Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Белок белковых взаимодействий, я n пробирки

Традиционно технологии выбран точно описать трехмерную архитектуру белков и вывести их функции являются Кристаллография и экспериментов ядерного магнитного резонанса, в сочетании с крио электронной микроскопии (cryoEM) тщательное изучение их структурные детали высокого разрешения. Белки, однако, не являются статичными структурами и можно пройти разнообразные конформационные изменения и вибрации во времени и пространстве. Вот почему структурной информации из кристаллографических или CryoEM данных необходимо дополнить другими методами (например, в моделях молекулярной динамики и одной молекулы методы): функцию белка связано с его конформационную изменения и взаимодействия и эта информация отсутствует в статической структуры. Для того чтобы зондировать для внутри молекулярной динамики, методы, основанные на одной молекулы Форстер резонанса (smFRET) передачи энергии являются очень эффективным¹. Эти подходы имеют возможность оценить различные субпопуляции молекул в сложных средах. Это очень важно, как эти изменения быстро и во время приобретения данных (то есть, наносекундных второй диапазон).

Для выявления и количественной оценки этих изменений часто используются два основных подхода: белки в растворе и поверхности иммобилизации. Для обнаружения между молекулярных взаимодействий и, в частности, процесс димеризации индуцированных лигандов, smFRET не всегда является лучшим инструментом. Действительно ладу зависит не только от расстояния (≈10 Нм), но также на ориентацию двух диполей (доноров и акцепторов, χ²) и перекрытие доноров выбросов с акцептором спектров поглощения², но возможно это Последнее условие меньше важные при том условии, что экспериментатор может выбрал правильный пара ладу. Особый недостаток smFRET для зондирования гомо димеризации приходит от маркировки протеина интереса: Гетеро smFRET, димеризации может только быть обнаружены до 50% (т.е., гетеро Лада будет только в состоянии обнаружить донорно акцепторной и Акцептор доноров гомо димеров но не доноров донора или акцептор акцептор, который другие 50% димеров). Использование корреляции отдела Флуоресценция (FCS) и производных (FCCS,³ и т.д.) для определения белка диффузии константы и привязки константы в пробирке является еще одной альтернативой. Эти подходы не способны полностью количественно гомо димеризации либо, как и коэффициент концентрации и диффузии и радиуса распространения FCS один меры диффундирующих частиц очень слабо зависит от молекулярной массы; к примеру десятикратного увеличения в молекулярном весе только будет означать 2,15 раза изменения коэффициента диффузии⁴. В случае FCS-двухцветный или FCCS только 50% гомо димеры будет рассматриваться по той же причине, как выше. Наиболее практичных и количественного подходов к обнаружить гомо димеризации в пробирке и в естественных условиях являются гомо Лада⁵ и номер и яркость (N & B)⁶. Учитывая тот факт, что гомо лада требует восстановления конкретных приборов значения анизотропии (т.е., оптические элементы/анализаторы для восстановления параллельные и перпендикулярные поляризации), N & B представлен здесь как благоприятный метод Обнаружение белка гомо димеризации и агрегации. Это может быть заняты как in vitro , так и в естественных условиях с коммерческой структуры.

Количество и яркость

N & B был недавно рассмотрели⁷. Этот обзор был сосредоточен на применение техники в живых клеток. Это целесообразно воспроизвести математического формализма здесь как эти уравнения будут применяться к данным, собранных в пробирке. Во-первых это необходимо для определения некоторых терминов и математических величин:

• Сущность — это набор молекул, которые связаны друг с другом.
• Яркость ε сущности — это количество фотонов, он испускает за единицу времени (в кадре).
• n — это количество сущностей, настоящее.
• Для данного пикселя в течение серии изображений < i > является его средней интенсивности и σ² вариативность его интенсивности.

Затем с Фотон подсчет детекторы и предполагая мобильных подразделений и без фона

где N — это явное число и B является явно яркость. Это приводит к

Далаль и др. ⁸ показал, что с аналогового оборудования, один нуждается три коррекции терминов: S фактор, фон смещениеи шум считывания σ₀². Затем опять же при условии мобильных подразделений,

давая

Обратите внимание, что выше уравнение отличается в Далаль и др. ⁸ и последующий обзор. ⁷ в Далал et al. S в знаменателе был опущен из-за опечатки, и эта ошибка была воспроизведена в обзоре. Уравнение выше является правильным. Инструкции для измерения S, смещение и σ₀² - вместе с объяснением их смысл - выдаются Далаль и др. ⁸

Ε яркость пропорционален олигомерных состояние диффундирующих образований: ε будет дважды как большой для димеры, как это для мономеров, три раза большим, для тримеры, как это для мономеров, дважды как большой для hexamers, как это для тримеры и так далее. Таким образом, измерения яркости ε один можно количественно определить любой тип multimerization.

