Синаптических пузырьков (SV) Велоспорт-это основной механизм межклеточные связи в нейрональных синапсах. Поглощение красителя FM и выпуска являются основным средством количественно опробование SV эндо - и экзоцитоз. Здесь мы сравниваем все методы стимуляции для привода FM1-43 Велоспорт на синапсы модели нервно-Джанкшен (NMJ) дрозофилы .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
FM красители используются для изучения цикла синаптических пузырьков (SV). Эти зонды амфифильными есть гидрофильные головы и гидрофобных хвост, делая их водорастворимый с возможностью обратного въезда и выезда из мембраны липидных бислоев. Эти стириловых красителей относительно не флуоресцентные в водной среде, но вызывает вставку в наружный листок плазматической мембраны > 40 X увеличение флуоресценции. В нейрональных синапсах FM красители учитываются во время SV эндоцитоза, ставших предметом торговли, как внутри, так и между SV бассейны и выпущенные с SV экзоцитоз, обеспечивая мощный инструмент для визуализации Пресинаптический этапы синапсах. Основная генетических модель глутаматергические синапсов и функции — дрозофилы нервно-Джанкшен (NMJ), где FM красителя изображений широко используется для количественного определения SV динамика в широком диапазоне условий, мутант. В NMJ синаптических терминал легко доступны, с массивом красивых больших синаптической boutons идеально подходит для визуализации приложений. Здесь, мы сравним и контраст три способа стимулирования дрозофилы NMJ водить зависящих от деятельности FM1-43 краситель поглощения/выпуска: 1) Ванна применение высокого [K+] depolarize нервно-мышечных тканей, 2) всасывания электрода двигательного нерва стимуляция depolarize Пресинаптический нервных терминал и 3) целевых трансгенных выражение channelrhodopsin вариантов для света стимулирует, пространственного управления деполяризации. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки для изучения генетической мутации воздействия на цикл SV на дрозофилы NMJ. Мы будем обсуждать эти преимущества и недостатки для оказания помощи при выборе стимуляции подхода, а также методологий, специфичные для каждой стратегии. Кроме флуоресцентный изображений, FM красители могут быть photoconverted электронно плотные сигналы визуализируется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) для изучения механизмов цикла SV на ультраструктурные уровне. Мы предоставляем сравнения конфокальных и электронной микроскопии изображений из различных методов дрозофилы NMJ стимуляции, чтобы помочь при выборе будущих экспериментальных парадигм.
Введение
СИНАПС красиво характеризуется глутаматергические дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен (NMJ) модель использовалась для изучения формирования синапсов и функции с широкий спектр генетических возмущений1. Мотонейрона терминал состоит из нескольких ветвей аксона, каждый с многими расширенного синаптической boutons. Эти емкие Варикоз (до 5 мкм в диаметре) содержат все синапсах механизма, включая единый глутаматергические синаптических пузырьков (СВС; ~ 40 Нм в диаметре) в цитозольной резерва и легко публикуемой бассейна2. Эти пузырьки док на пресинаптической мембраной плазмы фьюжн сайта активных зон (АЗС), где экзоц....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. личиночной клей рассечение
- Тщательно смешайте 10 частей силиконового эластомера базы с 1 частью силиконового эластомера Вулканизирующий агент из эластомера kit (Таблица материалов).
- Пальто coverslips 22 x 22 мм стекла с эластомера и лечения на горячей плите на 75 градусов на несколько часов (пока больше не липкие на ощупь).
- Место одного стекла с покрытием из эластомера coverslip в зале рассечение на заказ plexi стекла (рис. 1, внизу) в рамках подготовки к личиночной рассечение.
- Приготовьте клей пипетки от капиллярной боросиликатного стекла, используя стандартный микроэлектродные ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает поток работы для деятельности зависимых FM красителя изображений протокол. Эксперимента всегда начинается с же личиночной клей рассечение, независимо от метода стимуляции впоследствии используется. Рисунок 1a является схема расчлененных личинки, показывая воспалении брюшины шнур (VNC), излучающих нервы и мышцы шаблон неоднократно hemisegmental. VNC удаляется и подготовки купались в 4 μm раствор FM1-43 (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Высокое [K+] физиологический деполяризующий стимуляция является на сегодняшний день самым простым из трех вариантов для зависящих от деятельности FM краситель Велоспорт, но вероятно наименее физиологических29. Этот простой метод depolarizes каждой доступной клетки тела животного и поэтому не позволяют направлены исследования. Это может быть возможность локально применять высокие [K+] физраствора с микропипеткой, но это будет по-прежнему depolarize pre/postsynaptic клетки и ве.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующие интересы.
