Анализ последовательности гена иммуноглобулинов в хронический лимфоцитарный лейкоз: От пациента материала для интерпретации последовательности

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, что детали технические аспекты и основные требования для обеспечения надежной анализа последовательностей гена IG больных хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), основанный на опыт, накопленный Европейской исследовательской инициативы по CLL (ЭРИК).

Аннотация

Во время созревания клетки B сложный процесс иммуноглобулина (IG) гена V (D) J рекомбинации в сочетании с соматической Гипермутационный (ГИМ) порождает уникальную последовательность ДНК в рамках каждой отдельной клетки B. Поскольку B клетки злокачественных опухолей является результатом клоновых расширения одной ячейки, генов IG представляют уникальную подпись молекулярной общих для всех злокачественных клеток в пределах конкретного пациента; Таким образом перестановки генов IG может использоваться как клоновых маркеров. Помимо служит важным клоновых идентификатор, последовательность гена IG может выступать в качестве «молекулярной сроки», так как он связан с определенных этапах своего развития и таким образом отражает историю B клеток, участвующих в неопластической трансформации. Кроме того для некоторых злокачественных опухолей, в частности хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), последовательность гена IG проводит прогностические и потенциально интеллектуальный потенциал. Что говорит, экстраполируя значимые выводы из анализа последовательностей гена IG будет невозможно, если надежные методы и инструменты были не доступны для оказания помощи в их анализ. Эта статья, опираясь на богатый опыт Европейской исследовательской инициативы по ХЛЛ (Эрик), детали технические аспекты и основных требований, необходимых для обеспечения анализа последовательностей гена IG надежных и воспроизводимых в ХЛЛ, тест, который в настоящее время рекомендуется для всех ХЛЛ больных до начала лечения. Говоря более конкретно различные аналитические этапы описаны, начиная от идентификации перераспределение генов IG clonotypic и определение нуклеотидной последовательности для точной клинической интерпретации данных последовательности гена IG.

Введение

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), наиболее распространенной формой лейкемии у взрослых в западных странах, характеризуется клоновых расширения зрелых опухолевой клетки B¹. С клинической точки зрения течения болезни является чрезвычайно переменным с некоторые пациенты испытывают агрессивной заболевания, требующие лечения очень рано после диагноза и часто рецидива или будучи огнеупорные для терапии. Это резко контрастирует с значительная часть пациентов (~ 30%), которые представляют праздного болезнью, никогда не требуют лечения и похож на здоровых людей, соответствует возрасту²продолжительность жизни. Это клиническая неоднородность отражается в разнообразии молекулярных аномалии в ХЛЛ пациентов, которые в конечном итоге патогенезом и прогрессирования болезни³.

Установление точного диагноза ХЛЛ обычно прост, однако, вышеупомянутые клиническая неоднородность может препятствовать эффективному управлению ХЛЛ пациентов и подчеркивает необходимость прогностические и прогнозирования маркеров, которые могли бы помочь в лечения решений². Многочисленные исследования была предпринята попытка усовершенствовать прогнозирование ХЛЛ, кульминацией обилие Роман клинических и биологических маркеров, будучи предлагаемой⁴. Мутационного статуса гена clonotypic Иммуноглобулин тяжелые переменной (IGHV) является одним из самых надежных прогностических маркеров в ХЛЛ, главным образом тем, что (i) он остается стабильной во времени и как болезнь прогрессирует, и (ii) оно не зависит от других клинические и биологических параметров⁵. Что несмотря на это, очень немногие, если таковые маркеров, в том числе IGHV мутационного статуса, в настоящее время применяются в повседневной клинической практике на момент постановки диагноза.

Первоначальные доклады о клинической полезности секвенирования генов IG в ХЛЛ датируются 1999, когда 2 независимых исследований сообщили, что пациенты с без или минимальными соматическими Гипермутационный (ГИМ) нагрузки (unmutated ХЛЛ, U-CLL) имеют хуже прогноз, чем перевозки больных выше ГИМ бремя (мутировавших ХЛЛ, M-CLL)^6,7. Говоря более конкретно, U-CLL группа состояла из случаев, укрывательство clonotypic IGHV генов с мало или совсем нет ГИМ и следовательно высокий процент личности к ближайшей гена IGHV микрофлорой (≥98%), тогда как M-CLL состояла из случаев с высокой нагрузкой мутационного (процент личности Ближайший IGHV гена микрофлорой < 98%). Начиная с этих ранних исследований постоянно продемонстрировал, что U-CLL случаев отображения короче время к первая лечения (TTFT) и общей выживаемости (ОС) по сравнению с М-CLL.

В Оглядываясь назад эти исследования семенных подчеркнул ключевую роль B клеточного рецептора (BcR) IG в ХЛЛ pathobiology, проложив тем самым путь для обширных исследований в ХЛЛ microenvironmental взаимодействия, которые, в свою очередь, привело к более всеобъемлющего курса биологической неоднородности этой болезни^8,9. Более поздние исследования предоставили дополнительную поддержку для важности иммуногенетической анализов в ХЛЛ, раскрывая, что отдельные случаи могут кластера в подмножества благодаря обмену (квази) идентичные последовательности гена BcR IG, явление называется BcR IG стереотипии^{10 ,11,12,13}. Накапливая доказательства поддерживает понятие, что пациенты, присвоенный же стереотипных подмножество гавань аналогичные свойства clinicobiological, которые четко отделить их от других ХЛЛ больных в пределах одной и той же категории ГИМ, но с различных последовательностей генов IG; действительно было сообщено, что категоризацию ХЛЛ пациентов, основанные на BcR IG стереотипии далее уточняет основную сегрегации ХЛЛ пациентов в U-CLL или M-CLL группы^{14,,1516, 17 , 18 , 19 , 20}.

