Методическая статья

Подтип конкретных оптический потенциал действия записи в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов желудочков

DOI:

10.3791/58134

⸱

27 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department I, University Hospital Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich, 2German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Munich Heart Alliance, 3Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод оптически изображение потенциалы действия, особенно в кардиомиоцитов желудочков как индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Метод основан на промоутер driven выражение напряжения чувствительных флуоресцентный белок.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiomyocytes, образующиеся человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-CMs) являются инструментом, возникающих в сердечно-сосудистых исследований. Однородная популяция клеток, а iPSC-CMs, порожденных текущей дифференциация протоколы представляют собой смесь клеток с желудочковой-, предсердий-и узловые как фенотипы, которые усложняет фенотипические анализы. Здесь представлен метод для оптически записи потенциалы действия конкретно от желудочков как iPSC-CMs. Это достигается путем лентивирусные трансдукция с конструкцией, в которой генетически закодированный напряжения Индикатор находится под контролем элемента желудочков конкретной промоутера. Когда iPSC-CMs преобразованы с этой конструкции, датчик напряжения выражается исключительно желудочков подобных клеток, позволяя оптических мембраны подтип конкретных потенциальных записи с помощью микроскопии флуоресцирования промежуток времени.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кардиомиоцитов (CMs), производные от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) являются новым инструментом для рассечения молекулярных механизмов болезни сердца, расследовать Роман терапии и экран для сердца побочных эффектов1,2 ,3. С самого начала аритмогенная заболеваний, таких как channelopathies был важным направлением этой области исследования4. Следовательно методы расследования электрические фенотипы CMs, например аритмий или изменения в морфологии потенциал действия (AP), находятся в центре этой технологии.

Важным фактором в применении iPSC-CMs является, что текущие протоколы сердца дифференциация не приводят к однородная популяция клеток. Вместо этого они являются скорее смесь из клетки, напоминающие синусового узла, фибрилляция и желудочковая CMs на различных уровнях созревания5,6,,78. Эта разнородность может быть источником соответствующих экспериментальных изменчивости, особенно если исследованы параметры, такие как продолжительность AP (APD), который неразрывно различаются подтипы см (например, APD короче предсердий, чем в желудочковой CMs). Традиционный подход к решению этой проблемы является расследование одного iPSC-CMs, с помощью метода зажим патч и классифицировать каждой ячейки как узловой-, предсердий-, или желудочков как, на основе ее AP морфология9. Любой последующий анализ может быть затем ограничен в клетки, представляющие см подтип интерес. Основным недостатком данной стратегии является его ограниченной пропускной способности и отсутствие масштабируемости. Кроме того захватнический характер патч зажим электрофизиологии не позволяют изображений же клетки последовательно в течение длительного времени.

Здесь мы подробно экспериментальный метод10 , разработаны для оптически изображения APs в конкретных подтипы iPSC-CMs. Это преодолевает проблему неоднородности подтип и резко повышает пропускную способность по сравнению с традиционными методами, позволяя быстрое фенотипирование iPSC-CMs проведение генетических вариантов или в подверженными фармакологических агентов.

Обзор подтип-оптических изображений подход

Генетически закодированный напряжения Индикатор (GEVI), свойства которых флуоресценции изменить деполяризации и реполяризации клеточной мембраны, используется для оптически изображение изменения мембранного потенциала CMs. GEVI, здесь это напряжение зондирования флуоресцентный белок VSFP-CR11, которая состоит из напряжения зондирования трансмембранного домена сливается с парой Грин (клевер) и красный (mRuby2) флуоресцентный белок (рис. 1A). Благодаря близости двух флуорофоров возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к небольшую часть энергии возбуждения, передаются в красных флуоресцентных белков через передачи энергии резонанса Фёрстер (лад). Таким образом возбуждения зеленого флуоресцентного белка приводит к эмиссии из зеленых и красных флуоресцентных белков (рис. 1A, верхняя группа). Когда клетки depolarizes, структурной перестройки датчика напряжения происходит что переводится в переориентации двух флуоресцентных белков, повышение эффективности ладу. Таким образом даже больше энергии возбуждения передается от зеленого до Красного флуоресцирующего белка (рис. 1A, Нижняя панель). В результате в ячейку деполяризованный, зеленая Флуоресценция выбросов диммер, и красной флуоресценцией выбросов ярче, чем в камере в отдыхая мембранного потенциала (рис. 1B).