Благодарности
Мы благодарим членов Broadie лаборатории за вклад в эту статью. Эта работа была поддержана низ R01s MH096832 и MH084989 к.б. и низ лектор стипендий F31 MH111144 для D.L.K.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| SylGard 184 Набор силиконовых эластомеров Fisher | Scientific | NC9644388 | Для установки на защитное стекло для вскрытия |
| Микроскоп Защитное стекло 22x22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | Для установки SylGard для препарирования |
| Алюминиевая верхняя горячая пластина Тип 2200 | Термолин | HPA2235M | Для отверждения стекла SylGard |
| Plexi стеклянная камера для вскрытия | Н/Д Н/ | Д | Ручная работа |
| Капилляры из боросиликатного стекла | WPI | 1B100F-4 | Для изготовления всасывающих и клеевых микропипеток |
| Лазерный пуллер для микропипеток | Инструмент Sutter | P-2000 | Для изготовления всасывающих и клеевых микропипеток |
| Tygon E-3603 Лабораторные трубки | Компонент Supply Co. | TET-031A | Для рта и отсасывающей пипетки |
| P2 наконечник для пипетки | США Scientific | 1111-3700 | Для ротовой пипетки |
| 0,6 мл Крышка пробирки Eppendorf | Fisher Scientific | 05-408-120 | Используется для нанесения клея для вскрытия |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond Клей используется для вскрытия | |
| Хлорид калия | Fisher Scientific | P-217 | Форсалин |
| Хлорид натрия | Millipore Sigma | S5886 | Для физиологического раствора |
| Хлорид магния | Fisher Scientific | M35-500 | Для физиологического раствора |
| Дигидрат хлорида кальция | Millipore | Sigma C7902 | Для солевого раствора |
| сахароза | Fisher | Scientific S5-3 | Для физиологического раствора |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Для физиологического раствора |
| HRP: Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | Для маркировки нейронных мембран |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | Для манипуляций с личинками |
| Пинцет Dumont Dumostar #5 | WPI | 500233 | Используется при вскрытии |
| 7 см Микроножницы McPherson-Vannas (лезвия 3 мм) | WPI | 14177 | Используется во время вскрытия |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Флуоресцентный стириловый краситель |
| Цифровой таймер | VWR | 62344-641 | Для синхронизации загрузки/выгрузки FM-красителя |
| LSM 510 META лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп | Zeiss | Для визуализации флуоресцентных маркеров | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Программное обеспечение для визуализации на конфокальном | |
| HeNe 633 нм лазере | Lasos | Для возбуждения HRP:647 во время визуализации | |
| Аргон 488 нм лазер | Lasos | Для возбуждения FM-красителя во время визуализации | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | Для огненной полировки стеклянных микропипеток |
| 20 мл Шприц Slip Tip | BD | 301625 | Для всасывания аксона для электрической стимуляции. |
| Микроманипулятор (магнитная основа) | Narishige | MMN-9 | Для управления всасывающим электродом для электростимуляции |
| Стимулятор | Grass | S48 | Для управления светодиодной и электростимуляцией |
| Zeiss Axioskop Микроскоп | Zeiss | Используется во время электростимуляции. | |
| 40X Achroplan Водный иммерсионный объектив | Zeiss | Используется во время электростимуляции и конфокальной визуализации | |
| All-trans Retina | Millipore Sigma | R2500 | Существенный кофактор для микроскопа ChR2 |
| Zeiss Stemi с портом камеры | Zeiss | 2000-C | Используется во время стимуляции родопсина |
| LED 470 нм | ThorLabs | M470L2 | Используется для активации ChR |
| Драйвер светодиода T-Cube | ThorLabs | LEDD1B | Для управления светодиодным блоком |
| питания | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | Для питания светодиодного |
| измерителя оптической мощности и энергии | ThorLabs | PM100D | Для измерения интенсивности светодиодов |
Ссылки
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
