Методическая статья

Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции

DOI:

10.3791/57765

⸱

24 мая 2018 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синаптических пузырьков (SV) Велоспорт-это основной механизм межклеточные связи в нейрональных синапсах. Поглощение красителя FM и выпуска являются основным средством количественно опробование SV эндо - и экзоцитоз. Здесь мы сравниваем все методы стимуляции для привода FM1-43 Велоспорт на синапсы модели нервно-Джанкшен (NMJ) дрозофилы .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM красители используются для изучения цикла синаптических пузырьков (SV). Эти зонды амфифильными есть гидрофильные головы и гидрофобных хвост, делая их водорастворимый с возможностью обратного въезда и выезда из мембраны липидных бислоев. Эти стириловых красителей относительно не флуоресцентные в водной среде, но вызывает вставку в наружный листок плазматической мембраны > 40 X увеличение флуоресценции. В нейрональных синапсах FM красители учитываются во время SV эндоцитоза, ставших предметом торговли, как внутри, так и между SV бассейны и выпущенные с SV экзоцитоз, обеспечивая мощный инструмент для визуализации Пресинаптический этапы синапсах. Основная генетических модель глутаматергические синапсов и функции — дрозофилы нервно-Джанкшен (NMJ), где FM красителя изображений широко используется для количественного определения SV динамика в широком диапазоне условий, мутант. В NMJ синаптических терминал легко доступны, с массивом красивых больших синаптической boutons идеально подходит для визуализации приложений. Здесь, мы сравним и контраст три способа стимулирования дрозофилы NMJ водить зависящих от деятельности FM1-43 краситель поглощения/выпуска: 1) Ванна применение высокого [K+] depolarize нервно-мышечных тканей, 2) всасывания электрода двигательного нерва стимуляция depolarize Пресинаптический нервных терминал и 3) целевых трансгенных выражение channelrhodopsin вариантов для света стимулирует, пространственного управления деполяризации. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки для изучения генетической мутации воздействия на цикл SV на дрозофилы NMJ. Мы будем обсуждать эти преимущества и недостатки для оказания помощи при выборе стимуляции подхода, а также методологий, специфичные для каждой стратегии. Кроме флуоресцентный изображений, FM красители могут быть photoconverted электронно плотные сигналы визуализируется с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) для изучения механизмов цикла SV на ультраструктурные уровне. Мы предоставляем сравнения конфокальных и электронной микроскопии изображений из различных методов дрозофилы NMJ стимуляции, чтобы помочь при выборе будущих экспериментальных парадигм.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

СИНАПС красиво характеризуется глутаматергические дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен (NMJ) модель использовалась для изучения формирования синапсов и функции с широкий спектр генетических возмущений1. Мотонейрона терминал состоит из нескольких ветвей аксона, каждый с многими расширенного синаптической boutons. Эти емкие Варикоз (до 5 мкм в диаметре) содержат все синапсах механизма, включая единый глутаматергические синаптических пузырьков (СВС; ~ 40 Нм в диаметре) в цитозольной резерва и легко публикуемой бассейна2. Эти пузырьки док на пресинаптической мембраной плазмы фьюжн сайта активных зон (АЗС), где экзоцитоз опосредует выпуск нейромедиатора глутамата для транс-синаптической связи. Впоследствии СВС извлекаются из плазматической мембраны через поцелуй и побегите рециркуляции или Клатрин опосредованный эндоцитоз (CME) для повторного exo/эндоцитоза циклов. Дрозофилы NMJ легко доступны и хорошо подходит для изоляции и характеризующие SV цикла мутантов. Использование вперед генетических экранов, Роман мутации привели к выявлению новых генов критическое для SV цикла3. Кроме того обратный генетические подходы, начиная с уже известных генов привели к прояснению новых механизмов SV цикла через тщательное описание мутант Велоспорт фенотипов4. Дрозофилы NMJ почти идеально как экспериментальный синаптических подготовка для рассечения SV эндоцитоза и экзоцитоз механизмов через методы для оптически трек везикул Велоспорт в синапсах.