figure-introduction-1
Рисунок 1: оптическая томография мембранного потенциала с VSFP-ручей (A) A схема с изображением действий напряжения чувствительных флуоресцентный белок, проявленную VSFP-CR. При деполяризации мембраны клетки структурной перестройки в напряжение зондирования трансмембранных доменов переводит в переориентации Грин (ГПУП) и красный (RFP) флуоресцентный белок, повышение эффективности внутримолекулярной Фёрстер передача энергии резонанса (лад). (B) выбросов спектры VSFP после возбуждения GFP в клетках на мембранного потенциала покоя (Верхняя панель) и в деполяризованный клетках (Нижняя панель) изображены. Спектральные изменения при деполяризации преувеличен для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Изменения в ладу эффективность зеркального отображения колебаний мембранного потенциала отражаются с помощью микроскопа флуоресценции оснащены изображения разделителя, который отделяет красной и зеленой флуоресценцией выбросов и проецирует их на две прилегающие районы Микросхема sCMOS камеры (рис. 2). С этой настройки флуоресценции выбросов на двух разных волны полосы могут быть записаны одновременно, что позволяет расчет коэффициента красно зеленая Флуоресценция отразить мембранного потенциала в каждом изображении покадровой серии.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Настройка системы,. Основные компоненты системы, используется для изображений, которые изображены спектральные изменения напряжения чувствительных флуоресцентный белок, зеркального отображения потенциальных изменений мембраны с высоким временным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Выражение VSFP-CR в CMs достигается лентивирусные трансдукции. Направлять проявление интереса к подтипу см, несущего содержит элемент промоутер ( MLC2v усилитель), который конкретно диски транскрипции в iPSC-CMs желудочков как10. Когда iPSC-CMs, которые представляют собой смесь предсердий как, узловой как и желудочков подобных клеток преобразованы с этой Лентивирусы, VSFP-CR выражается только в клетках желудочков как. Так как оптический потенциал действия изображений зависит от флуоресцентных датчик, записанные потенциалы действия исключительно представляют см подтип интерес (рис. 3).

figure-introduction-3
Рисунок 3: промоутер управляемый VSFP выражение для подтипа специфические мембраны потенциал изображений. () Эта схема показывает, как достигаются cardiomyocyte оптический потенциал действия подтип конкретных записей. (b) iPSC-CMs инфицированных VSFP под контролем желудочков специфических MLC2v-усилитель показываются. Выражение датчика напряжения наблюдается только в желудочков как CMs в канале GFP (левая панель). Также предоставляются фазового контраста (средняя группа) и накладываемого изображения (правая панель). Белыми пунктирными линиями Марк границ ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка iPSC производные кардиомиоцитов изображений

Примечание: Методы для iPSC культуры и сердечных дифференциации были опубликованы до12,13,14 и здесь не обсуждаются подробно. Рекомендуется очищение iPSC-CMs ручного microdissection, разделения магнитных клеток или лактата выбор, в зависимости от дифференциации протокол, используемый. Для следующих протокола эксплантов microdissected от побоев областей, созданных с помощью монослоя дифференциация протокол13, были приняты на 15-й день сердца дифференциации и культивируемых до дня 30 фибронектин покрытием пластин, как описано до10.

