Здесь мы подробно метод для живых клеток изображений регулируемых экзоцитоз. Этот метод использует FITC-декстрана, который накапливается в связанных с Лизосома органеллы, как репортер. Этот простой метод также позволяет различать различные виды регулируемых экзоцитоз в клетках, которые трудно манипулировать генетически.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Imaging FITC-декстран репортером для регулируемых экзоцитоз
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Регулируемые экзоцитоз представляет собой процесс, по которому груз, который хранится в секреторных гранул (SGs), выпущен в ответ на триггер секреторной. Регулируемые экзоцитоз является основополагающим для межклеточные связи и является ключевым механизмом для секреция нейротрансмиттеров, гормоны, воспалительных посредников и других соединений, различных клеток. По крайней мере три отдельных механизмов известны для регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, где один SG полностью сливается с плазматической мембраны, поцелуй и побегите экзоцитоз, где один SG временно предохранители с плазматической мембраны, и составные экзоцитоз, где несколько SGs сливаются друг с другом, до или после сплавливания SG с плазматической мембраны. Тип регулируемого экзоцитоз, предпринимаемые ячейки часто продиктовано тип секреторной триггера. Однако многих клеток, секреторные один триггер может активировать несколько режимов регулируемых экзоцитоз одновременно. Несмотря на обилие и значение различных видов и типов клеток механизмы, которые определяют различные режимы секреции основном нерешенными. Одна из главных задач в расследовании различных режимов регулируемых экзоцитоз, является трудность проведения различия между ними, а также изучать их отдельно. Здесь мы описываем использование флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-декстран как репортер экзоцитоз и живой клетки, воображения, чтобы различать разные пути регулируемых экзоцитоз, сосредоточив внимание на составные экзоцитоз, основанный на надежность и продолжительность события exocytic.
Введение
Регулируемые экзоцитоз является основным механизмом, который легко сделал груза освобождается от секреторных клеток в ответ на конкретного триггера. Груз предварительно сформированы и поглощенных в секреторные пузырьки, в которых он хранится до тех пор, пока триггер передает сигнал для выпуска SGs содержание. Различные типы сигналов может привести к различных режимов регулируемых экзоцитоз, или различные виды регулируемых экзоцитоз может произойти одновременно. Известны три основных видов регулируемых экзоцитоз: полный экзоцитоз, который включает в себя полное слияние одного секреторных гранул с плазматической мембраны; поцелуй и побегите экзоцитоз, который включает в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка
- Подготовка RBL культуры средств массовой информации
- Смесь 500 мл низкий глюкозы Дульбекко изменения среднего (DMEM) орла с 56 мл плода бычьим сывороточным (ФБС), 5,5 мл раствора пенициллина стрептомицином нистатин, 5,5 мл раствора L-глютамин 200 мм. Это приводит к низкой глюкозы DMEM дополнена 10% FBS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 единиц/мл пенициллин, 12 единиц/мл нистатин и 2 мм L-глютамина.
- Фильтр СМИ с помощью топ вакуумный фильтр 0,22 мкм поры и хранить при 4 ° C.
- Техническое обслуживание RBL клеток.
- Вырасти клетки руб максимальная confluency 90% в 10 см блюдо. Если культура клетки здоровы....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1a представляет схематично как FITC-декстран могут выступать в качестве репортера регулируется экзоцитоз, и охарактеризовать различные режимы exocytic событий. Во-первых клетки инкубируют с FITC-декстрана, который интернализации, Пиноцитоз и сортируются в SGs. Так как SGs MCs LROs, их низкий рН гасит флуоресценции FITC, показанный здесь как Черный гранул (A-C, я). Когда клетки вызваны secretagogue и SGs предохранитель с плазматической мембраны, формир.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем, как трассировка флуоресценции FITC-декстран загружается в SGs может использоваться для специально захвата составные экзоцитоз событий. Это было достигнуто, установив Микроскоп, чтобы получить изображение каждые 15 секунд, обеспечивая тем самым, что со временем будет записано только долгосрочные мероприятия, и таким образом исключая короткие события, которые будут соответствовать полное экзоцитоз или поцелуй и побегите экзоцитоз. Чтобы установить метод, мы показали, что нокдаун изоформ Rab5, которые вы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса
Благодарности
Мы благодарим д-р U. Ashery за щедрый дар cDNA. Мы благодарим Drs. G. массовые, L. Mittleman, м. Shaharbani и Y.Zilberstein от Sackler сотовых и молекулярной визуализации Центр за их неоценимую помощь с помощью микроскопии. Эта работа была поддержана двусторонней научного фонда США Израиль (Грант 2013263 R. саги-Айзенберг, I. Хаммел и S.J.Galli) и предоставить 933/15 от Израиля научный фонд, созданная Израилем академия наук (для R.Sagi-Айзенберг ) и низ грантов U19 Ай 104209 и R01 AR067145 (чтобы S.J. Galli).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Биологические индукции | низким содержанием глюкозы | 01-050-1A | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 12657 | |
| Пен-стрептокок-нистатин раствор | Биологические индукции | 03-032-1B | |
| L-глутамин 200 мМ раствор | Биологические индукторы | 03-020-1A | |
| FITC декстран 150K | Sigma-Aldrich | 46946-500MG-F | |
| Трипсин/ЭДТА Раствор B | Биологические индукторы | 03-052-1A | Теплые в 37 градусов; C водяной баней перед использованием |
| Верхний вакуумный фильтр 0,22 & микро; m размер пор | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Фильтрующий блок для шприцев из ацетата целлюлозы, 0,22 &; m размер пор | Sartorius | 16534K | |
| Камерное покровное стекло | Thermo scientific | 155411 | |
| Corning tissue-culture обработанные питательные чашки | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Anti-DNP моноклональный IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-HSA (Ag) | Sigma-Aldrich | A6661 | Избегайте прямого воздействия света |
| Хепес буфер 1M, pH 7,4 | Биологические индукции | 03-025-1B | |
| CaCl2 | MERK | 102382 | |
| Глюкоза | BDH Laboratories | 284515V | |
| Хлорид аммония | MERK | 1145 | |
| PIPES дикалийная соль | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Гидрат | ацетата кальцияSigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Тетрагидрат ацетата магния | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| Глутамат калия (L-глутаминовая кислота моногидрат соли калия) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 2PO4 | MERK | 6346 | |
| NaCl | MERK | 106404 | |
| MgCl2 | MERK | 105833 | |
| KCl | MERK | 104936 | |
| Electroporator | Конфокальный | BTX ECM830 | |
| , Zeiss | Zeiss | LSM 5 Pascal, Axiovert 200M, | использованный на рисунке 3. Оснащенный электронным инкубатором с контролируемой температурой |
| конфокальным микроскопом, Zeiss | Zeiss LSM | 800, Axio Observer.Z1 /7 | Использовано на рисунке 2. Оснащенная детектором GaAsP, электронным инкубатором с контролируемой температурой воздушным |
| потоком Конфокальный микроскоп, Leica | Leica SP5 | используется на рисунке 1. Оснащенные детектором Leica HyD и инкубатором верхней ступени (околаб) | |
| Клетки | RBL-2H3 были клонированы в лаборатории Рубена. Сираганяна. Смотрите ссылку 67 |
Ссылки
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
- Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