С клинической точки зрения следует отметить, что, как представляется, состояние ГИМ IGHV гена clonotypic коррелируют с конкретным ответом на chemoimmunotherapy. В частности, M-CLL больных лечение с комбинации флударабина/циклофосфамид/Ритуксимаб (FCR), золотой стандарт лечения больных медицинским подходят ХЛЛ, отсутствуют дефекты гена TP53 , выставлены значительно больше прогрессии бесплатно выживание (PFS) и ОС, по сравнению с U-CLL пациентов, которые получили^21,же лечения,^22,,²³. Таким образом, определение статуса ГИМ стало важным в частности для оказания помощи в терапевтических управления ХЛЛ пациентов , интеллектуального маркер, а не для оценки клинического течения заболевания , Прогностические маркер. В самом деле по данным недавнего обновления руководящих принципов под эгидой NCI от международного семинара по ХЛЛ, ГИМ статус переставить генов IGHV должно быть определены во всех случаях ХЛЛ до начала лечения в обоих общей практики и клинических испытания²⁴. Кроме того из-за недавнее одобрение новых лечения агентов и растущее количество наркотиков в испытаниях, состояние ГИМ молекулы IG может играть еще большую роль в терапевтического ведения больных с ХЛЛ в ближайшем будущем⁵.

В настоящем докладе подробно описываются все аспекты анализа последовательностей гена IG, начиная с выбора соответствующих материалов и кульминацией которых клиническая интерпретация результатов секвенирования. Углубленная оценка этих шагов важно диагностические процедуры для производства надежных результатов и обеспечения точных пациента стратификации в рамках клинических испытаний. Протоколы предоставляются для помощи в согласовании анализа последовательностей гена IG, обеспечивая тем самым, что результаты сопоставимы между различными лабораториями.

Протокол

Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике San Raffaele научного института, Милан, Италия.

1. Выбор

1. Выбор исходного материала
   Примечание: В большинстве случаев ХЛЛ количество клеток опухоли является высоким в диагностике (> 80-90%). Таким образом сортировки клеток или обогащения лейкозных клеток обычно нет необходимости.
   1. Если периферической крови (PB), наиболее распространенный материал выбора для анализа последовательностей гена IG, использовать объем крови между 10-20 мл.
   2. Кроме того в случаях с низким бременем клетки CLL, используйте ячейку Сортировка PB образцов или материала из других тканей, как костного мозга (БМ) или лимфатических узлов (LN).
2. Время отбора проб
   1. Дегустация время не имеет решающее значение, учитывая, что состояние IG SHM стабильной сверхурочных; что сказал, избежать выборки в определенные периоды, такие как сразу же после или во время терапии, так как низкое количество клетки CLL может усложнить анализ и привести к ненадежные результаты.
3. Сбора и хранения
   Примечание: Сбор и хранение исходного материала сильно зависит выбор материала.
   1. Для PB или BM образцов используйте ЭДТА или КПП (цитрат трис pyridossalphosphate) коллекция трубок, чтобы предотвратить ингибирование процесса амплификации PCR; Кроме того использование труб Гепарин.
   2. Для образцов LN параметры коллекции являются либо клеточных суспензий, биопсия из свежих замороженные ткани или, в редких случаях формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE).

2. плотность градиента разделения

Примечание: Если PB или BM является исходным материалом выбора, который является наиболее частым сценарием, рекомендуется мононуклеарных клеток изоляции с помощью градиента плотности разделения.

1. 200 мкл ЭДТА (0,5 М ЭДТА / рН 8,0) до 50 мл стерильного коллекции трубки. Добавьте 20 мл PB и 15 мл RPMI. Mix на дозирование (достаточно 2 - 3 раза).
2. Добавьте 15 мл градиента плотности среды в новой коллекции Тюбик 50 мл.
   Примечание: В случае, если PB объем менее чем 20 мл, объемы RPMI (предыдущий шаг) и градиент плотности должна быть изменена соответствующим образом.
3. Медленно слой в решении от шаг 2.1, таким образом, чтобы он не нарушить градиента. Центрифуга на 800 x g 20 минут с тормозом центрифуги выкл.
4. Собирать мононуклеарных клеток кольцо, которое сложилось между слоем верхней плазмы/тромбоцитов и плотность градиента среднего слоя, используя стерильные пипетки Пастера, а затем передать стерильные 15 мл коллекции.
5. Добавить RPMI окончательный объем 12 мл и перемешать. Центрифуга на 750 x g за 8 минут. Выбросите супернатант.
6. Ресуспензируйте Пелле ячейки, используя 10 мл RPMI и повторите шаг 2,5.
7. Растворяют гранулы клеток в 1 мл PBS (нет кальция, DPBS, без магния). Выполните число ячеек с помощью пластины Нойбауэр, смешивая 20 мкл пример и 80 мкл 1:10 Тюрк в раствор.
8. Если не глубокой переработкой образца запланировано на тот же день, центрифуга образца на 750 x g за 8 минут. Отменить супернатант и хранить клетки гранул на-80^o C.

3. Нуклеиновые кислоты добыча

1. Решите на подложке для анализа состояния ГИМ генов IG. Геномная ДНК (геномная ДНК) является наиболее популярным выбором, как нет необходимости для шага обратная транскрипция; Кроме того использование взаимодополняющих РНК/ДНК — (cDNA кДНК) гарантирует, что, по крайней мере на уровне транскрипционный анализ, продуктивной, функциональные clonotypic IG перестановка является «благоприятствования» целевой.
2. Используйте один из многочисленных коммерчески доступные наборы подходит для геномная ДНК или общей добычи РНК и синтез cDNA (см. Таблицу материалы).
3. Оцените целостность ДНК или РНК, с использованием систем количественной оценки чувствительных нуклеиновых кислот. Если с использованием FFPE материала для анализа, оценить качество и количество извлечения геномная ДНК/cDNA PCR амплификация гена известный хозяйствования, например ретиноевой кислоты рецептор альфа (RARa), бета актина и т.д..