  1. Возьмите клетки культуры пластин из инкубатора и вручную собирать сердца эксплантов в microcentrifuge трубок с помощью пипетки 200 мкл. После осаждения, аспирационная супернатанта культуры клеток и аккуратно помыть эксплантов, 2 x с Хэнком в сбалансированной соли раствора (HBSS).
  2. Отделить iPSC-CMs, добавив коллагеназы типа II (430 ед/мл в HBSS) и инкубировать их при 37 ° C за 30 мин.
  3. После того, как осаждение оставшихся крупноклеточный сгустки, собирать супернатанта, содержащий диссоциированных единого iPSC-CMs и добавить свежие см обслуживания носитель, содержащий высокий плода бычьим сывороточным (ФБС) концентрации (DMEM-F12, 20% FBS, 2 мм L-Glutamine, 1: 100 мкм несущественные аминокислот, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином и β-меркаптоэтанол 0,1 мм).
  4. Если крупноклеточный сгустки остаются повторите диссоциации. Собрать один iPSC-CMs центрифугированием и Ресуспензируйте их в среде см с низкой концентрацией FBS (2% FBS).
  5. Повторное заполнение одного iPSC-CMs в плотности, позволяя последующей визуализации единичных клеток на 3,5 см стекло дно клетки культуры microdish, которая покрыта фибронектина (2 мкг/см2). Оптимизируйте плотность посева до участия в экспериментах высокой пропускной способности. Как правило 5 – 10 сердца эксплантов за 3,5 см блюдо достаточно; Однако это сильно зависит от размер экспланта и чистоты.
  6. Культура единого iPSC-CMs после их диссоциации в средстве обслуживания см, содержащий 2% FBS для по крайней мере 48 часов для обеспечения достаточного возмещения.
    Примечание: В следующих шагах, iPSC-CMs преобразованы с человека, кодирование GEVI VSFP-CR под контролем MLC2v усилитель10 для достижения выражение GEVI желудочков конкретных. Кроме того лентивирусные конструкции, позволяя выразить GEVI специально в узловой или трепетания как клетки или неспецифических конструкции, укрывательство повсеместно выразил курьер промоутер, может быть используемые10. По запросу предоставляются лентивирусные плазмид.
    Предупреждение: При работе с лентивирусные частиц, Обеспечьте условия труда уровень надлежащей биобезопасности, придерживаться инструкции по технике безопасности для работы с потенциально инфекционными агентами и принять необходимые меры предосторожности.
  7. Подготовьте носитель инфекции путем смешивания человека10-содержащих клеточной культуры супернатанта, который был подготовлен в HEK293 клетках как описано до15, с среднего обслуживания CMs (см. шаг 1.3) в соотношении 1:1.
  8. Добавьте hexadimethrine бромида в конечной концентрации 8 мкг/мл для повышения эффективности инфекции.
    Примечание: Из-за высокой инфекции эффективность iPSC-CMs до концентрации человека через ultracentrifugation обычно не является необходимым.
  9. Аспирационная среднего обслуживания см от одного iPSC-CMs и заменить его с инфекции среднего, подготовленные в ходе шагов 1.7 и 1.8. Культура зараженных один iPSC-CMs в инфекции среднего за 12 ч при 37 ° C. Затем аспирационная среднего и заменить его снова среднего обслуживания см.
    Примечание: Флуоресценции сигнала от GEVI появляется 48 часов после заражения. Визуализация мембраны потенциальных записей рекомендуется, 72 ч после инфекции в ближайшее время, для обеспечения надлежащего сигнала. Один зараженный iPSC-CMs может быть культивировали в течение 3 недель и образы последовательно. Если обширные Фотообесцвечивание происходит во время сеанса работы с образами, сигнал флуоресценции восстанавливает со временем.
  10. До обработки изображений, Обмен клетки культуры среднего Tyrode в раствор с Ca2 + (135 мм NaCl, 5,4 мм KCl, MgCl 1 мм2, глюкоза 10 мм, 1.8 мм CaCl2и 10 мм HEPES; рН 7,35).