Широкий спектр флуоресцентные маркеры позволяют визуального отслеживания во время Велоспорт динамика пузырьков, но наиболее универсальным являются аналогами краситель FM, которые впервые синтезирован Мао, ф., и др. 5. структурно, FM красители содержат гидрофильные головы и липофильных хвост, подключенных через ароматическое кольцо, с центральным регионом, присвоении спектральных свойств. Эти стириловых красителей обратимо разделов в мембранах, не «триггер» между мембраны листовки и поэтому никогда не бесплатно в цитозоле и гораздо более флуоресцентные в мембранах, чем воды5. Реверсивные вставки липидного бислоя вызывает увеличение разницей флуоресценции6. В нейрональных синапсах Классический FM краска маркировки эксперименты состоят из купания синаптических подготовки с красителем во время расшатывания стимуляции для загрузки краситель через SV эндоцитоз. Внешние краситель затем смыл и SV цикла арестован в растворе кальция бесплатный звонок для изображения загружены синапсы7. Второй раунд стимуляции в бане бесплатно краска триггеров релиз FM через экзоцитоз, процесс, который может следовать путем измерения снижение интенсивности флуоресценции. SV населения из одного везикул в бассейны, содержащих сотни везикулы может быть количественно Мониторим6,7. FM красители были использованы для рассечения зависит от активности мобилизации функционально различных бассейнов SV и сравнить поцелуй и побегите против CME Велоспорт8,9. Этот метод был изменен для отдельно пробирного вызывали, спонтанной и миниатюрные синаптических цикла мероприятия (с весьма чувствительной оборудованием для обнаружения изменения очень маленькие флуоресценции и уменьшить Фотообесцвечивание)10. Анализов могут быть расширены до уровня ультраструктурных photoconverting флуоресцентные FM сигнала в электронно плотные этикетку для передачи электронной микроскопии11,12,13,14 .

Исторически купание синаптических препаратов в высокой концентрации калия (далее именуемые как «high [K+]») был методом выбора для расшатывания стимуляции заставить SV Велоспорт; Начиная от лягушки холинергических NMJ5, культивированный грызунов мозга Нейроны гиппокампа15, до16,модель дрозофилы глутаматергические NMJ17. Этот высокий [K+] подход прост, не требует специализированного оборудования и поэтому доступен для большинства лабораторий, но имеет ограничения для приложений и интерпретации данных. Гораздо более физиологически соответствующий метод заключается в использовании всасывания электрода электростимуляции нервов4,5,12. Этот подход диски действий потенциал распространения для прямой стимуляции Пресинаптический нерва терминала, и результаты можно непосредственно по сравнению с электрофизиологических анализов синапсах функции13,14, 15, но требует специализированного оборудования и технически гораздо более сложной. С появлением Оптогенетика использование channelrhodopsin нейронной стимуляции имеет дополнительные преимущества, включая контроль пространственно-временных канала выражения с использованием двоичной системы Gal4/Уан20. Этот подход является технически гораздо проще, чем всасывания электрод стимуляции и требует не более чем очень дешевые светодиодный источник света. Здесь, мы используем изображения FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) пиридиния дибромид) как сравнить и сопоставить эти три различных стимуляции методы на дрозофилы NMJ: простой средней [K+ ], сложных электрических и новой channelrhodopsin подходы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. личиночной клей рассечение

