Методическая статья

Определение белка субцеллюлярные локализации зеленый флуоресценции белков пометки и 4', 6-Diamidino-2-phenylindole окрашивание Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/57914

⸱

30 июля 2018 г.

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол показано, как отслеживать ядерный транслокации белка под теплового стресса с помощью зеленой флуоресценции белков (ГПУП) синтез белка как маркер и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятнать. Пятнать протокол DAPI быстро и сохраняет GFP и белка локализация внутриклеточных сигналов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этот протокол, зеленый флуоресценции белков (ГПУП) синтез белка и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятная используются для отслеживания изменений локализация внутриклеточных белков; в частности ядерного транслокации под воздействием тепла подчеркнуть условие. Белки реагируют соответственно для внешних и внутренних сигналов. Общий механизм заключается в изменении его субцеллюлярные локализации. Эта статья описывает протокол для отслеживания белка локализации, которая не требует антитела, радиоактивных маркировки или конфокального микроскопа. В этой статье GFP используется для отметки целевого белка отл-1 в C. elegans, членом хлорид внутриклеточных канал белков (CLICs) семьи, включая млекопитающих CLIC4. Трансгенные линии комплексных переводческих отл 1::gfp (с промоутером и полный геном последовательности) был создан путем преобразования и γ-излучения и стабильно выражает гена и gfp. Недавние исследования показали, что после теплового стресса, не окислительный стресс, отл 1::GFP накапливается в ядре. Дублирование сигнала GFP с структуре ядра и DAPI сигналы подтверждает изменения субцеллюлярные локализации отл-1 под нагрузкой. Этот протокол предоставляет два различных фиксации методы для пятнать DAPI: этанол фиксации и фиксация ацетон. DAPI окрашивание протокол, представленный в этой статье является быстрым и эффективным и сохраняет GFP сигнала и изменения локализация внутриклеточных белков. Этот метод требует только флуоресцентным микроскопом с Номарски, FITC фильтр и фильтр DAPI. Она подходит для небольших лабораторных условиях, студент исследований, исследования студент средней школы и классы биотехнологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменение локализация внутриклеточных белков — это общий механизм в ответ на внутренних или внешних сигналов, таких как тепловой стресс, голода, оксидативный стресс, апоптоз, фосфорилирование белков и другие. Например тепловой стресс вызывает членом FOXO DAF-16 ядерных транслокации1,2и про apoptotic белок BCL-2, которую BID translocates митохондрий после получения смерти сигнализации3,4. Различные методы доступны обнаружить эти изменения. Сочетание Западный blotting и биохимически изоляции внутриклеточных структур (например, митохондрии или ядер) также могут достичь цели3. Однако это требует специфического антитела против протеинов интереса. Таким образом устоявшихся антитела становится ключом к успеху. Альтернативный подход — для обозначения различных внутриклеточных структур или органеллы с различными маркерами например зеленый флуоресценции белков (КГВ), красное флуоресцирование белками (RFP), желтый флуоресценции белков (рекламы ЯФП) и mCherry и тем временем ярлык белка интерес с других маркеров. Затем наблюдать их под Конфокальный микроскоп для локализации целей5,6. Радиоактивные изотопы являются альтернативным выбором для маркировки белков-мишеней и затем обнаружения их локализация внутриклеточных7. Однако этот метод требует надлежащей профессиональной подготовки и обращения с радиоактивными отходами. В условиях таких, как отсутствие специфического антитела, отсутствие надлежащего маркер, или scarceness оборудования например конфокального микроскопа альтернативный подход необходимо рассматривать. Для идентификации ядерных транслокации белка, это привлекательным только ярлык целевых белков с маркером и выведение ядер с химический реагент 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), поскольку это требует только регулярные флуоресцентным микроскопом.