2. оптические мембраны потенциальных записей

  1. Место тепловизионные камеры, содержащие iPSC-CMs на сцене Перевернутый эпифлуоресцентного микроскопа с изображения разделителя, устанавливает соответствующий фильтр и камеры (например, sCMOS камера), способной высокоскоростной обработки изображений на высоком чувствительность.
    Примечание: например, использование фильтрации 480/40 Нм полосовые возбуждения в сочетании с 500 Нм Лонг перевал дихроичное зеркало в Микроскоп, а 568 Нм Лонг перевал дихроичное зеркало в сочетании с 520/28 нм и 630/75 Нм полосовые фильтры выбросов в изображение разделителя. Для одной ячейки изображений, цель погружения высокого увеличения, высокой числовая апертура масло обеспечивает лучшее соотношение сигнал шум.
  2. Если требуется электрической стимуляции, установите электроды стимуляции в тепловизионной камеры и подключите их к генератору стимул.
    Примечание: Мы использовали ходить врезные, двумя платиновыми электродами и установлены в 3,5 см стекло дно клетки культуры блюда. Клетки, расположенные между электродами были образы. Типичные параметры стимуляции являются Прямоугольные импульсы 5 мс в срок, с амплитудой 10 расстояние между электродами V/см.
  3. При необходимости используйте подогревом микроскопа для обеспечения стабильной температуры iPSC-CMs во время визуализации, или даже настройки камеры микроскопа инкубации, если долгосрочное изображений предназначен.
  4. Обратить внимание клетки и место клетки, выражая GEVI в центре поля просмотра.
    Примечание: Наиболее удобно это делается с помощью окуляры микроскопа с помощью зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) или набор фильтров флуоресцентный белок (RFP) для выявления клеток, выражая GEVI красный.
  5. Установите оптический путь так что испускаемого света направляется изображение разделителя. Переключить фильтр куб в Микроскоп к тому, чтобы сочетаться с фильтрами изображения разделителя (см. Таблицу материалы).
  6. В программном обеспечении управления камерой установите параметры приобретения так что высокоскоростной обработки изображений (например, 100 кадров в секунду, с выдержка 10 мс в кадре) Возможен экспорт.
    Примечание: Как правило, это предполагает биннинга Камера пикселей (например, 8 x 8 пикселей камеры чип являются сегментирования генерировать один пиксел в промежуток времени фильма).
  7. Настройте образ сплиттер согласно инструкции производителя. Два изображения, представляющие две полосы волны различных выбросов должно быть рядом друг с другом, каждый занимает одну половину изображения.
    Примечание: Этот шаг должен быть выполнены только 1 x в начале каждой сессии изображений.
  8. Проверить и, при необходимости, Отрегулируйте фокус изображения, производимые камеры.
  9. Отрегулируйте яркость освещения, чтобы избежать любой насыщенности пикселей; Это легче всего сделать с помощью цветовой палитры, в котором представлены насыщенных пикселей уникальный цвет.
    Примечание: Во всех этих препаратов до изображений, ограничить воздействие образца к возбуждению света до необходимой суммы (т.е., не оставляйте свет на для продолжительных периодов времени) чтобы избежать Фотообесцвечивание GEVI.
  10. Настройка на приобретение временных рядов (например, 5000 изображения 100 кадров в секунду для серии продолжительностью 50 s). Тусклый свет в комнате, (включая компьютерных мониторов) чтобы избежать рассеянный свет, влияния на измерение. Если свет затвора возбуждения не контролируется изображений программное обеспечение, открывайте его непосредственно перед запуском приобретения.
  11. Начните приобретение серии изображений. По желанию электрической стимуляции, начните ходить последовательность в соответствующее время точке, если он автоматически инициируется изображений программное обеспечение. Если требуется применение фармакологических агента, сделать это либо вручную (например, путем дозирования 100 мкл агента в десять раз конец концентрации к палате записи, содержащие 900 мкл буфера и осторожно смешивая его с пипеткой) или с помощью Константа потока перфузии системы.
  12. После завершения приобретения, закройте возбуждения света затвора при необходимости. Сохраните запись на жесткий диск.
  13. Оставляя неизменными параметры записи (то есть, время экспозиции, частоту и интенсивность света), выполнить запись флуоресценции фон (как в шаге 2.11) поверх региона coverslip, не содержащие клетки или другой coverslip, на котором не клетки были посеяны.
    Примечание: Если последовательные измерения выполняются без изменения параметров приобретение, только один фон флуоресценции запись необходима для всех этих измерений.
  14. При необходимости, выполните дополнительные эксперименты (шаги 2.4-2.13) на различных iPSC-CMs, расположенный на том же coverslip. Имейте в виду, что все CMs на coverslip будут затронуты в случае, если препарат был применен.