  1. Тщательно смешайте 10 частей силиконового эластомера базы с 1 частью силиконового эластомера Вулканизирующий агент из эластомера kit (Таблица материалов).
  2. Пальто coverslips 22 x 22 мм стекла с эластомера и лечения на горячей плите на 75 градусов на несколько часов (пока больше не липкие на ощупь).
  3. Место одного стекла с покрытием из эластомера coverslip в зале рассечение на заказ plexi стекла (рис. 1, внизу) в рамках подготовки к личиночной рассечение.
  4. Приготовьте клей пипетки от капиллярной боросиликатного стекла, используя стандартный микроэлектродные съемник для получения желаемого конусность и Совет размер.
  5. Аккуратно перерыв с кончика микропипеткой и на другом конце, прикрепить 2 футов гибкой пластиковой трубки (1/32" внутренний диаметр, ID 3/32" наружный диаметр, ОД; 1/32" стены; Таблица материалов) с уст фитинг (наконечник пипетки P2).
  6. Заполните небольшой контейнер (0,6 мл Eppendorf трубка Крышка) с небольшого количества клея (Таблица материалов) в рамках подготовки к личиночной диссекции (~ 20 мкл).
  7. Заполнить камеры с солевой раствор (в мм): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 сахарозы и 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic кислоты (HEPES) рН 7,2.
  8. Добавить анти хрен пероксидазы (ПХ) антитело проспряганное Alexa Fluor 647 (анти-HRP:647; разбавить 1:10 на складе 1 мг/мл) для этикетирования NMJ Пресинаптический терминала во время вскрытия21,22.
  9. С помощью тонкой кистью (размер 2), удалите блуждающих третьего возраста из флакона пищи и на Стекло покровное эластомера покрытием.
  10. Заполните микропипеткой кончик стекла с небольшого количества клея с помощью отрицательных воздуха давление, создаваемое рот с насадкой (шаг 1.5).
  11. Положение личинка спинной стороне вверх с щипцами и клей голову эластомера покрытием coverslip с небольшой капли клея, используя положительное давление воздуха через рот.
  12. Повторите эту процедуру с заднего конца личинка, убедившись, что животное растягивается натянуты между двумя клей вложения.
  13. С помощью ножниц (лезвия 3 мм; Таблица материалов), сделать горизонтальный разрез (~ 1 мм) на задней и вертикальный разрез вдоль наспинная срединная.
  14. С помощью тонкой щипцы (#5, Таблица материалов), аккуратно удалить спинной трахеи, кишечнике, жир тела и других внутренних органов, охватывающих мускулатура.
  15. Повторите процедуру склеивания для четырех стенки тела закрылки, убедившись, что мягко растянуть тело стены горизонтально и вертикально.
  16. Поднимите воспалении брюшины шнур (VNC) с помощью щипцов, тщательно вырезать нервы мотора с ножницами, а затем полностью удалить VNC.
  17. Замените рассечение солевых Ca2 +-бесплатно физраствора (же, как выше рассечение солевых без CaCl2) остановить SV Велоспорт.

2. вариант 1: Высокий [K+] FM краситель загрузки

  1. От Стоковый раствор FM1-43 (4 мм) добавьте 1 мкл в 1 мл 90 мм несогретом растворе (высокая [K+] в солевых рассечение) для окончательного концентрации 4 мкм.
  2. С помощью пипетки, заменить Ca2 +-бесплатный saline на тепловизионные камеры с высокой раствор красителя [K+] FM стимулировать поглощение красителя эндоцитоза SV.
  3. Немедленно начать цифровой таймер на предопределенное время высокого [K+] расшатывания периода стимуляции (например., 5 мин; Рисунок 2).
  4. Для подтверждения здорового личиночной подготовки, отметить сильные сокращения мускулатуры в течение всего периода деполяризации высокой [K+].
  5. Когда заканчивается период таймера, быстро удалить высокой раствор красителя [K+] FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  6. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения высокой раствор красителя [K+] FM удаляется полностью.
  7. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.