4. усиление и последовательности перестановок гена IGHV-IGHD-IGHJ

1. Выбор праймера IGH PCR
   1. Предпочтительно выполняют мультиплексной ПЦР с IGHV подгруппа конкретные 5' грунты и IGHJ гена конкретных 3' грунтовки^25,26. Если результаты являются оптимальными, подготовьте отдельный смеси ПЦР с использованием одной подгруппы специфические праймеры IGHV.
   2. Используйте 5' праймеры которые отжига либо лидера региона расположен непосредственно перед фильтродержателями IG перегруппировки или в регионе кодирования (например платформа 1, FR1) гена IGHV.
      1. Использование лидер грунты, которые позволяют для амплификации всего переставить последовательности гена IGHV-IGHD-IGHJ, который в свою очередь даст возможность точной оценки уровней ГИМ. Таким образом в их обновленные руководящие принципы для IG генная последовательность анализа²⁷Эрика рекомендуется протравливающий грунт IGHV лидера.
      2. В случаях, когда лидер праймеры не усиливают clonotypic IG перегруппировки используйте IGHV FR1 грунтовки. Однако рамки праймеры не усиливают перепланированием генов IG весь clonotypic, которые могут привести к неточной определение уровня ГИМ. Для этого сценария, четко в клинических отчетов, что использование праймеров IGHV FR1 может переоценить процент личности к ближайшей гена микрофлорой.
   3. Для 3' конца используйте консенсуса грунтовки ориентации IGHJ генов, мультиплекс наборы IGHJ гена специфические праймеры или isotype специфические праймеры, в зависимости от субстрата. Грунтовка последовательности приводятся в таблице 1, тогда как на рисунке 1 изображены различные места для отжига праймера.
2. ПЦР-амплификация гена перестановок IGHV-IGHD-IGHJ
   1. Подготовьте грунт смеси с использованием эквимолярных количествах каждой подгруппы Праймеры для обеспечения беспристрастного амплификации.
      1. Например при использовании лидер грунты, два разных праймеры используются для усиливать перестановок, принадлежащих к IGHV1 подгруппы. Таким образом используйте количество этих 2 грунтовки (IGHV1L и IGHV1bL), что вдвое по сравнению с IGHV4L, который является единственным грунтовка для перестановки подгруппа IGHV4.
      2. Применять противоположный подход в случае грунты IGHJ1-2 и IGHJ4-5. Как эти грунты ориентированы две различные подгруппы гена IGHJ, двойное количество по сравнению с IGHJ3 и IGHJ6 грунты.
      3. Использование таблицы 1 определить точный грунтовка количествах при подготовке соответствующих грунтовка смесей.
   2. Смесь ПЦР реактивы, перечисленные в таблице 2. После объединения все реагенты PCR в ПЦР-пробирку добавить 0.5 мкл полимеразы Taq и 100 нг геномная ДНК или 2 мкл cDNA (кДНК должны подготавливаться с использованием 1 мкг РНК).
      Примечание: Полимераза фермент с корректура деятельность не является существенным, как коэффициент усиления ошибок крайне низка и поэтому не влияет на уровень ГИМ.
   3. Запустите тепловой протокол PCR, подробно изложены в таблице 3.
3. Clonality Оценка
   Примечание: Критических следующий шаг предполагает оценку clonality модель продукта PCR. При оценке clonality в ХЛЛ больных, наиболее распространенных поиск — единый, моноклональных пик/группа.
   1. Используйте методы с высок чувствительности, таких как анализ фрагмента или гетеродуплексного, для clonality оценки^28,29.
   2. Анализ фрагмента
      1. Выполнять мультиплекс PCRs, 5'-меченых IGHV лидер или конкретных праймеры PCR FR1 подгруппы; Это даст продукты PCR, которые могут быть разделены капиллярного электрофореза, что позволило clonality оценки IGH ПЦР продукты на основе взаимодополняемости их IGHV, определение региона 3 (CDR3) длины.
      2. Используйте грунты, реагентов и термических условий идентичны тем упоминалось ранее (см. таблицы 1-3). Пользовательские 5´-помечены грунтовки дневно помечены oligos с выбором красители на 5' конца. Репортер красители примеры 6-FAM, HEX, нед или тет. Таким образом 2 отдельные реакции необходимы основанные на использовании 3 различных красителей в реакции.
   3. Оценить размер продуктов ПЦР на геле полиакриламида 6% (6%) (этот процент приводит к оптимальное разрешение), используя 1 x TBE как идущий буфер. Запуск на 80 V по 45 мин.
      Примечание: Рекомендуется, чтобы продукты PCR разрешается мигрировать на гель для достаточно времени, так что моноклональная образцы могут быть отделены от поликлональных фона и размер маркеров ДНК может отделить адекватно. Такие факторы, как размер и толщина геля может повлиять на миграцию не один параметр (напряжение и время) могут гарантировать оптимальный результат, который сказал, установка напряжения на 80 V 45 минут является хорошей отправной точкой, как она минимизирует риск образца, перенос слишком быстро и «запуск» off гель.
   4. Проверить для продуктов ПЦР около 500 пар при использовании IGHV лидер грунты и 350 пар оснований, при использовании смеси праймера IGHV FR1.
      Примечание: В редких случаях, ЛЛЦ случаев были найдены для перевозки продуктов double, моноклональных и в случаях даже реже, случаи могут exhibit шаблон oligoclonal. Интеркалирующего агента как бромид Ethidium (бромистый этидий) или менее опасных и более чувствительных коммерчески доступных ДНК пятна может использоваться для визуализации ДНК на акриламид Гели УФ возбуждения или синий свет.
4. Очистки продукта PCR
   Примечание: Чтобы удалить любой поликлональных фон, возникая от нормальных клеток B в рамках ХЛЛ образца, а также грунт димеры, которые могут привести к неоптимальной последовательности очищаются продукты PCR. Используйте любой метод, который удаляет неинкорпорированных дНТФ и праймеры PCR очистки, например ферментативной обработки, например, Sap (креветки щелочной фосфатазы) / Exo (Exonuclease я), или на основе столбцов очистки.
   1. Загрузите общий объем продукта ПЦР на 3% легкоплавких агарозном геле.
   2. Разрешить продуктов ПЦР для запуска на геле, до тех пор, пока они отделяют от фона.
   3. Акцизный диапазоны PCR резкий, видно, очищают и элюировать. Если обнаружены две перестановки, обе группы должна быть вырезана и виртуализированных отдельно.
   4. Чтобы выполнить очистку Sap/Exo, следуйте инструкциям производителя относительно определенных томов для использования; Однако типичная реакция может содержать 1 мкл Sap, 0. 5 мкл Exo и инкубации 5 x 2 мкл буфера за 5-10 мкл реакции PCR. Смешайте нежно vortexing каждого образца и инкубировать на блоке ПЦР при 37 ° C за 30 минут. Инактивации ферментов при нагревании до 85 ° C на 15 минут.
   5. Загрузите небольшое количество продуктов ПЦР на 3% агарозном геле оценить чистоту продукта.

5. Сангер последовательности

Примечание: Некоторые последовательности, которую стратегии существуют, однако, независимо от того, точный подход, прямой последовательности обе стренги является обязательным для обеспечения надежного результата.