C. elegans Immunolabeling с антителами является сложной задачей из-за низкой проницаемости яичной скорлупы или коллагеновых кутикулы, окружающих животного. Тем временем поскольку C. elegans белки, значительно расходящихся от их позвоночных Ортологи, несколько коммерческих компаний предоставляют C. elegans с конкретными продуктами. Это трудно для небольшой лаборатории для создания антител C. elegans для себя. Исследователи в сообществе часто используют тегами белки как маркеры для демонстрации выражение локализации или гена белка. Эта статья использует отл 1::GFP в качестве примера для отслеживания ядерной транслокации белка под тепловой стресс8. Интегрированный трансляционная отл 1::gfp в геном животного используется для стабильно выражения гена gfp фьюжн. Исследования показали, что отл-1 выражается в кишечнике, мышечной стенки тела и других внутриклеточных структур8. Этот протокол показано, как синхронизировать черви четвертый личиночной стадии (L4), выполнять тепловой стресс эксперимент и поведения DAPI окрашивание, этанол фиксации, ацетон фиксации и изображений под микроскопом регулярные флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. решения

  1. НГМ пластины
    1. В колбу Эрленмейера 2 Л добавьте 3 g NaCl, 17 g агар, 2.5 g Пептон и 975 мл dH2O. Обложка рот колбу с алюминиевой фольгой. Автоклав Фляга для 50 мин охладить его за 20 – 30 мин.
    2. Затем добавьте стерилизованные решения: 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 5 мг/мл холестерина в этиловом спирте, 1 мл 1 М MgSO4и 25 мл 1 М КПО4 (pH 6.0) буфера. Вихрем решения хорошо перемешайте.
    3. Использование жидкого мыла, обойтись NGM решение 60 мм пластины и Петри. Заливка плиты 2/3 полной агара. Храните их в герметичный контейнер при 4 ° C для использования в будущем.
  2. 1 M КПО4 буфера (pH 6.0)
    1. Распустить 10.83 g KH2PO4 и 3.56 g K2HPO4 dH2O, а затем настроить общий объем до 100 мл. Автоклав решение для 15 мин.
  3. M9
    1. Растворите 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4и 5 г NaCl в dH2O, добавляют 1 мл 1 М MgSO4и отрегулировать общий объем до 1 л
  4. DAPI 10 мкг/мл
    1. 1 мкл 10 мг/мл DAPI в 999 мкл dH2O.
  5. спирт 95% (v/v)
    1. Мера 95 мл 100% алкоголя и добавить дистиллированной воды, чтобы отрегулировать громкость до 100 мл.
  6. 30% ацетона (v/v)
    1. Добавить 30 мл ацетона dH2O и отрегулировать общий объем до 100 мл.

2. тепловой стресс

  1. Создайте линию нехромосомной массив с поступательной построить целевых генов9,10. Кроме того получите такие линии от Caenorhabditis центр генетики (CGC), которая представляет собой общественный ресурс для исследования C. elegans , или из ранее опубликованных научно-исследовательской лаборатории.
  2. Интегрируйте нехромосомной линии в геноме, подвергая червей до 3800 Rad γ-излучения9. Затем выберите стабильно выраженной линии так, что каждое животное выражает маркер белка GFP или валика.
  3. Чтобы удалить мутации, созданные во время излучения, outcross линии по крайней мере 2 x. Используйте этот трансгенные линии для обнаружения изменения шаблон выражения протеина под нагрузкой.
  4. Подготовьте NGM червь пластины, как описано в шаге 1.1. Полоска клон ОР50 и культуры бактерий в жидком LB отвара на ночь. Семя NGM пластины с жидким ОР50 культура и инкубировать пластины в инкубаторе 37 ° C ночь вырастить газон бактерий как источника пищи для червей. Охлаждения пластины при комнатной температуре по крайней мере 30 минут перед использованием.
  5. Растут трансгенные линии при 20 ° C без голода для по крайней мере 2 поколений до пробирного теплового стресса.
  6. Выберите 8 – 10 молодых беременных взрослых (матки заполнены с яйцами) новый червь пластины, а затем пусть они откладывают яйца на около 3-5 ч и удалите всех взрослых из пластин.
  7. Чтобы синхронизировать червей, пусть яйца люк и расти личинок для приблизительно 48 h четвертый личиночной стадии (L4). Изучение их структуры вульвы (полумесяц структуры) для идентификации L4 стадии (рис. 1, стрелки)11.
  8. Место червь пластины с личинки L4 в инкубаторе 35 ° C для 2-5 ч до достижения теплового стресса. Поместите термометр в инкубаторе для точного измерения температуры.