3. томография: Конфокальная микроскопия

  1. Используйте вертикальный Конфокальный микроскоп с 40 X цель погружения воды изображение NMJ краситель флуоресцирования (Прочие микроскопы могут использоваться).
  2. Изображения мышц 4 NMJ абдоминальные сегменты 2-4 (другие NMJs может быть воспроизведен образ) и собирать изображения с помощью соответствующего программного обеспечения (Таблица материалов).
  3. Используйте HeNe 633 нм лазер для возбуждения HRP:647 (с Лонг pass фильтр > 635 нм) и аргон 488 нм лазер для возбуждения FM1-43 (с полосовой фильтр 530-600 Нм).
  4. Оперативно Определите оптимальный усиление и смещение для обоих каналов.
    Примечание: Эти настройки будут остаются постоянными на протяжении всего эксперимента.
  5. Возьмите конфокальный Z-стек через весь выбранный NMJ сверху HRP-отмечен в нижней части синаптического терминала.
  6. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц) для обеспечения избыточного точное же NMJ после FM красителя разгрузки.

4. Высокая [K+] стимуляции: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатный физраствора с высокой saline [K+] (без краски FM1-43) для привода деполяризации, SV экзоцитоз и краска релиз.
  2. Немедленно начать цифровой таймер для заранее продолжительность периода высокой стимуляции [K+] (например., 2 мин; Рисунок 2).
  3. Когда заканчивается период таймера, немедленно удалите высокой saline [K+] и замените Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  4. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения высокой saline [K+] полностью удаляется.
  5. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  6. Убедитесь в том, что изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

5. вариант 2: Электрическая стимуляция FM краситель загрузки

  1. Подготовьте всасывающий пипетки с помощью съемника микроэлектродные (Таблица материалов) для получения требуемых конусность и Совет размер.
  2. Огонь польский микроэлектродные наконечник с микро Кузница пока одного двигательного нерва может всасывается с плотную посадку.
  3. Сползите всасывания пипетки на держатель электрода на микроманипулятор и прикрепить к длинные гибкие пластиковые трубы и шприц.
  4. Задать параметры стимулятор (например., 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 5 минут (рис. 2) или 1 мин (рис. 3)).
  5. Заменить Ca2 +-бесплатный saline на личиночной подготовки с выше FM1-43 физраствора (4 мкм; CaCl 1 мм2) на стенде электрофизиологии.
  6. Положите подготовку на этапе микроскопа и поднять стадии до тех пор, пока личинки и всасывания пипеткой находятся в фокусе (40 X цель погружения в воду).
  7. Всасывать цикл резки двигательного нерва, иннервирующих выбранного hemisegment с отрицательным воздуха давление, создаваемое шприц в всасывания электрода.
  8. Протестируйте функцию всасывания электрод с короткий всплеск стимуляции во время визуально мониторинг для мышц в выбранной hemisegment.
  9. Стимулировать двигательного нерва, с использованием выбранных параметров (шаг 5.4) водить SV эндоцитоза и поглощение красителя FM1-43 (рис. 2).
  10. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения, чтобы полностью удалить раствор красителя FM1-43.
  11. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленного изображений по протоколу конфокальный изображений от выше.
  12. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц), обеспечить доступ к точным же NMJ после разгрузки краситель FM.

6. Электрическая стимуляция: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатно физраствора с регулярной физраствора (без краски FM1-43) и место подготовки обратно на сцене Рог электрофизиологии.
  2. Установите параметры стимулятором для разгрузки (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 2 мин (рис. 2) или 20 s (рис. 3)).
  3. Сосать же двигательного нерва в же электрода, как указано выше и затем стимулировать активировать экзоцитоз SV и FM1-43 краситель релиз.
  4. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения внешнего краска удаляется полностью.
  5. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  6. Обеспечить, чтобы изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