1. Общая последовательность протоколов
   1. Если амплификация была выполнена с использованием единого грунты, приступайте к виртуализации, используя соответствующие IGHV - и IGHJ - или постоянной региона специфические праймеры. Этот подход также могут быть приняты, если мультиплексированных дневно обозначенные грунтовки были использованы и продукт PCR была оценена с помощью анализа фрагмента (секвенирование праймеры не должен быть помечен).
   2. Если используется мультиплексированных грунты и clonality оценивалась на гель, затем использовать течению грунт на первом шаге последовательности например консенсус IGHJ грунт с последовательностью, 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. Кроме того CH грунт может использоваться, если cDNA был использован в качестве субстрата. Далее используйте специфичные для подгруппы IGHV лидер или FR1 Праймеры для второго шага последовательности.
2. Пример последовательности протокол
   Примечание: Существует несколько последовательность протоколов и протокол примера приводится ниже.
   1. Разбавить 33 нг ПЦР продукта в общем объеме 11,5 мкл, используя, например, стерильной водой. Денатурируйте продукт PCR путем нагрева до 95 ° C за 5 минут. Сразу же место на льду за 10 минут, чтобы предотвратить образование вторичных структур.
   2. Мкл 8 мастер смеси для каждой трубы вместе с 0.5 мкл (что соответствует 5 пмоль) грунт.
   3. Как элемент управления Подготовьте трубка, содержащая 8 мкл мастер смеси, 0.5 мкл pUC18 шаблон элемента управления, 2 мкл (-) 47 последовательности грунт и 9,5 мкл стерильной водой. Окончательный объем в каждой трубе должно быть 20 мкл.
   4. Использование тепловой Велоспорт условий для секвенирования реакции как подробно указано в таблице 4.
   5. Подготовить решение остановить путем смешивания 2 мкл ацетат натрия 3M (рН 5.2), 2 мкл ЭДТА 100 мм (рН 8.0) и 1 мкл гликогена (концентрации 20 мг/мл), затем добавить 5 мкл каждого образца. Передать новые пробки microcentrifuge продукт.
   6. 60 мкл, 100% этанола (-20 ° C) и аккуратно перемешать. Центрифуга для 15 минут (4 ° C) в 14 000 об/мин. Выбросите супернатант.
   7. Добавить 100 мкл 70% этанола (-20 ° C) и аккуратно перемешать. Центрифуга на 14 000 об/мин в течение 10 минут (4 ° C). Выбросите супернатант. Повторите один раз.
   8. Сухие гранулы для 90 минут при комнатной температуре. Добавьте 40 мкл натрия Додециловый сульфат (SDS) решение для каждого образца.
   9. Передать образец последовательности пластины, накрыть шапки полоса или лента уплотнения, загрузить на компьютер и выполнять Сэнгер последовательности. Пластину последовательности обычно 96-луночных, v снизу, юбка полный ПЦР плиты совместим с sequencer. Пластины могут быть штрих в зависимости от последовательности выполняемых собственными силами, в коммерческой компании или в академических последовательности центр/платформы.
3. После виртуализации, «сшить» 2 гласит, созданный из отдельных последовательности шагов сформировать полный IGHV гена перегруппировки т.е. последовательность консенсуса.

6. последовательность анализа

Примечание: Следующие разделы фокус на выходе, полученные из инструмента IMGT/V-квест³⁰ при анализе переставить IG последовательностей и IMGT/JunctionAnalysis³¹, оба из которых особенно актуальны для клинических отчетов и исследований исследования. IMGT/V-квест является выравнивание инструмент, который сравнивает пользователя представлены IG последовательности с IMGT ссылка directory задает³⁰. Выходные данные инструмента включает несколько разделов, в которых пользователь может определить некоторые параметры.

1. Укажите виды, например, Homo sapiens (человека) и рецептор типа или локус (например IGH, IGK или IGL).
2. Вставить последовательности необходимо проанализировать, в формате FASTA, включая заголовки, в текстовой области (в пакетах до 50 последовательностей в перспективе). Кроме того предоставляется возможность ввести путь в локальный файл, содержащий FASTA последовательности.
3. Выберите один из следующих вариантов 3 дисплей для результатов:
   1. Подробный просмотр: Выберите этот параметр, чтобы получить результаты для каждой последовательности индивидуально.
   2. Синтез вид: Выберите этот параметр, чтобы составить сводную таблицу приказал по имени ген и аллеля IGHV или входной последовательности. Этот вариант также обеспечивает выравнивание последовательностей, которые, в любые представленные партии, присваиваются же гена IGHV и аллеля.
   3. Файл Excel: Выберите этот параметр, чтобы обеспечить все выходные файлы как таблицы включены в один файл. Все параметры просмотра имеют большой выбор базовые и расширенные параметры, чтобы выбрать из, однако только факторы, наиболее актуальных для анализа последовательностей ХЛЛ IG рассматриваются ниже в разделе «Представитель результаты».

7. арест/AssignSubsets инструмент

1. Расследовать стереотипии BcR IG в ХЛЛ (Дополнительные сведения приведены ниже в разделе «Представитель результаты»), представить IGHV-IGHD-IGHJ FASTA последовательности для ареста/AssignSubsets инструмент³². Средство сообщает, что назначение основных ХЛЛ стереотипные подмножеств. Подмножество Назначение инструмента вместе с подробные инструкции доступны на веб-сайте арест/AssignSubset³² , а также на веб-сайте Эрик на вкладке службы.

Результаты

Приводимые ниже примеры иллюстрируют результаты, полученные из IG гена последовательности анализа следующие шаги подробно говорилось выше. Хотя ДНК или РНК добыча рутинные процедуры для большинства клинических/исследовательских лабораторий, первый критический шаг включает в себя проверку качества/количества геномная ДНК или РНК, используя спектрофотометр или другие подходящие технологии с высокой чувствительностью. Следующий важный шаг включает амплификацию PCR clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ гена перегруппировки. Как упоминалось выше, только использование праймеров IGHV лидера позволяет амплификацию по всей длине переставить последовательности гена IGHV, таким образом позволяя ГИМ нагрузки определено; Таким образом IGHV лидер грунтовки являются выбором рекомендуется грунт (рис. 2). В редких случаях, где IGHV лидер праймеры не может усилить перепланированием IG clonotypic могут использоваться IGHV FR1 грунтовки. Как свидетельствует на рисунке 3может наблюдаться несколько продуктов ПЦР/полосы, особенно когда геномная ДНК является исходным материалом; Эти полосы должны быть вырезана и виртуализированных отдельно. Если лидер IGHV и IGHV FR1 грунты не принесут результатов, анализ должен повторяться с использованием нового пациента образца (когда возможно). Последней контрольной точки до виртуализации является определение clonality образца с помощью анализа фрагмента (рис. 4).