3. анализ

> Примечание: В зависимости от обработки изображений программное обеспечение используется (который обычно проприетарное программное обеспечение пакет, предоставляемый производителя камеры или весь флюоресценция системы), можно выполнить анализ полученных изображений частично или даже полностью в пределах этого программного пакета. Однако, здесь рабочего процесса анализа изображений, которые могут быть выполнены с открытым исходным кодом (то есть, изображение анализ платформы ImageJ)16, который может устанавливаться удобно с помощью распространения таких Фиджи17и пакет R для описаны статистические вычисления18 . Вкратце регионы интереса (ROI), представляющие клетки или фона отображаются в ImageJ, и среднее флуоресценции в этих ROIs со временем экспортируется в файл затем, далее анализироваться в R или, альтернативно, с электронной таблицы программным обеспечением.

  1. В программе обработки изображений сохранить или экспортировать полученное изображение временных рядов (записи, содержащие клетки и соответствующие записи фон) в формат (например, TIF), который может быть прочитан ImageJ. Кроме того используйте плагин BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), который предусматривает процедуры, позволяя ImageJ читать несвободных форматов из различных марок производителей тепловизионные системы.
    Примечание: Следующие шаги предполагают изображений интервалы же во время записи. Если это не так, это может быть необходимо экспортировать сведения о времени из изображений программное обеспечение и включить его в дальнейшем анализе.
  2. Откройте стек TIF, содержащий ячейки в ImageJ.
  3. Используйте инструмент Выделение произвольной рисовать ROI над флуоресцентные cardiomyocyte красного канала. Убедитесь, что ROI достаточно большой, так что клетки не выбраться ROI во время Договаривающимися.
  4. Откройте менеджер плагин ROI ('анализ | Инструменты | ROI менеджер ') и нажмите на кнопку «Добавить [t]» добавить этот ROI как ROI1.
  5. Перетащите ROI за ту же ячейку в зелёном канале и добавьте этот ROI как ROI2.
  6. В ' анализ | Набор измерений меню, снимите все варианты, за исключением «Означает значение серого».
    Примечание: Это должно быть сделано только 1 x в сеансе ImageJ.
  7. В менеджере ROI, нажмите ' более | Multi мера ' кнопку. Выберите параметры «Измерить все срезы» и «Одну строку для каждого фрагмента» и нажмите «OK». Откроется окно, содержащее таблицу с тремя строками (номер слайса и среднее флуоресценции в двух трансформирования, представляющий ячейку в красный и зеленый канал, соответственно).
  8. Использование ' файл | Сохранить-как для сохранения таблицы в файл с разделителями-запятыми (CSV).
  9. Закройте окна с стека изображений и таблиц без закрытия окна диспетчера ROI. Откройте стек TIF, содержащий измерения фон.
  10. В менеджере ROI, нажмите ' более | Multi мера' кнопку. Выберите параметры «Измерить все срезы» и «Одну строку для каждого фрагмента» и нажмите «OK».
  11. Использование ' файл | Сохранить-как сохранить электронную таблицу с данными фон в другой файл CSV.
    Примечание: Следующие вычисления можно сделать с электронной таблицы программным обеспечением. Мы использовали программного обеспечения R18. Простой пример сценария, который считывает данные ячейки и фона из файлов «cell.csv» и «background.csv» выполняет вычисления и участков время курс мембранный потенциал сигнала предоставляется в качестве дополнительного кода файл 1.
  12. От фоновой записи, расчет средней интенсивности в красный и зеленый канал. Вычитание этого фонового сигнала от сигналов, представляющий ячейку в красный и зеленый канал для расчета ЗП, скорректированные по фону и GFP сигналов, соответственно.
  13. Как суррогат для мембранного потенциала Рассчитайте коэффициент RFP/GFP.
