Методическая статья

Цифровая ПЦР для количественного определения циркулирующих микроРНК в острый инфаркт миокарда и сердечно-сосудистых заболеваний

DOI:

10.3791/57950

⸱

3 июля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующих микроРНК показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда. В этом исследовании мы описываем протокол для извлечения Мирна, обратной транскрипции и цифровой ПЦР для количественной оценки абсолютной интерферирующим в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующих сыворотки микроРНК (интерферирующим) показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда (ами), освобождаются от сердечно-сосудистых клеток в кровоток. Циркулирующих интерферирующим очень стабильны и могут быть количественно. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологии и некоторые интерферирующим шоу высокого ткани и специфики болезней. Поиск нового биомаркерами для сердечно-сосудистых заболеваний имеет важное значение для медицинских исследований. Совсем недавно была изобретена цифровая полимеразной цепной реакции (dPCR). dPCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зонды, позволяет конкретных прямых абсолютной количественной оценки. dPCR демонстрирует превосходные технические качества, включая низкий изменчивость, высокой линейности и высокой чувствительностью по сравнению с количественным полимеразной цепной реакции (ПЦР). Таким образом dPCR является более точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки адаптивной, особенно для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы опишем, как для эффективного выполнения цифровой ПЦР с целью оценки абсолютной копией номер в образцах сыворотки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Циркулирующих интерферирующим были определены как перспективные маркеров для целого ряда заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний1. Интерферирующим малы, -кодирования молекулы одноцепочечной РНК (длиной около 22 нуклеотидов) участвуют в post-transcriptional регулирование через изменения РНК перевода и влияющих на выражение гена2, и выпускаются в обращение в физиологических и патологических государствах. Количественном выражении конкретных интерферирующим могут быть связаны с патологией, и некоторые интерферирующим показать высокий ткани и болезни специфика1. Сердечно-сосудистых заболеваний адаптивной стали привлекательными кандидатами как нового биомаркерами потому, что они чрезвычайно стабильны в сыворотке крови и может легко быть количественно с помощью ПЦР методологии3. Потенциальную ценность интерферирующим качестве биомаркеров для инфаркта миокарда были оценены в небольших исследований, но проверки в большой когорты хватает2. К примеру мир-499 встречается сильно выражена в мышцу миокарда, и было показано, значительно возросла в ами4,5,6. Кроме того, он регулирует запрограммированы гибели клеток (апоптоз) и дифференциация кардиомиоцитов и таким образом участвует в нескольких механизмов после ами7. За исключением некоторых небольших исследований, превосходства и добавочное значение интерферирующим для диагностики ами отчетности превосходства или равенства к высок чувствительности сердечной troponins не еще было доказано в крупномасштабных исследований2,5 6, ,8. Более перспективные исследования в большой когорты таким образом, необходимо оценить потенциальную ценность диагностических адаптивной. Кроме того методы количественной оценки Мирна необходимо оптимизировать и стандартизированных с использованием сопоставимых протоколы9. Стандартизированных анализы могут уменьшить несогласованные результаты и может помочь интерферирующим стать потенциальным биомаркеров для рутинной клинического применения, как биомаркеров должны измеряться в воспроизводимый способом обеспечить их клинического применения.

Недавно dPCR была введена в качестве конечного анализа. Это разбивает образца на приблизительно 20 000 индивидуальных реакций10. DPCR система затем использует математические Пуассона статистический анализ флуоресцентные сигналов (положительных и отрицательных реакций), позволяя абсолютный количественной оценки без стандартной кривой10. При объединении dPCR датчиками флуоресцентные гидролиза, весьма конкретных прямых абсолютной количественная оценка интерферирующим стало возможным. Цифровая полимеразной цепной реакции, как показано, демонстрируют превосходные технические качества (включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимости, высокая степень линейности и высокой чувствительностью) для количественного определения уровней микроРНК в обращения по сравнению с количественной реальном масштабе времени PCR10,11. Эти превосходные технические качества может помочь смягчить нынешние ограничения на использование циркулирующего интерферирующим в качестве биомаркеров и может привести к созданию интерферирующим биомаркеров в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний, а также как диагностический метод в Общие. В предыдущем исследовании мы недавно применяется dPCR абсолютной количественного определения циркулирующих интерферирующим у больных с AMI и смогли продемонстрировать превосходное диагностический потенциал, по сравнению с количественной оценки интерферирующим ПЦР12.