Полученные последовательности должны быть проанализированы с помощью инструмента IMGT/V-квест³⁰. Выбранные пользователем параметры включают видов, рецептор типа или locus, поиск для вставки и исключить вариант, и т.д. и перечисляются вместе с числом анализ последовательностей. Отображается каждый FASTA последовательность и проанализированы IMGT/V-Квест V-домен выделяется зеленым цветом. Кроме того если входная последовательность была противоположной ориентации (antisense), программа автоматически предоставляет дополнительные обратной последовательности и заявляет об этом выше FASTA последовательности.

В результате непосредственно ниже последовательности FASTA, в верхней части «Подробно» приводится сводная таблица страницы результатов и содержит информацию, важную для клинических отчетов анализа последовательностей гена IG в ХЛЛ. Каждая строка в этой таблице приводится ниже.

Результат резюме. Первая строка в таблице результатов государства функциональность входной последовательности: IG переставить последовательность может быть продуктивным или непродуктивных (Рисунок 5А и 5B). Перераспределение генов IG является непродуктивным, если остановка кодонов присутствуют в рамках V-D-J-региона (VH) или V-J-региона (вл) и/или если перестановка вне кадра из-за вставки/удаления. Третий вывод, предоставляется, когда функциональность не может быть определен, то есть, если не может быть идентифицирован перекрестка IGHV-IGHD-IGHJ; в этом случае результат резюме будет читать как «Перестановка не найдено» или «Джанкшен не найден». Важно отметить, что только продуктивным и, таким образом, далее должны быть проанализированы функциональные перестановок. Если единственным усиленный IG перестановка не функционирует (непродуктивные или «не найдено»), следует повторить процесс амплификации PCR. Если результат по-прежнему отрицательный образец нового пациента должны быть получены.

V-гена и аллеля. «V-гена и аллеля» строка указывает ближайший гена IGHV микрофлорой и аллелей с его Оценка выравнивания и процент личность. Если несколько gene(s) и аллели дают же высокий балл, перечислены все. Процент тождество между представленной последовательности и ближайшим IGHV гена и аллеля имеет особое значение, так как он определяет состояние ГИМ. Это значение вычисляется из первых нуклеотидов V-региона к 3' концу V-региона, за исключением CDR3. Если используются IGHV FR1 грунты, последовательность, соответствующего руководства для обеспечения как точный результат как можно всегда исключить. Следует отметить, что низкий личность процент (< 85%) может быть результатом вставки или удаления (подробнее ниже), и это должно быть дело «предупреждение» появится в строке «Результат резюме» оповещения пользователя.

J-гена и аллеля. Как описано для V-гена и аллеля выше, «J-гена и аллеля» строка указывает на ближайший гена IGHJ микрофлорой и аллелей с его Оценка выравнивания и процент личность. Однако как ген IGHJ довольно короткий, и его ' конец 5 возможно были сокращены из-за деятельность при exonuclease, альтернативные варианты, также обыскали инструмент, основанный на наибольшее количество последовательных одинаковых нуклеотидов.

D-гена и аллеля, IMGT/JunctionAnalysis. Был ГЕНОМ и аллеля, IMGT/JunctionAnalysis указывает на ближайший микрофлорой IGHD гена и аллеля с D-регион чтения кадра, определяемую средством в последовательности пользователя. IMGT/JunctionAnalysis³¹ содержится подробный и точный анализ перекрестка и был интегрирован в интерфейс инструмента IMGT/V-квест. Этот инструмент управляет всеми аспектами трудности, связанные с IGHD Джин и аллеля идентификации например, (i) короткая длина D-региона; (ii) использование 2 или даже 3 чтения фреймов; (iii) при exonuclease обрезки на обоих концах гена; и (iv) наличие мутаций.

FR-IMGT длины, CDR-IMGT длины и AA JUNCTION. Эта строка содержит длину IGHV FRs и CDR показано в скобки и разделенных точками и перекрестка аминокислоты (AA). AA последовательность перехода иллюстрирует (i в или вне кадра перестановка (вне кадра позиции обозначаются знак «#»), (ii наличие или отсутствие стоп-кодонов (стоп-кодон показано звездочкой ' *') и (iii) наличие или отсутствие якоря VH CDR3-IMGT: C (2 CYS 104) и W (J-TRP 118).

Соматические hypermutations преимущественно состоят из единичных нуклеотидных изменений, однако, небольшие вставок и удалений в регионе V можно наблюдать, хотя и на гораздо более низких частот³³. Когда с использованием параметров по умолчанию IMGT/V-квест, вставок и удалений не обнаруживаются автоматически; Однако, обнаруживаются явные признаки того, что последовательность может нести такие изменения, то есть, низкий процент личность и/или различных IGHV CDR1-IMGT и CDR2-IMGT длин между представленные пользователем последовательности и ближайший микрофлорой гена и аллеля, инструмент и предупреждение появляется ниже сводная таблица результатов (рис. 5 c).

IMGT предоставляет возможность под названием «Поиск для вставок и удалений» в разделе «Параметры», расположенной ниже раздел «Отображение результатов». В тех случаях, когда появляются соответствующие предупреждения рекомендуется использовать эту функциональность. При обнаружении вставок и удалений, подробно вывод предоставляются в разделе «Результат резюме», включая (i) где вставки или удаления расположен т.е. VH FR-IMGT или CDR-IMGT; (ii) число нуклеотидов, вставки/удаления; (iii) в последовательности (только для вставки); (iv) имело ли место фреймшифт; (v кодон V-регион, с которой начинается вставка или удаление; и (vi) пострадавших нуклеотидов позицию в представленных последовательности (рис. 5 d). Для вставок средство удаляет insertion(s) из последовательности представленных пользователя и затем повторно анализирует последовательность, используя стандартные параметры IMGT/V-квест. Если исключения обнаружены, средство добавляет пробелы, представлены точками, чтобы заменить удаленные нуклеотидов прежде чем повторять анализа.