3. DAPI пятнать

  1. Фиксация этанола
    1. 10 мкл буфера M9, в центре на стеклянное скольжение.
    2. Выберите тепло шокирован червей из шага 2.8 и положил их в буфере M9 на стеклянное скольжение.
      1. В качестве альтернативы смыть пластины с M9, центрифуги на 1000 x g 1 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Добавьте стеклянное скольжение червей.
    3. Использование мягких тканей для слива любой избыток жидкости. Смотрите этот шаг под микроскопом рассечения.
    4. 10 мкл 95% спирта на червей и дайте им высохнуть на воздухе. Наблюдать за процессом под микроскопом рассечения и не позволяйте животных получить слишком сухой. Сразу же после того, как этанол испарилась от животных, переходите к следующему шагу.
      Примечание: Этанол очень быстро испаряется.
    5. Повторите шаг 3.1.4 дважды так, что черви являются фиксированными.
      Примечание: Это нормально для животных, чтобы выглядеть темнее и искаженной.
    6. 10 мкл DAPI (10 мкг/мл) для червей. Немедленно покрыть их с coverslip и уплотнение слайд с Гель прозрачный лак.
    7. После около 10 мин на флуоресцентным микроскопом просмотрите животных.
  2. Ацетон фиксации (альтернативный подход)
    1. Смыть тепло шокирован пластина из шага 2.8 с M9, центрифуги на 1000 x g 1 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Помыть лепешка с 1 мл раствора dH2O, собирать таблетки и удалить супернатант.
    2. 400 мкл 30% ацетона для 15 мин центрифуги на 1000 x g 1 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Используйте для мытья животных 2 500 мкл dH2O x. Выбросите супернатант.
    3. Добавить 200 мкл DAPI (10 мкг/мл), или 4 x количество объем всего червей, в трубе за 15 мин.
    4. Центрифуга на 1000 x g за 1 мин и удалить супернатант. Помыть лепешка 2 x с 500 мкл dH2O. место червей на стеклянных вставках, покрыть их с coverslips, печать слайда с Гель прозрачный лак и наблюдать животных под флуоресцентным микроскопом.

4. микроскопических изображений

  1. Включите источник ультрафиолетового света и флуоресцентным микроскопом. Включите компьютер, подключенный к Микроскоп.
  2. Загрузите слайд на флуоресцентным микроскопом. Используйте объектив малой мощности (10 X) чтобы найти червей, увеличить масштаб мощность до 400 X и сосредоточиться на образец.
  3. Откройте программное обеспечение, предоставляемое с микроскопом. Нажмите на «Приобретение» в меню; Щелкните дальше «Камеры» и выберите камеры, подключенной к Микроскоп; Это позволяет выбранной камеры для взаимодействия с программным обеспечением.
    Примечание: Различные Микроскопы могут меняться в операции.
  4. В том же «приобретение» нажмите на «Многомерный приобретения». Откроется новое окно навигации «Многомерные приобретения». Нажмите на кнопку «Многоканальный», и все доступные каналы появятся.
  5. Выберите синий, зеленый и ОПК (дифференциальной помехи контраст) для наблюдения за образец. В окне навигации «Многомерные приобретение» оставьте «Сине-DAPI», «Грин-ГФП» и «Серо-DIC», «Номарски» каналы Щелкните правой кнопкой мыши на другие каналы, такие как «Красно родамин» и «ярко белого поля», чтобы закрыть их.
  6. Во-первых измерить время экспозиции для каждого канала:
    1. Щелкните «Сине-DAPI» канал, выберите его и затем нажмите на «Мера» для того чтобы принять «живой» образ под DAPI канал с автоматической выдержкой. Появится новое окно с live-образа.
    2. На левой стороне окна живой изображения вручную настройте время экспозиции, если необходимо сделать изображение как желаемого.
    3. Наконец, нажмите на " "ОК» в окне live-образа. Это устанавливает время экспозиции под DAPI канал.
  7. Повторите шаг 4.6 для других каналов, «Грин-ГФП» и «Серо-DIC», «Номарски», чтобы настроить время экспозиции для этих каналов.
  8. В окне навигации «Многомерные приобретение» нажмите кнопку «Пуск», чтобы автоматически собирать 3 изображения под 3 различные каналы в порядке (см. выше) с конкретными воздействия раз как набор.
  9. Чтобы сохранить файл, перейдите в главное меню, нажмите на «Файл», а затем «Сохранить как». Имя входного файла и имя папки. Сохраните файл как файл формата по умолчанию для сохранения подробных изображений информацию для будущего использования.
  10. Экспорт файлов в других форматах:
    1. Перейдите в меню «Файл» и нажмите «Экспорт». Это откроет окно настройки экспорта.
    2. Задать имя файла и папки. Проверить «Создать папку проекта» чтобы лучше организовать данные. Программное обеспечение также позволяет пользователю указать 4 другие варианты: «Generate объединить изображения», «Использовать цвет для изображения канал», «Использование названия каналов» и «Только объединяемые изображение».
    3. Выберите тип нужного файла из раскрывающегося меню, такие как «TIF», «BMP», «Народная Самооборона», или «JPG» и других типов. Затем нажмите на «Старт» для экспорта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хлорид внутриклеточных канал белки (клик)-многофункциональный белки, которые сохраняются весьма различных видов12. Много исследований показывает, что CLICs регулировать клеточного стресса, autophagy, апоптоз, канцерогенеза, ангиогенез и макрофагов врожденный иммунный ответ в млекопитающих системы13,14,15,16 ,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья представлена быстрый и эффективный метод для проверки субцеллюлярные изменения протеина из цитоплазмы в ядро. Выражение протеина был показан GFP фьюжн, в то время как структура ядра была подтверждена DAPI окрашивание (рис. 3). Поскольку иммуноокрашивания C. elegans белков является сложной задачей, большинство C. elegans белка субцеллюлярные локализации характеризуются маркировать их с маркером белки, например GFP, ЛАЗ, mCherry и другие18