Если есть смесь олигомерных государств настоящее время, и яркость не способна восстановление отдельных олигомерных присутствующих государств. Это ограничение техники.

Бестрендовости алгоритма и nandb программного обеспечения

Исправление для Фотообесцвечивание был ранее важность⁹. Фотообесцвечивание неизбежно происходит во время экспериментов световой микроскопии в режиме покадровой; Оба в живых клеток и в пробирке. Многие подходы были описаны в литературе исправить для отбеливания⁷. Текущий лучше всего метод экспоненциального фильтрации с автоматического выбора detrending параметра T . Она интегрирована в свободный, Открытый источник программного обеспечения nandb⁹. Действительно программное обеспечение, которое требует от пользователя вручную выбирать их detrending параметр может привести к неверным результатам потому, что этот параметр выбор, вероятно, будет произвольным и неправильным. Автоматический алгоритм проверяет данные и определяет соответствующие параметры для его, без необходимости вмешательства пользователя⁹. Даже с самым лучшим выбором параметра сглаживания detrending имеет свои ограничения и работает только с Фотообесцвечивание проценты ниже 25%, как показано с моделирования⁹. Интересно, что при использовании автоматического detrending рутины, ее точность такова, что можно работать с низкой яркости значения (даже B < 1.01) и следовательно низкой интенсивности и все еще быть достаточно точным, чтобы количественно гомо димеризации.

Фотообесцвечивание также вызывает другая проблема: присутствие флуорофоров photobleached в multimer комплексе. Это делает, например, тример появляются как димер, когда один из этих трех подразделений в тример не люминесцентные. Гур и Мюллер¹⁰ показали, как исправить это, и это исправление было также подчеркнуто в последующий обзор⁷. Nandb программное обеспечение включает в себя этой коррекции⁹.

FKBP12 F36V системы

FKBP12F36V — это белок, который естественно не oligomerize, но как известно, dimerize после добавления AP20187 наркотиков (известный как разговорно BB, dimerizing лигандом)^11,12. Это делает его идеальным тестовый случай для числа и яркость: с маркировкой FKBP12F36V, удвоение олигомерных государства должен соблюдаться при добавлении BB.

1. FKBP12 F36V - mVenus очистки

1. Преобразование (DE3) pLysS клетки с pET22b вектор, содержащий monomerized человека FKBP12F36V¹² и His6 и mVenus Теги N-терминальный (вектор по запросу). Плита клетки на LB агар, дополненная 50 мкг/мл Ампициллин и 34 мкг/мл хлорамфеникола.
2. Передача преобразованных колоний в 100 мл фунта закваски и расти на 16-20 часов при 37 ° C при встряхивании.
3. Разбавить густой закваски (OD600 > 1) 1: 100 в среде фунтов (2 x 500 мл пакетов) и расти на 2-3 часа до OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 об/мин).
4. Прохладный культур на льду. Побудить с 250 мкм IPTG и расти на 16-20 часов при температуре 21 ° C, 200 об/мин.
5. Урожай клетки центрифугированием в 2000 x g за 20 минут.
6. Ресуспензируйте Пелле в 40 мл буфера IMAC (20 мм натрия фосфат pH 7.5, 500 мм NaCl, 3 мм имидазола, 1 мм β-меркаптоэтанол) дополнены с ЭДТА бесплатно ингибиторы протеазы (1 таблетка на Пелле клеток).
7. Sonicate клетки (500 Вт, 20 кГц, амплитуда 40%, 9 s на 11 s от 15 мин) на льду и урожай растворимых материал центрифугированием на 20000 x g.
8. Передача растворимых lysate в коническую колбу и добавить 2 мл смолы (см. Таблицу материалы). Инкубировать 1 час с вращением 105 об/мин
   Примечание: Никель sepharose также может использоваться для этого шага IMAC.
9. Урожай смолы и мыть с 250 мл IMAC буфера A следуют 500 мл IMAC буфера B (20 мм натрия фосфат pH 7.5, 500 мм NaCl, 7 мм имидазола, β-меркаптоэтанол 1 мм).
   Примечание: Увеличение до 50 мм имидазола если используется никель sepharose смолы.
10. Элюировать His6-тегами протеина используя IMAC буфера C (20 мм натрия фосфат рН 7,5, 500 мм NaCl, 300 мм имидазола, β-меркаптоэтанол 1 мм).
11. Внедрить на размер исключение столбцов (см. Таблицу материалы) достижение равновесного уровня в 10 мм HEPES pH 7.5, 150 мм NaCl, 1 DTT. FKBP12F36V имеет свой пик элюции в 87.71 мл на столбце, который мы использовали.
12. Оценка чистоты через SDS-PAGE и бассейн и сосредоточиться при необходимости.