В этом издании мы хотим продемонстрировать, что с помощью dPCR точные и воспроизводимые метод непосредственно количественной оценки распространения сердечно-сосудистых адаптивной. Абсолютная количественная оценка Мирна уровней в сыворотке, используя цифровой PCR, показывает потенциал для использования в больших Multi-центр сердечно-сосудистой системы клинических испытаний. В этом издании мы подробно описать, как эффективно выполнять цифровой ПЦР и как определить номер копии абсолютный микроРНК в сыворотке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Добыча Мирна от сыворотки/плазмы

Примечание: Для того, чтобы надлежащим образом оценить количественно адаптивной, правильный микроРНК изоляции от сыворотки/плазмы представляет собой решающий шаг. Главное иметь в виду, особенно потому, что существуют различные протоколы, должен придерживаться того же рабочего процесса при обработке образцов. В этом протоколе Мирна добывается из 50 мкл сыворотки. Не используйте более чем 200 мкл, как этот предел процесс правильного извлечения.

  1. Подготовить сыворотки или оттепель замороженных образцов.
  2. Добавьте 250 мкл (5 томов) коммерческие лизис реагента в 50 мкл сыворотки. Поддержка lysis, vortexing. Поместите трубку с lysate на скамейке при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Спайк lysate с 3.5 мкл Спайк в управления (1.6 x 107 копий/мкл) и смешать их на vortexing.
  4. 50 мкл хлороформа (то есть, равное количество относительно начала образцов сыворотки) для отделения фазы. Встряхните трубки для 15 s. место трубку на скамейке при комнатной температуре на 2-3 мин.
  5. Для этапа разъединения центрифуга трубки на 12000 x g при 4 ° C на 15 мин.
    Примечание: в настоящее время образцы разделены на верхней водной фазе, содержащие РНК, белый межфазной и ниже, розовый органические фазы.
  6. Передача верхняя водной фазе (100 мкл), содержащие РНК в новую трубу. Не передавать любой материал, белый интерфаза, как это фальсификация правильного подсчета РНК.
  7. Добавьте 150 мкл (т.е., 1.5 x объема передаваемых образца) 100% этанола. Смешайте материалы, закупорить их вверх и вниз. Не центрифуга для них и быстро перейти к следующему шагу.
  8. Пипетка 250 мкл образца на коммерческих спин столбец в 2-мл пробирку коллекции. Закройте крышку. Центрифуга для столбца > 8000 x g при комнатной температуре 15 s. отклонения потока через.
  9. Мкл 700 коммерческих стиральных буфера № 1 в столбце спина. Закройте крышку и центрифуги столбца > 8000 x g при комнатной температуре 15 s. Отменить прогон Отмывающий буфер.
  10. Добавьте 500 мкл коммерческих стиральных буфера номер 2 в столбце спин. Закройте крышку и центрифуги столбца > 8, 000 x g при комнатной температуре 15 s. Отменить прогон Отмывающий буфер.
  11. Пипетка 500 мкл 80% этанола в столбце спина. Закройте крышку, центрифуга столбца > 8, 000 x g при комнатной температуре на 2 мин отбросить коллекции трубка с потока через.
  12. Трансфер столбце спина в новой коллекции 2-мл пробирку. Центрифуга для столбца на полной скорости с открытой крышкой для просушки мембраны. Выбросите коллекции трубка с потока через.
  13. Перевести столбце спина в новой коллекции 1,5 мл трубки. Элюировать РНК путем применения 30 мкл РНКазы свободной воды непосредственно к центру мембраны. Закройте крышку. Центрифуга для столбца на полной скорости на 1 мин.
  14. Магазин РНК-70 ° c.
    Примечание: Для хранения очищенной РНК в РНКазы свободной воды от-70 ° C до-20 ° C обеспечивает не деградации мРНК на 1 год. После производителя протокол минимальное количество РНКазы свободной воды, чтобы разбавить РНК — 10 мкл. использование менее 10 мкл могут недостаточно гидрата мембраны и снижения общей доходности РНК.

2. Обратная транскрипция

Примечание: Комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) был синтезирован по протоколу следующие 15 мкл обратная транскрипция (RT) (общая реакция объем).