Что касается всех диагностических и прогностических испытания в клинических лабораториях строгие стандарты и высокий уровень воспроизводимости имеют первостепенное значение. IMGT/V-квест выход обеспечивает большую часть информации, необходимой для представления результатов анализа последовательностей гена IG в ХЛЛ, то есть, (i) IGHV, IGHD и IGHJ генов и аллели использованы; (ii) функциональность clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ гена перегруппировки т.е. является ли перестановка продуктивных и непродуктивных; и (iii) процент личность переставить IGHV Джин и аллеля по сравнению с его ближайшим гена IGHV микрофлорой и аллеля. Для подробные данные относительно клинических отчетов генов IG в ХЛЛ, интерпретация проблематичным или технически сложных случаях и рекомендации для точной и надежной определения статуса ГИМ IGHV гена в ХЛЛ читатель отсылается Недавно обновлен Эрик руководящих принципов и докладов^27,34.

Наконец благодаря нашей растущей знаний, касающихся стереотипии BcR IG в ХЛЛ, дополнительного Рекомендуемые требования для клинических отчетов перестановки генов IG в ХЛЛ относится назначение дел майор стереотипные подмножеств. Теперь рекомендуется в клинической докладе ли анализируемого продуктивной перестановка гена IGHV может быть назначен один из крупных стереотипных подмножеств, а именно подмножеств #1, #2, #4 и #8^12,27. Назначение основных ХЛЛ стереотипные подмножеств должно выполняться с использованием инструмента (рис. 6) арест/AssignSubsets³².

5' IGHV FR1 грунтовки	Грунтовка последовательность		Количество смеси праймера для 60 мкл
IGHV1	CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG		10
IGHV2	CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG		10
IGHV3	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG		10
IGHV4	CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG		10
IGHV5	GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC		10
IGHV6	CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG		10
5' IGHV лидер праймеры
IGHV1L	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG		5
IGHV1bL	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ) ПЕРЕМЕННОГО ТОКА		5
IGHV2bL	AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC		5
IGHV3aL	AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC		5
IGHV3bL	AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (СИСТЕМА КОНДИЦИОНИРОВАНИЯ/T) GC		5
IGHV4L	AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT		10
IGHV5L	AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC		10
IGHV6L	AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC		10
3' IGHJ грунтовки
IGHJ1-2	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC		20
IGHJ3	TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC		10
IGHJ4-5	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC		20
IGHJ6	TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC		10

Таблица 1. Грунтовка последовательности и количества для амплификации PCR clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ гена перегруппировки.

Реагент	Объем (мкл)
РБ x 10 буфера	5
MgCl2 (50 мм)	3
дНТФ (10 mΜ)	2
Грунт IGHV лидер/FR1 микс (10 мкм)	3
Грунт IGHJ смесь (10 мкм)	3
H2O	31.5
Общий объем	47,5

Таблица 2. Реагентов для амплификации PCR clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ гена перегруппировки.

Температура	Продолжительность	Номер цикла	Описание
94 ° C	5 минут	1	полимеразы активации
94 ° C	1 минута	39	Денатурация
59 ° C	1 минута		отжиг
72 ° C	1.5 минуты		расширение
72 ° C	10 минут	1	окончательное расширение
18 ° C	∞	1	сохранение

Таблица 3. Температурных условиях Велоспорт для амплификации PCR clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ гена перегруппировки.

Температура	Продолжительность	Номер цикла	Описание
94 ° C	5 минут	1	полимеразы активации
96 ° C	20 секунд	30	Денатурация
50 ° C	20 секунд		отжиг
60 ° C	4 минуты		расширение
4 ° C	∞	1	сохранение

Таблица 4. Тепловые Велоспорт условия для реакции секвенирования генов IG.