2. подготовка массива Multiwell пластины

1. Оттепель очищенный FKBP12F36V (или помечены протеин интереса) от-80 ° C.
2. Приготовляют раствор 100 Нм очищенный FKBP12F36V (средний, 10 мм HEPES pH 7.5, 150 мм NaCl, 1 DTT). Sonicate и центрифуги (быстрый спин 13000 об/мин) для предотвращения образования агрегатов.
3. Пипетка 100-200 мкл в камеру 8 хорошо наблюдения с низа стекла.
4. Добавьте BB dimerizer окончательного концентрации 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 и 500 Нм^12,13.
5. Как ссылка, приготовляют раствор 100 Нм mVenus только, чтобы оценить потенциальные последствия агрегации и осадков и восстановить значение яркости на мономера с теми же настройками приобретения.

3. бесплатная калибровка конфокальный приобретение

1. Начало конфокальный системы (рис. 1). Свет сканирование системы Конфокальный микроскоп оснащен цифровой детекторы или хорошо изученных аналоговые датчики⁸, и способны поддержания постоянной продолжительность для каждого пикселя, приобрел будет работать.
2. Задайте путь луча возбуждения:
   1. Включите 514 Нм лазер и набор его на 20-100 nW мощность на выходе цели (для FKBP12F36V-mVenus).
   2. Выберите цель 63X1.4NA или воротник коррекции цель погружения воды предназначены для FCS.
   3. Включите один Илья, APD или калиброванные ПЛТ детектор. Детекторы, способные Фотон подсчет предпочтительным, как в этом случае, расчета S, смещение и σ₀² являются ненужными.
   4. Выберите окно выбросов от 520-560 Нм
   5. Установите обскуры 1 воздушные подразделения для соответствующих выбросов ~ 545 Нм.
   6. Установите режим приобретения на 16 x 16 пикселов
   7. Задайте tвремя dwell пикселей,_жить таким образом, что он удовлетворяет t_кадра >> T_D >> t_жить, где _D — время пребывания диффундирующих белка и t _рамка является частота кадров. Это соответствует параметру Продолжительность ~ 13 МКС.
      Примечание: Некоторые коммерческие производители имели сканеров, которые не держали время задержки на пиксель постоянно. Это постоянство имеет решающее значение для работы метода.
   8. Задать размер пикселя в ~ 120 Нм.
   9. Выберите режим приобретения xyt и выберите количество кадров, чтобы быть приобретены за приобретение и хорошо (например, 5000).
   10. Если система оборудована с высокой пропускной способностью режим, ввести координаты каждой скважины и количество приобретений за скважины для автоматизации процесса.
       Примечание: Будьте внимательны для обеспечения присутствия воды Диспенсер для, если с помощью объективного погружения.
   11. Если система оснащена перфузии системы, загрузите решение BB и программа перфузии чтобы начать право после 5000^й кадр оценить кинетику димеризации приобретая например, 10 000 изображений.
3. Добавить каплю масла в цель погружения нефти / воды если используя воротник коррекции цель погружения воды предназначены для FCS.
4. Смонтируйте 8 хорошо наблюдения камеры в сцене.
5. Выберите правильный колодец и сосредоточиться на решении.
   Примечание: Важно: избежать акцентирования внимания близко к нижней стекла, чтобы избежать отражения и рассеивания. При фокусировке глубже в раствор, отключите параметр автоматической фокус.
6. Начать приобретение и сохранить полученный стек изображений в формате TIFF.