  1. Оттепель в комплект RT на льду. Держите ферменты в холодильнике как можно дольше предотвратить их от унизительного и спина их вниз перед использованием. Оттепель RT грунтовки на льду и уменьшается их перед использованием.
  2. Подготовьте смесь мастер, как описано в таблице 1.
  3. Комбинат 10 мкл мастер смеси и 5 мкл извлеченные РНК в скважину в 96 хорошо плиты.
  4. Центрифуга хорошо пластины на 2000 x g при 4 ° C на 2 мин.
  5. Используйте протокол тепловой цикл, описанные в таблице 2 для обратной транскрипции.
    Примечание: Как описано ниже, cDNA могут непосредственно обрабатываться в цифровой машины ПЦР (см. Таблицу материалы); Кроме того она может храниться при температуре-20 ° C.

3. капелька поколения и цифровой PCR

Примечание: Цифровой ПЦР была выполнена с использованием следующих 40 мкл протокола.

  1. Оттепель в коммерческих dPCR смесь, подготовленный cDNA и праймеры PCR на льду. Центрифуга для них незадолго перед использованием.
  2. Подготовьте смесь мастер, как описано в Таблица 3.
  3. Добавьте 1.33 мкл/хорошо RT продукта и центрифуги кратко.
  4. Пипетка 20 мкл пример в каждой скважине 8-Ну кассеты (средний ряд).
    Примечание: Если кассета 8-Ну не заполнены полностью, заполните оставшиеся скважин с non шаблона элементов управления (фнт), опустить cDNA (т.е., RT продукт производится с водой вместо извлеченный РНК) или коммерческих буфера dPCR. НПС служит элемент управления загрязнения. Вода, не должны использоваться в оставшихся скважинах, потому что это будет отрицательно влиять на качество формирования капли.
  5. Пипетка 70 мкл капля масла поколения для датчиков в нефтяных скважинах (Нижняя строка) 8-Ну кассеты.
  6. Поместите прокладку поверх 8-Ну кассеты и кассеты в генератор капелька. Закройте генератор капелька. Ждать, пока 3 индикатор горит зеленым.
    Примечание: в настоящее время создаются капельки.
  7. Тщательно и медленно перевести 40 мкл формируется капля образца (верхняя строка) на отдельных скважин 96-луночных плиты, закупорить.
  8. После завершения формирования капли на образцах, печать пластину ПЦР с pierceable dPCR фольга на 180 ° C для 4 s.
  9. Фольга герметичный ПЦР пластину в циклователь и цикла, как описано в таблице 4, рампы со скоростью 2,5 ° C/сек.

4. капелька чтение и анализ

  1. Передача пластину от тепловой cycler к основанию пластины держателя. Затяните пластину PCR, поместив в верхней части держателя пластины на пластину для ПЦР.
  2. Запустите программное обеспечение коммерческих dPCR.
  3. Введите имя образца, имя эксперимент и целевой установки. Выберите абсолютный количественной оценки.
  4. Запустите капелька, чтение, нажав кнопку Запуск. Выберите FAM/HEX или FAM/Вик обнаружения химии при работе с зондами гидролиза.
    Примечание: Коммерческие dPCR программного обеспечения будет затем авто анализ данных.
  5. Проверьте капелька чисел в таблице результатов для обеспечения правильного капелька поколения.
  6. Выберите все скважины с же количественных Мирна и нажмите кнопку анализ. Используйте 2D пятно следует отметить позитивные капельки и вручную исправить auto проанализированных данных (рис. 1).

5. правильные расчеты на образце

  1. Нормализовать образца умножением образец нормализации факторов (NF).
    NF = средний [C. elegans мир-39 измерений]все образцы/ [C. elegans мир-39]данного образца
  2. Вычислите окончательного Мирна сывороточной концентрации, регулируя для разбавления факторов (DF).
    [Мирна] окончательный = [Мирна]необработанное значение x DFRT xdPCR DF x DFEx
    Где:
    [Мирна] необработанное значение = Мирна, количественно коммерческих dPCR программного обеспечения;
    DFRT = коэффициент разбавления шаблона в обратная транскрипция;
    DFdPCR = коэффициент разбавления шаблон в dPCR;
    DFEx = коэффициент разрежения в добыче.