    Примечание: Этот коэффициент безразмерные. Кроме того это могут быть нормированы его начальное значение (то есть,0ΔR/R). Важно отметить, что полезная информация содержится в временных изменений, а не в абсолютных значениях этого соотношения. Из-за неравномерного Фотообесцвечивание GFP и ППП может возникнуть базовых дрейф в этом соотношении. При необходимости, такие базовые дрейф могут быть исправлены путем создания базовой кривой и вычитания его из ППП/GFP соотношение10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В рисунке 4aпредставитель одного iPSC-CM изображен с белыми пунктирными линиями, маркировка ROI, обращается в ходе анализа изображений в ППП (слева) и канал GFP (справа). Сигнал от канала ППП показывает периодический рост в интенсивности флуоресценции во время потенциал каждого действия (рис. 4б, верхняя группа). Как описано во введении, это объясняется растущей ладу, вызванных изменениями в мембранного потенциала (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, описанный здесь позволяет оптической записи APs от конкретного подтипом (например, желудочков подобных клеток) CMs, созданный из человека iPSCs. Человека iPSC-CMs являются новым инструментом решать огромное разнообразие биологических и медицинских проблем, и дифференциации в различные подтипы см является важным источником экспериментальной изменчивости. С помощью элементов конкретной промоутера, выражение GEVI специально достигается в CMs, представляющее подтип интересов, которые затем оптически отражаютс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантов от немецкого фонда научных исследований (Si 1747/1-1), остальное Kröner-Fresenius-Stiftung и Deutsche Stiftung für Herzforschung.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ß-МеркаптоэтанолInvitrogen21985023
DMEM-F12 MediumInvitrogen21331046
FBS (фетальная бычья сыворотка)Invitrogen16141079
MEM Заменимые аминокислотыInvitrogen11140050
добавка GlutaMax-IInvitrogen35050061альтернативный L-глутамин
Пенициллин-стрептомицинИнвитроген15140122
фибронектин бычьей плазмыSigma-AldrichF1141 
Коллагеназа типа IIWorthington BiochemLS004174
гексадиметрина бромид (полибрен)Sigma-AldrichH9268усиливающая лентивирусную инфекцию
3,5 см стеклянное дно микрочашкиMatTek corporation, Ashland, MA, СШАP35G-1.5-14-C
Стенд для микроскопаLeica Microsystems, Вецлар, ГерманияDMI6000B
Объектив для микроскопаLeica Microsystems, Вецлар, ГерманияHCX PL APO 63X/1.4-0.6 Масляная
sCMOS камераAndor Technology, Белфаст, ВеликобританияZyla V
: фильтр возбужденияChroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, СШАET480/40Xполоса пропускания 480/40
Фильтр для микроскопа: дихроичное зеркалоChroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, СШАT505lpxrдлиннопроходный 505 нм
Разветвитель изображения  Cairn Research, Faversham, UKOptoSplit II
Фильтр-куб с разделителем изображения: дихроичное зеркалоAHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Германия568LPXRlongpass 568 нм
Фильтр-разделитель изображения куб: фильтр излучения 1 (излучение GFP)AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Германия520/28 BrightLine HCполоса пропускания 520/28 нм
Фильтр-разделитель изображения куб: фильтр излучения 2 (излучение RFP)AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Германия630/75 ET Полоса пропускания630/75 нм
Вставка с электростимуляциейWarner Instruments, Хамден, Коннектикут, СШАRC-37FS
Фильтрующий куб для микроскопа

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
  2. Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).
  3. Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
  4. Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
  5. Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
  6. Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
  7. Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
  8. Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).
  9. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  10. Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
  11. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  12. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  13. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
  19. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
  20. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464(2017).
  21. Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
  22. Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ventricular CardiomyocytesOptical Action PotentialGenetically Encoded Voltage IndicatorLentiviral TransductionVentricular Specific PromoterTime lapse Fluorescence MicroscopyImage SplitterRegion Of Interest AnalysisAction Potential DurationElectrical Pacing Stimulation

Похожие статьи