4. Бестрендовости и яркость анализа с использованием пакета R nandb

1. Для предварительной проверки качества используйте ImageJ¹⁴ взглянуть на изображения и восстановить интенсивность профиля, как показано на рисунке 2. Это полезно для определения, произошло ли или не слишком много Фотообесцвечивание. Если есть слишком много отбеливания, данных не подходит для дальнейшего анализа.
   Примечание: ImageJ также может быть полезным для преобразования изображений TIFF из коммерческих форматов. Nandb программное обеспечение, описанное ниже может работать только с файлами TIFF.
2. Скачать и установить R и RStudio^15,16. Это лучше загрузить и установить R, а затем RStudio.
   Примечание: Ниже приводится описание того, как использовать пакет nandb Р. Знание языка R не требуется для использования nandb, но это будет сделать жизнь проще.
3. Установите пакет nandb.
   1. Открыть RStudio и в консоли, введите install.packages("nandb") и дождитесь завершения установки.
4. Узнать nandb
   1. Просмотрите руководство¹⁷.
   2. Обзор встроенного RStudio помощь для различных функций. Наиболее вероятным функция использоваться будет использование будет brightness(). Просмотр файла справки для этой функции, введя? Brightness() на консоли.
5. Вычислить яркость
   1. Говорят, что один имеет файл изображения на рабочем столе под названием img001.tif (Обратите внимание, что «nandb» работает только с файлами TIFF). Яркость изображения можно вычислить:
      b <-яркость («~/Desktop/img001.tif», Тау = "auto")
      1. Яркость изображения это присваивает переменной b в р. Тау = «auto» гарантирует, что изображение является правильно бестрендового до вычисления яркость. Наиболее распространенные вещи делать здесь является для вычисления среднего значения или средней яркости изображения. Одно может сделать это, набрав mean(b) или median(b). Можно также написать яркость изображения с рабочего стола с помощью
         ijtiff::write_tif (b, «~/Desktop/whatever_img_name»)
   2. Говорят, один имеет полный images_folder изображений на рабочем столе папку и необходимо вычислить яркостей эти изображения и писать яркость изображения как TIFF-файлы. Затем посмотреть? brightness_folder(). Эта функция обрабатывает всю папку все сразу:
      brightness_folder («~/Desktop/images_folder», Тау = "auto")
      Это особенно хорошо для тех, которые имеют программное обеспечение, которое они предпочитают R, потому что все файлы обрабатываются в одной командой, и затем один можно продолжать работать с изображениями TIFF яркость вывода в их выбранного программного обеспечения, будь то ImageJ¹⁴ , Python или что-то другое.

Detrending и мономерных яркость

После того, как данные были приобретены, можно начать яркость расчеты для определения олигомерных состояние протеина интереса в решении. Даже если эффект отбеливания в растворе не может быть как резкое как это может быть в естественных условиях, интенсивности трассировки будет по-прежнему вероятно не имеют стационарные означает, возможно из-за изучены фотофизические эффекты, связанные с Флюорофор,18 , но причины этого полностью не поняты. Это сказывается при расчете яркость; При попытке определить переходы мономера димера, этот аспект имеет решающее значение. Применяя автоматическое Бестрендовости алгоритм данные, показанные на рисунке 2, след интенсивности должным образом исправить, обеспечивая более точное значение для яркости FKBP12F36V-mVenus в растворе. Перед добавлением BB, без detrending, B = 1,026, тогда как после detrending, B = 1,005 (рис. 2b).

Определение FKBP12 F36V -mVenus мономера димера переходы в пробирке

Последовательности 20 000 изображений очищенный FKBP12F36V - mVenus в 100 Нм решения были приобретены как указано в разделе протокол. После того, как были приобретены 10000 кадров, homodimerizer наркотиками BB был добавлен в решение во время приобретения. Был проанализирован каждый подряд серии 5000 кадров (рис. 3). Средняя яркость 5 минут после добавления BB B = 1.010, который два раза возрастает, указывающее FKBP12F36V димер. Кинетика процесса показан на рисунке 3b; задержка между BB дополнение к полной FKBP12F36V димеризации был около 2 минут.