6. синтетические олигонуклеотида разрежения серии

  1. Оттепель лиофилизированные синтетических олигонуклеотида на льду. Кратко центрифуги.
  2. Разбавить лиофилизированные синтетических олигонуклеотида в свободной от нуклеиназы воде до конечной концентрации 10 пмоль / мкл. кратко центрифуга его.
  3. Развести его в свободной от нуклеиназы водой, как описано в таблице 5. Центрифуга для разбавления кратко между каждым шагом разрежения в 8000 x g 10 s.
  4. Продолжить с обратной транскрипции, как описано в шаге 2 и анализировать образцы с цифровой ПЦР, как описано в разделе Шаг 3 и шаг 4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цифровые PCR, в сочетании с флуоресцентные гидролиза зондов позволяет исследователям непосредственно определить абсолютное количество конкретных интерферирующим в копии/мкл. Как образец в dPCR секционируется в приблизительно 20 000 индивидуальных реакциях PCR, dPCR не требует технического реплицирует10. Система dPCR использует математические Пуассона статистический анализ флуоресцентные сигналов (отличающихся между положительной и отрицательной реакции) включение а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цифровая ПЦР является относительно новой конечной точки методом ПЦР, что позволяет прямой абсолютной количественной нуклеиновых кислот в рамках выборки. Метод обладает особыми преимуществами, включая снижение изменчивости, увеличение повседневной воспроизводимость и превосходная чувствительность11,12. Кроме того, из-за разделения образца на приблизительно 20 000 одной реакции и анализа конечной точки, dPCR более устойчивы к мешая веществ в PCR, по сравнению с кол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют без подтверждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland217184набор для экстракции микроРНК. Набор содержит коммерческий буфер RWT (названный в рукописи номером один)  и RPE (названный номером два в рукописи).
Сыворотка/плазма miRNeasy Spike-in-Control; микроРНК Syn-cel-miR-39; 10pmolQiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland219610Spike-in for normalization, Sequence: 5'-UCACCGGGUAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions)Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4366597Набор для обратной транскрипции микроРНК
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4440887анализы, используемые в обратной транскрипции
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4440887Номер анализа 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4440887Номер анализа 000200
PCR Plate, 96-лунка, сегментированный, полуодетыйThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАAB090096 луночный планшет для обратной транскрипции
Microseal ' B’ seal SealsBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, СШАMSB1001фольгой для обеспечения надлежащего хранения
C1000 Touch ThermalCycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1851196Амплификатор используется для обратной транскрипции
Droplet Digital PCR>
100 нмоль РНК олиго has-miR-499-5pIntegrated DNA TechnologiesCustomПоследовательность: 5'-фос-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix for Probes (No dUTP)Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, США 1863024Supermix, используемый в генерации
капель TaqMan MicroRNA Assays AppliedBiosystems, Inc., Foster City, CA, США4440887анализы, используемые в цифровой ПЦР (флуоресцентный гидролизный зонд)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4440887Номер 001352, коммерческие праймеры
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)Applied Biosystems, Inc., Фостер-Сити, Калифорния, США4440887Номер анализа 000200, коммерческие праймеры
DG8 Картриджи и прокладкиBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1864007 Картридж берет до 8 образцов для генерации капель
DG8 Картридж ДержательBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1863051Содержит картриджи в
генерации капель Масло для генерации капель для зондовBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1863005Масло, используемое в генерации капель
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США 1200192596 луночная пластина для ddPCR
PCR Plate Термосвариваемый, фольга, колючий.Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1814040Прокалываемая фольга, совместимая со считывателем капель
ddPCR Считыватель капель МаслоBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1863004Масло, используемое для считывания капель
QX100 или QX200 Генератор капельBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США 1863002Генератор капель, генерирует капли из эмульсии образца/масла
PX1 PCR Запечатыватель пластинBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1814000Запечатывает планшет перед
сенсорным термоциклером PCR C1000Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США 1851196Амплификатор, используемый для
считывателя капель ddPCR QX100 или QX200Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1863003Считывает ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные капли с помощью оптического детектора
Контроль буфера ddPCR для зондовBio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США1863052Контроль бланков  и заполнить оставшиеся лунки 8-луночной кассетной
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, США1864011 Программа для чтения капель
Prism Windows 5GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, СШАПрограмма для статистического анализа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи