Enterochromaffin (EC) клетки составляют небольшую часть желудочно-кишечного тракта эпителиальных клеток. EC клетки электрически возбудимых и освобождение серотонина, но трудности в культивировании и выявления EC клетки имеют ограниченный физиологические исследования. Представленные здесь метод устанавливает основной культуры модель для изучения единичных клеток EC по электрофизиологии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Вся ячейка электрофизиологии первичного культивировали мышиных Enterochromaffin клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Enterochromaffin (EC) клетки в эпителии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) составляют самая большая субпопуляция enteroendocrine клеток. Как специализированные Сензорные клетки клетки EC смысл Люминал стимулы и конвертировать их в серотонина (5-hyroxytryptamine, 5-HT) релиз события. Однако электрофизиологии эти клетки плохо понимают, потому что они трудны для культуры и определения. Метод, представленные в этой бумаги очертания первичной EC клеточных культур оптимизирован для одной ячейки электрофизиологии. Этот протокол использует репортером трансгенных голубой флуоресцентный белок (СЛП) для идентификации клеток мыши EC в смешанных первичных культур, развитии подход для получения высокого качества записи клеточных электрофизиологии в режимах напряжения и тока клещи.
Введение
Желудочно-кишечного эпителия (Ги) является разнообразное сообщество, состоящее из нескольких типов клеток. Enteroendocrine клетки составляют примерно 1% от всех эпителиальных клеток, и клетки enterochromaffin (EC) являются крупнейшим enteroendocrine клеток населения1. Недавние исследования показывают, что enteroendocrine2 и3,EC4 клетки электрически возбудимых. Мы заинтересованы в понимании основной EC клеток электрофизиологии. Таким образом целью данного исследования было установить первичных культур клеток EC, оптимизированный для клеточных электрофизиологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) клиники Майо. Часть культуры главной ячейки этот протокол основан на опубликованных ранее методы, которые могут ссылаться для дальнейших деталей10. Все экспериментальные процедуры должны быть одобрены (IACUC), и все эксперименты должны выполняться в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил.
1. Культура подготовка
-
Средства массовой информации.
- Подготовить EC клеток, полный культуры средств массовой информации с высокой глюкозы [4500 мг/Л] Дульбекко изменен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Культуры:
Основная мышиных эпителиальных клеток, сделанные из трансгенные модели Tph1-CFP придают блюдам после 4 часов и готовы для физиологических опытов между 24-72 ч. Когда культура условия не оптимизированы, эпителиальных клеток культуры состоял из больших сгустков, плавающие сотовой мусора, поврежденные мембраны и слабый сигнал СЛП в ЕС клеток (рис. 1А). Культур, которые были оптимизированы для электрофизиологии состо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Полностью понимая EC клеточной функции требует высокого качества первичной культуре метод для создания клетки для клеточных электрофизиологии. Основных культур эпителия GI традиционно затруднен из-за низкой выживаемости. Облегчение этот смешанным фактором, нынешний метод дает культур сингулярных клеток EC от большого или малого кишечника, которые способны выжить в течение нескольких дней.
Мы обнаружили, что решающее значение для повышения качества культуры пригодны для электрофизиологии были с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Авторы благодарят г-жа Линдсей Басби для административной помощи и г-н Роберт Хайет из Майо клиника отдел инженерного дизайна и 3D печати вставить блюдо культуры. Эта работа была поддержана NIH K08 AB (DK106456), пилот и осуществимости Грант АБ из клиники Майо центр для клеток сигнализации в гастроэнтерологии (низ P30DK084567) и 2015 американской гастроэнтерологической ассоциации исследования ученый премии (Ага RSA) AB и низ R01 GF (DK52766).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашка для культуры 100 мм x 15 мм | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Трансферная пипетка | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 мл серологическая пипетка | Corning (Falcon) | ||
| 50 мл конического | Corning (Falcon) | ||
| 15 мл конического | Corning (Falcon) | ||
| 1 000 мл барьерные наконечники для пипеток | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Стеклянные донные тарелки MatTek | MatTek | Corporation P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Микродиссекционные щипцы - очень тонкие, сверхдлинные точки | Fine Science Инструменты | SB12630M | |
| хирургические ножницы-острые | Nasco | 14002-14 | |
| Ножницы для микродиссекции | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21 г x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Мыши | Jackson | Stock # 028366 | Используйте самцов или самок мышей в возрасте от 4 до 7 недель |
| Неметаллические иглы для шприцев Microfil (34 калибра, 67 мм) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Парапленка "M" Лабораторная пленка | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6 мл шприц с обычным наконечником люэра | Моноджект | ||
| Шприц 3 мл со штатным наконечником люэра | Моноджект | ||
| <стронг>Электрофизиологическое оборудование | |||
| Усилитель | Молекулярные устройства | Axopatch 200B | |
| Система сбора данных (daq) | Молекулярные устройства | Digidata 1440A | |
| Преобразователь | сигналовМолекулярные приборы | CyberAmp 320 | |
| Программное обеспечение | Молекулярные приборы | pClamp 10.6 |
Ссылки
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
