения и техническую помощь. Эта работа была поддержана в национальные институты здравоохранения грант S10-OD018516 (Фонду Корнелла Imaging), T32HD057854 к J.C.B. и R01-GM45415 для J.C.S.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микрорассекающие ножницы 4,5", прямые, острые концыRobozRS-5912Микрорассекающие ножницы
Ювелирные щипцы в стиле 4-3/8", стиль 5Integra Miltex17-305XЩипцы с тонким наконечником
Микро Ирис Ножницы 4", прямые, острые концыIntegra Miltex18-1618Микрорассекающие ножницы радужной оболочки или микрорассекающие пружинные ножницы
1X Minimal Основные среды (MEM)ThermoFisher Scientific11090-081
Фетальная бычья сывороткаCorning35011CV
HEPES (1M)Gibco15630080
антибиотик-антимикотик (100X)Gibco15240062используется в шаге 1.3.1
35 мм Обработанная культурой тканей чашкаCorning 430165
Nunc™ 24-луночная несущая пластина для вставок для клеточных культурThermoFisher Scientific141006размер пор: 8 мкм; m
Параформальдегид (PFA)Электронная микроскопия Науки1571016% раствор
1X Фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco10010023
Nutator mixer GyroTwister™ТрехмерныйшейкерLabnet S1000-A-B
Нормальная козья сывороткаVWR103219-578
Бычья сыворотка Белковый (BSA)VWR97061-416
Азид натрия (NaN3)Sigma-AldrichS2002-25G
Раствор борогидрида натрия (NaBH4)Sigma-Aldrich452904-25MLИспользуйте раствор, а не таблетированная или порошковая форма 
Поливиниловый спирт (ПВА)Sigma-AldrichP8136-250GХолодный водорастворимый
Triton™ X-100Sigma-Aldrich93443-100MLполиэтиленгликоль трет-октилфениловый эфир
Шприцевые фильтрыThermoFisher Scientific725-252025 мм
10 мл ШприцыBD309695
мыши антитело к p63 (4A4)Biocare MedicalCM 163AРазведение 1:500
Антитело против MVH кроликаAbcamab13840Разведение 1:600
Alexa Fluor® козий анти-мышь 594ThermoFisher ScientificA-11032Разбавление 1:1000
Alexa Fluor® козий анти-кролик 488ThermoFisher ScientificA-11034Разбавление 1:1000
4,6-Диамидино-2-фенилиндол (DAPI) ThermoFisher Scientific62248
D-(-)сорбитSigma-Aldrich240850-100G
ГлицеринSigma-AldrichG9012-100ML
МочевинаSigma-AldrichU5378-500G
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2650-5X10ML
FIJI-ImageJПрограммное обеспечение для обработки изображений
Одноразовые пластиковые переводные пипеткиVWR414044-034

Ссылки

  1. O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
  2. Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  3. Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
  4. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  5. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).
  6. Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
  7. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242(2015).
  8. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  12. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  13. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497(2002).
  16. Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
  17. Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
  18. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10(2011).
  19. Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Fiji ImageJ
Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.