7. вариант 3: Channelrhodopsin стимуляции FM краситель загрузки

  1. Повышение ChR2-выражая личинки на пищевые продукты, содержащие ChR2 одним фактором все транс сетчатки (растворяют в этаноле; 100 мкм конечная концентрация).
  2. Место личиночной подготовки в зале оргстекла на вскрытие микроскопа с портом камеры.
  3. Прикрепить синий светодиод (470 Нм; Таблица материалов) для программируемых стимулятор с помощью коаксиального кабеля и светодиод в порт камеры.
  4. Луч света фокус синий светодиод на функцию расчлененных личинок, используя функцию масштабирования Микроскоп.
  5. Заменить Ca2 +-бесплатный saline на личиночной подготовки с выше FM1-43 физраствора (4 мкм; CaCl 1 мм2) на optogenetic стадии.
  6. Установите параметры LED с помощью стимулятора (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 5 мин (рис. 2)).
  7. Запустите легкой стимуляции и отслеживать с помощью таймера для заранее определенной продолжительности периода стимуляции optogenetic (например, 5 мин; Рисунок 2).
  8. Когда таймер останавливается, быстро удалить раствор красителя FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  9. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения раствор красителя FM удаляется полностью.
  10. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа с помощью визуализации протокола от выше.
  11. Обратите особое внимание образ NMJ (сегмент, стороны и мышц), обеспечить доступ к точным же NMJ после разгрузки краситель FM.

8. Channelrhodopsin стимуляции: FM краситель разгрузки

  1. Заменить Ca2 +-бесплатный физраствора с регулярной физраствора (без краски FM1-43) на рассечение микроскопа с камерой порт LED сосредоточены на личинки.
  2. Установите параметры стимулятором для разгрузки (например, 15 V, частота 20 Гц, 20 мс продолжительность и время 2 мин (рис. 2)).
  3. Запустите легкой стимуляции и отслеживать с помощью таймера в течение предопределенного периода стимуляции optogenetic (например, 2 мин; Рисунок 2).
  4. Когда заканчивается период таймера, быстро удалить раствор красителя FM и заменить Ca2 +-бесплатный солевых чтобы остановить SV Велоспорт.
  5. Мыть в быстрой последовательности с Ca2 +-бесплатно солевой раствор (5 x 1 мин) для обеспечения внешнего краска удаляется полностью.
  6. Поддерживать личиночной подготовки в свежих Ca2 +-бесплатный физиологического раствора для немедленной обработки изображений с конфокального микроскопа.
  7. Обеспечить, чтобы изображение FM1-43 краситель флуоресценции в же NMJ отметили выше, используя те же конфокальный параметры.