Рисунок 1. Схематическое представление перегруппировки гена IGHV-IGHD-IGHJ с различными грунт, отжиг местоположения указано. 5' IGHV праймеры обжигают в последовательности лидер, который расположен выше по течению от IGHV кодирующая последовательность. 5' IGHV рамки (FR) праймеры обжигают в начало области FR1, которая находится в пределах переставить гена IGHV, тогда как 3' IGHJ праймеры обжигают до конца переставить гена IGHJ. UTR: непереведенные региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. ПЦР-амплификация гена перегруппировки IGHV-IGHD-IGHJ в 7 пациентов образцов, используя 5' IGHV лидер грунты. Восьмой Лейн представляет положительный контроль, тогда как отрицательный контроль для ПЦР была загружена в девятом Лейн. При использовании IGHV лидер грунтовки ожидаемый продукт PCR является около 500 пар в размер. Звездочка в последнем столбце геля указывает 100 bp лестница ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. ПЦР-амплификация гена перегруппировки IGHV-IGHD-IGHJ в 13 пациентов образцов, используя праймеры IGHV FR1. Четырнадцатый Лейн содержит положительный контроль в то время как отрицательный контроль был загружен в пятнадцатом Лейн. Как свидетельствует переулок 2, для которого ДНК был исходным материалом, наблюдаются несколько диапазоны PCR, которые должна быть вырезана и виртуализированных отдельно. Образцы в переулки, 5, 7 и 13 принесли поликлональных результаты (подтверждается мазка в гель), и, таким образом, следует повторить шаг ПЦР. Если второй ПЦР не усиливают переставить IG gene(s) анализа должна быть выполнена на нового образца (если возможно) или с помощью различных грунтовка набор. При использовании IGHV FR1 грунтовка смеси ожидаемый продукт PCR является примерно 350 пар в размер. Звездочка в последнем столбце геля указывает 100 bp лестница ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Оценка с помощью анализа genescan clonality. В genescan анализе моноклональных продукты PCR порождают доминирующей пик флуоресцентные продукции одинакового размера (Верхняя панель), тогда как polyclonal продукты PCR привести в более нормальное распределение размеров продукта (Нижняя панель). Красные следы являются пики от дневно меченых лестница ДНК, которая загружается в же капиллярного инъекции как образец анализируются. Размер стандартных фрагментов подвергаются той же электрофоретической силой как образец и поэтому подвергаются воздействию на тех же условиях инъекций. Равномерные интервалы стандартный размер фрагментов подтверждает призыв точный размер. Голубые следы представляют собой моноклональные (Верхняя панель) или поликлональных характер (Нижняя панель) образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Примеры результатов сводные таблицы, представленной IMGT/V-квест. (A) результат Сводная таблица для продуктивной перегруппировки гена IGHV-IGHD-IGHJ (без остановки codon(s) и в кадр последовательности junction). V-гена и аллелей и J-ген аллеля, определенным в последовательности пользователя по IMGT/V-квест в этом случае являются IGHV4 - 34 * 01 и IGHJ6 * 02 (на основе высокой оценки Оценка выравнивания). Процент личность является 99,65% из-за одного соматические мутации. D-гена и аллеля, выявленные IMGT/JunctionAnalysis — IGHD3 - 3 * 01 в чтении кадр 1. В скобках указаны длины 4 рамки регионов (FRs), а также 3 взаимодополняемость определение регионов (CDR). Последовательность аминокислот (AA) IGHV-D-J Джанкшн также предоставляется. В этом примере перекрестка входят 22 ААС. (B) Сводная таблица результатов для последовательности перегруппировки гена IGHV-IGHD-IGHJ, которая является непродуктивной из-за соединения вне кадра. X для длины CDR3-IMGT указывает, что для этой последовательности длины не может быть определена. «#» Признаки, наблюдаемые в последовательности перехода AA указывают фреймшифт. (C) результат Сводная таблица предупреждение низким V-регион идентичности (60.94%) и указывающее, что следует использовать параметр «вставок и удалений» в разделе «Дополнительные параметры». (D) результат Сводная таблица для случая с микрофлорой низкий процент личности показано на (C) после повторяющаяся последовательность анализа, с помощью параметра «Поиск для вставок и удалений». Правильной идентификации процентов отображается в квадратных скобках и рассчитывается, учитывая вставки как единый мутационного событие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. Таблица отчета назначения подмножества, созданным инструментом арест/AssignSubsets. FASTA IG последовательности из 10 пациентов ХЛЛ (А1-А10) были представлены к средству арест/AssignSubsets. Случае A4 был назначен ХЛЛ стереотипные подмножество #2 (пациенты в рамках этой группы известны иметь плохой прогноз независимо от нагрузки ГИМ) с высокой степенью уверенности. Семь других случаев/последовательностей были не назначен к подмножеству основных стереотипных и поэтому классифицируется как неназначенные. Два из представленных последовательностей (A7 и A8) не могут использоваться для задания подмножества и вместо этого были классифицируется как пропущенные/нездоровой из-за проблем с последовательность, т.е., из-за соединения вне кадра или наличие стоп-кодонов. Подробное объяснение заголовки таблицы и инструмент доступен на веб-сайте арест/AssignSubsets³². Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Изучение генов IG в ХЛЛ был жизненно важным не только для обеспечения лучшего понимания в pathobiology болезни, но и для улучшения пациентов риск стратификации. Поэтому важно, что многоступенчатого процедуры анализа последовательностей гена IG и последующей интерпретации данных последовательности выполняется в стандартизированной форме. Наличие подходящих и достаточно материала пациента и время выборки не должно влиять на способность выполнять мутационного анализ генов IG, поскольку тест может выполняться по PB и любой пробы с высоким количество клеток опухоли ХЛЛ. Разделение мононуклеарных клеток крови с использованием градиента разделение методов обычно выполняется в диагностических лабораториях, и как всегда, следует позаботиться при добавлении крови/RPMI решение в пробирку, содержащую градиента; Эта задача должна быть выполнена образом медленно, нежно, чтобы не мешать градиента и предотвращения гибели клеток.

После разделения клеток извлекаются нуклеиновых кислот. Оба геномная ДНК и cDNA подходят для анализа ГИМ clonotypic IGH перераспределению, однако, есть свои преимущества и недостатки для использования либо материала. Рабочего процесса лаборатории протекает быстрее при использовании геномная ДНК, так как не обратная транскрипция должна быть выполнена до амплификации PCR. Что сказал, используя геномная ДНК как субстрат для ПЦР может привести к амплификации продуктивных и непродуктивных перестановок, которые, в свою очередь, может привести к дополнительные практические лабораторные работы, т.е., очистки или гель вырезание нескольких продуктов ПЦР и отдельные последовательности всех перестановок. При сравнении геномная ДНК и cDNA подходы, для последнего шага обратной транскрипции должна выполняться перед амплификации PCR. Однако в данном случае, в большинстве случаев, только продуктивной IG перестановки будет усиливается и впоследствии виртуализации. Таким образом только один продукт PCR будет очищены и виртуализации, при интерпретации результатов является более простым.

Эффективность усиления во многом зависит от качества геномная ДНК/cDNA, которая должна оцениваться с помощью метода чувствительных квантификации и праймеры используются. Праймеры используются имеют решающее значение для всей аналитические процедуры, поскольку точное определение уровня ШМ может быть достигнута только путем усиления всю последовательность гена переставить IGHV. Полнометражный перегруппировки может оцениваться только если используются 5' IGHV лидер грунты, оправдывая тем самым недавние рекомендации Эрик для использования лидер грунтовки²⁷. Использование альтернативных грунтовки, ведущих к амплификации неполной перестроек гена IGHV-IGHD-IGHJ, не подходит для IGHV гена мутационного анализа и поэтому решительно высказался против. Единственное исключение относится к случаям, которые неоднократно производят отрицательные результаты при использовании IGHV лидер грунты и анализ новых пациентов материала является либо не возможно или также не дала результатов. Если использование различных пациентов образца и/или материала (геномная ДНК/cDNA) и различные грунтовки устанавливает еще не производить продукт PCR, возможные причины могут быть что бремя клеток опухоли является слишком низким или что лимфоцитоз не обусловлено ХЛЛ клон (в этом случае иммунофенотип следует пересмотреть). Грунты, используемые для анализа должен всегда указывается в клинических отчетов.

CLL результатов от накопления моноклональных B клеток, несущих перепланированием же гена IGHV-IGHD-IGHJ, для подавляющего большинства случаев clonality оценки покажет уникальный моноклональных пик, то есть, один клон. В редких случаях двойной перестановки или даже oligoclonal шаблоны могут наблюдаться³⁵. В таких случаях электрофорез геля не является предпочтительной методикой для оценки clonality и должны применяться более чувствительные методы, такие как анализ фрагмента. После того, как было подтверждено clonality, последний шаг до последовательности относится к очистки продукта ПЦР для обеспечения получены последовательности высокого качества. Наконец средство IMGT/V-квест является ресурсом, рекомендованные для анализа последовательностей IG Эрика. Как IMGT базы данных постоянно обновляются и сообщить результаты в последовательной и хорошо аннотированных способом, этот инструмент обеспечивает стандартизированный анализ и облегчает сравнительный анализ среди различных клинических или академические услуги.