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего объявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans штаммов, используемых в этом исследовании были получены из центра генетики Caenorhabditis, который поддерживается национальных институтов здравоохранения - управление исследовательской инфраструктуры программы (P40 OD010440). Эта работа была поддержана низ: 1R03AG048578-01 Jun Лян, КЮНИ-CCRG 1501 до июня Лян и PSC-CUNY 66184-00 44 и 45 67248-00 для Jun Лян. Мы благодарим Кэти Дикарь-Данн за любезно обмена ее космической лаборатории. Все изображения флуоресценции были собраны на Квинс Колледж основного объекта. Мы благодарим William J. риса за его замечания по рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DAPIBiotium40043как Hoechst 33258, так и Hoechst 33342 также хорошо работает
OP50CGCOP50https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/
Kim WipeKimberly-Clark Corporationsoft tissue
Zeiss  Флуоресцентный микроскопZeiss
Axiovision Rel 4.8Программное обеспечение для микроскопаZeiss
AxioCam MR Rev3Цифровая камераZeiss
Инкубатор 
Микроцентрифуга
Прозрачный гель
60 мм Чашки
Стеклянные горки
Стеклянные покровные
1-20 &; L пипетка
20-200 & микро; L пипетка
200-1000 & микро; L пипетка
1-200 & микро; L наконечники
200-1000 &; Наконечники
L 1,5 мл Микроцентрифужные пробирки
Червячный пик
AX10 для ногтейстекладля пипетокдля дозатора из платиновой проволоки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Essers, M. A., et al. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).
  2. Oh, S. W., et al. JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).
  3. Gross, A., et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death. The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).
  4. Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. BH3-only proteins: a 20-year stock-take. The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).
  5. Mayorova, T. D., et al. Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses. PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).
  6. Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death. Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).
  7. Pedrazzini, E., Vitale, A. Protein biosynthesis and maturation in the ER. Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).
  8. Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).
  9. Evans, T. C. Transformation and microinjection. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  10. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  11. Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. Wormbook. , edited by The C. elegans Research Community (2006).
  12. Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator. The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).
  13. Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections. Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).
  14. Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).
  15. Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts. The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).
  16. He, G., et al. Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide. European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).
  17. Zhong, J., et al. Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation. PLoS One. 7 (6), e39378(2012).
  18. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).
  19. Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).
  20. Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (7), e101929(2014).
  21. Matus, D. Q., et al. Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression. Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).
  22. Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination. Cell. 118 (4), 439-452 (2004).
  23. Ames, K., et al. A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development. Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).
  24. Pekar, O., et al. Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche. Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).
  25. Schvarzstein, M., et al. DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis. Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).
  26. Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).
  27. Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans. Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPDAPI

Похожие статьи