9. флуоресценции количественная оценка

  1. Загрузить изображение в изображении J (низ открытым исходным кодом) и создать проекцию максимальной интенсивности, щелкнув изображение | Стеки | Проект Z.
  2. Использование анти-HRP:647 канал, перейдите к изображение | Отрегулируйте | Порог и слайд верхней панели инструментов до тех пор, пока просто NMJ выделена.
  3. Использование палочки инструмент, нажмите на NMJ. Если NMJ разрывными, удерживайте нажатой кнопку Shift и выберите все детали.
  4. Изменить изображение на канал краситель FM1-43 и перейти на анализ | Мера измерения флуоресценции.
  5. Повторите шаги 9.1-9.4 для «выгрузить» изображения от же NMJ (выявленных сегмента, стороны и мышц).
  6. Чтобы получить процент краска, которая была выгружена, принять отношение интенсивности флуоресценции выгрузки/загрузки.
    Примечание: Эта процедура может быть изменен для анализа флуоресцирования на основе бутон за бутона, с помощью инструментов «Овал» или «от руки» выбор. Флуоресценции фона может быть вычтен путем отбора проб мышечных флуоресценции. Агенты также могут добавляться уменьшить этот фон.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 показывает поток работы для деятельности зависимых FM красителя изображений протокол. Эксперимента всегда начинается с же личиночной клей рассечение, независимо от метода стимуляции впоследствии используется. Рисунок 1a является схема расчлененных личинки, показывая воспалении брюшины шнур (VNC), излучающих нервы и мышцы шаблон неоднократно hemisegmental. VNC удаляется и подготовки купались в 4 μm раствор FM1-43 (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокое [K+] физиологический деполяризующий стимуляция является на сегодняшний день самым простым из трех вариантов для зависящих от деятельности FM краситель Велоспорт, но вероятно наименее физиологических29. Этот простой метод depolarizes каждой доступной клетки тела животного и поэтому не позволяют направлены исследования. Это может быть возможность локально применять высокие [K+] физраствора с микропипеткой, но это будет по-прежнему depolarize pre/postsynaptic клетки и ве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов Broadie лаборатории за вклад в эту статью. Эта работа была поддержана низ R01s MH096832 и MH084989 к.б. и низ лектор стипендий F31 MH111144 для D.L.K.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
SylGard 184 Набор силиконовых эластомеров FisherScientificNC9644388Для установки на защитное стекло для вскрытия
Микроскоп Защитное стекло 22x22-1Fisherbrand12-542-BДля установки SylGard для препарирования
Алюминиевая верхняя горячая пластина Тип 2200ТермолинHPA2235MДля отверждения стекла SylGard
Plexi стеклянная камера для вскрытияН/Д Н/ДРучная работа
Капилляры из боросиликатного стеклаWPI1B100F-4Для изготовления всасывающих и клеевых микропипеток
Лазерный пуллер для микропипетокИнструмент SutterP-2000Для изготовления всасывающих и клеевых микропипеток
Tygon E-3603 Лабораторные трубкиКомпонент Supply Co.TET-031AДля рта и отсасывающей пипетки
P2 наконечник для пипеткиСША Scientific1111-3700Для ротовой пипетки
0,6 мл Крышка пробирки EppendorfFisher Scientific05-408-120Используется для нанесения клея для вскрытия
Vetbond 3MWPIvetbond Клей используется для вскрытия
Хлорид калияFisher ScientificP-217Форсалин
Хлорид натрияMillipore SigmaS5886Для физиологического раствора
Хлорид магнияFisher ScientificM35-500Для физиологического раствора
Дигидрат хлорида кальцияMilliporeSigma C7902Для солевого раствора
сахарозаFisherScientific S5-3Для физиологического раствора
HEPESMillipore SigmaH3375Для физиологического раствора
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021Для маркировки нейронных мембран
PaintbrushWinsor & Newton94376864793Для манипуляций с личинками
Пинцет Dumont Dumostar #5WPI500233Используется при вскрытии
7 см Микроножницы McPherson-Vannas (лезвия 3 мм)WPI14177Используется во время вскрытия 
FM1-43Fisher ScientificT35356Флуоресцентный стириловый краситель
Цифровой таймерVWR62344-641Для синхронизации загрузки/выгрузки FM-красителя 
LSM 510 META лазерно-сканирующий конфокальный микроскопZeissДля визуализации флуоресцентных маркеров
Zen 2009 SP2 version 6.0ZeissПрограммное обеспечение для визуализации на конфокальном
HeNe 633 нм лазереLasosДля возбуждения HRP:647 во время визуализации
Аргон 488 нм лазерLasosДля возбуждения FM-красителя во время визуализации
Micro-ForgeWPIMF200Для огненной полировки стеклянных микропипеток
20 мл Шприц Slip TipBD301625Для всасывания аксона для электрической стимуляции.
Микроманипулятор (магнитная основа)NarishigeMMN-9Для управления всасывающим электродом для электростимуляции
СтимуляторGrassS48Для управления светодиодной и электростимуляцией
Zeiss Axioskop МикроскопZeissИспользуется во время электростимуляции.
40X Achroplan Водный иммерсионный объективZeissИспользуется во время электростимуляции и конфокальной визуализации
All-trans RetinaMillipore SigmaR2500Существенный кофактор для микроскопа ChR2
Zeiss Stemi с портом камерыZeiss2000-CИспользуется во время стимуляции родопсина
LED 470 нмThorLabsM470L2Используется для активации ChR
Драйвер светодиода T-CubeThorLabsLEDD1BДля управления светодиодным блоком
питанияCincon Electronics Co.TR15RA150Для питания светодиодного
измерителя оптической мощности и энергииThorLabsPM100DДля измерения интенсивности светодиодов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790(2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133(2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaFM1 43FM1 43

Похожие статьи