Как иммуногенетической анализа в ХЛЛ прогностическо и, в частности, прогнозирования последствий, надежный анализ перепланированием гена IGHV-IGHD-IGHJ, включая назначение основных ХЛЛ стереотипные подмножеств, уже не только желательным, но ключевое значение. Это особенно очевидно в эту эпоху Роман терапии и потенциал, что анализ генов IG руководство лечения решений^{5,21,,2223,36,37 ,38}, как официально свидетельствует недавнее обновление руководящих принципов под эгидой NCI от международного семинара по ХЛЛ²⁴. Что сказал, строгие стандарты необходимы, особенно, как определение статуса ГИМ clonotypic переставить гена IGHV у больных ХЛЛ является не тривиальный вопрос и включает в себя многоступенчатый процесс. Важно отметить, что некоторые экспериментальные шаги, прежде всего выбор грунтовки, урожайность превосходные результаты, когда параметры и/или подходы соблюдаются, другие технические аспекты поддаются определенной степени гибкости, например выбор материала или метод оценки clonality, с тем, что они ведут к тонкие различия, если таковые имеются, в отношении окончательных результатов.

За последнее десятилетие Эрик стремится содействовать стандартизации и согласования различных методов соответствующих ХЛЛ диагностики и прогнозирования. Это отражено в опубликованном рекомендации и руководящие принципы для иммуногенетической анализ^27,34, многочисленные организованные учебные семинары и события, создание сети IG, а также онлайн форум экспертов для обсудить и дать указания по интерпретации последовательности гена IG в ХЛЛ. Общая цель Эрик через эти действия является содействие оптимальной клинического управления и ухода за пациентами. Несмотря на интенсивные усилия эта задача далека от завершения и в самом деле стало более сложным вследствие развития Роман высокопроизводительного секвенирования, направленных на иммунные профилирования. Тем не менее хотя проблемы сохраняются, интенсивные усилия для надежной стандартизации анализа генов IG в ХЛЛ продолжить и в настоящее время находятся в центре внимания текущей деятельности в рамках Эрик.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BD Vacutainer Пластиковые пробирки для сбора крови с K2EDTA: Пробка для пробирки	ThermoFisher scientific	02-689-4	хранение материала
BD Vacutainer CPT Пробирка для подготовки мононуклеарных клеток - Гепарин натрия	Бектон Dickinson	362753	хранение материала
BD Vacutainer Пробирки для сбора крови с гепарином	Daigger Scientific	366480	хранение материала
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575038	обработка клеток
Центрифужные пробирки 15 мл CS500	Corning	352096	обработка клеток
Центрифужные пробирки PP 50 мл CS500	Corning	352070	обработка клеток
RPMI Medium 1640 (1X) жидкая	Invitrogen	21875-091	обработка клеток
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 мл	STEMCELL Technologies	17-1440-02	клеток
Серологические пипетки 5 мл	Sarstedt	861,253,001	клеточная обработка
Серологические пипетки 10 мл	Sarstedt	861,254,001	клеточная обработка
Серологические пипетки 25 мл	Sarstedt	861,685,001	клеточная обработка
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190250	клеточная обработка
пластина Neubauer	Marienfeld-Superior	640010	клеточная обработка
Tuerk solution	Sigma-Aldrich	93770	клеточная обработка
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K1820-01	Экстракция ДНК
QIAamp РНК Blood Mini Kit	Qiagen	52304	Экстракция РНК
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Экстракция ДНК/РНК
5X первая цепочка буфер	Invitrogen	P/N Y02321	синтез кДНК
Случайные праймеры, 20 & микро; g	Promega	C1181	синтез кДНК
РНКазаOUT& торговля; Рекомбинантный ингибитор рибонуклеазы	Инвитроген	10777019	синтез кДНК
DTT	Invitrogen	P/N Y00147	синтез кДНК
SuperScript II Обратная транскриптаза	Invitrogen	18064-014	синтез кДНК
10 мМ dNTP Mix	Invitrogen	18427013	синтез кДНК, ПЦР
ПЦР Буфер	Invitrogen	O00065	ПЦР
MgCl2 (хлорид магния) (25 мМ)	ThermoFisher scientific	AB0359	ПЦР
Taq ДНК полимераза, рекомбинантная	Инвитроген	10342-020	ПЦР
Прикладные биосистемы 5&прайм; Меченые праймеры	ThermoFisher научная		ПЦР/Оценка клональности
Agilent Высокочувствительный набор ДНК	Agilent Technologies	5067-4626	Количественное определение продукта для ПЦР
UltraPure TBE Buffer, 10X	ThermoFisher научный	15581044	гель для электрофореза
UltraPure Бромид этидия, 10 мг/мл	гель для научной 15585011 ThermoFisher		электрофорез
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher scientific	S33102	гель электрофорез
10X BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	16500100	гель электрофорез
DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE готовый к использованию	гель Geneon	305-105	гель
UltraPure Agarose	ThermoFisher scientific	16500500	гель электрофорез
Агароза низкая температура гелеобразования	Sigma-Aldrich	A9414-250G	гель электрофорез
Novex TBE Гели, 10%, 10 лунок	ThermoFisher научный	EC6275BOX	гель электрофорез
ExoSAP-IT ПЦР Реагент для очистки продукта	ThermoFisher научный	78201.1.mL	ПЦР продукт для очистки продукта
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Очистка продукта ПЦР
GenomeLab DTCS Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	Секвенирование по Сэнгеру
Раствор ацетата натрия (3 М), pH 5,2	ThermoFisher Scientific	R1181	Секвенирование по Сэнгеру
Гликоген, класс молекулярной биологии	ThermoFisher scientific	R0561	Секвенирование по Сэнгеру
Этанол абсолютный	EMD Millipore	1024282500	Секвенирование по Сэнгеру
SafeSeal пробирка 1,5 мл	Sarstedt	72,706	общего использования
Multiply-Pro чашка 0,2 мл, полипропилен	Sarstedt	72,737,002	общего использования
Центрифужное			оборудование
ПЦР-оборудование
Биоанализатор	Agilent Technologies		оборудование