Определение белка агрегатов

Количество белка агрегатов были обнаружены как в ограниченное количество кадров, а также в интенсивности трассировки (рис. 4). Эти агрегаты происходят естественно в растворе при работе с белками и могут быть устранены путем sonicating и/или увеличения разрежения белка. Тем не менее в некоторых биологических проблем, необходимо определить переходы между мономерами и большой агрегатов. На рисунке 4 показан пример, где FKBP12F36V белок совокупных рассеянный через объем наблюдения (изображения 16 x 16); для наших предыдущих вычислений, которые эти данные были удалены однако, один из примеров показан на рисунке 4 чтобы показать, что эти агрегаты могут быть обнаружены и охарактеризовать, используя одинаковые настройки и подход. На первый взгляд, при оценке 5000 изображений, один можно восстановить средняя яркость для FKBP12F36V-mVenus лечение с BB (B = 1.010). Просмотра необработанных яркость изображения, можно четко видеть, хотя, региона интерес приблизительно 8 пикселей с высоким значением B ≈ 1.080. Этот регион интереса совпадает с несколько кадров при t = 34-37 s, где FKBP12F36V агрегат рассеянный вокруг области наблюдения. Агрегат не осталось объема наблюдения долго достаточно, чтобы точно определить ее размер.

Рисунок 1 . Приложение N & B, чтобы обнаружить белка мономера димера переходы в растворе. () упрощенный оптического пути лазерный сканирующий микроскоп (МИС) оснащен лазерным источником (на 514 Нм в случае mVenus помечены белков) направлены на объективное погружения (в нашем случае это 63X1.4NA масло) (синие стрелки) осветительные решения 100 Нм FKBP12F36V-mVenus раствор. Флуоресценции выбросов (зеленые стрелки) проходит через дихроичное зеркало и направлено на полосовой фильтр, который очищает выбросов свет, и отверстие энергоблока 1 Эйри, расположенный прямо перед точка цифровой детектор способен Фотон подсчета. (b) конфокальный объем освещения сканируется через 16 x 16 пикселей светящиеся одной молекулы FKBP12F36V-mVenus, которые войти и выйти из гауссова форма конфокальный объем производства массив колебаний интенсивности флуоресценции. (c) изображения серии приобрели со временем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 . Автоматическое detrending необходима для точного измерения население мономеров в растворе. (a) стек 5000 размером 16 x 16 пикселей изображения была приобретена как описано в разделе протокол. Интенсивность первого кадра показан вместе с среднее время решена интенсивности профиль, который показывает долго термин колебания, которые могут быть связаны с отбеливающим и других растворителей и/или photophysic эффекты. Независимо от причины для этих долгосрочных колебаний, они влияют вычисления яркость и поэтому требуют detrending. Без автоматического Бестрендовости, один получает B = 1,026, тогда как после автоматического detrending, B = 1.005. Кроме того, яркость без (ряду второй слева панели,) и с (правой панели, второй ряд) гладкой фильтрация показано. (b) и те же данные представлены в () был бестрендового и результаты с точки зрения интенсивности и яркость показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . In vitro N & B может разрешить переход между FKBP12F36V мономеров и димеров в режиме реального времени. Добавлением препарата dimerizer BB привело к увеличению на два раза в истинной яркости сразу после 2 мин (от 0,005 до 0,010 истинный молекулярных яркости). () интенсивность первого кадра показан вместе с средней интенсивности профиль бестрендового изображения. Яркость без (ряду второй слева панели,) и с (правой панели, второй ряд) гладкой фильтрация показано. (b) означает яркости строится (каждые 5000 фоторамки) с использованием ε истинный молекулярной яркость. Димеризация происходит 2 минут после добавления BB (t = 1 мин) при t = 4 мин. Гладкой кривой функция сигмоид подчеркнуть тенденцию димеризации после добавления препарата dimerizer (BB). Планки погрешностей представляют стандартная ошибка распределения яркости в каждый момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 . В пробирке N & B для разрешения размер протеина агрегатов в растворе. (a) время решена интенсивности бестрендового трассировки для приобретения FKBP12F36V-mVenus отображаются вместе с яркость изображения (вторая строка). (b) время решена бестрендового интенсивности трассировки показывает максимум интенсивности, которая выделена с красным пунктирным кругом (верхняя левая панель). Первый кадр интенсивности, которая соответствует этот конкретный момент времени (t = 34 секунды) показано и красная стрелка показывает FKBP12F36V-mVenus агрегат, зону освещения. Более пристальный взгляд на изображение сглаженного яркости показывает региона интерес, содержащий высокий олигомерных государств и остальная часть изображения содержит смесь мономеров и димеры с в среднем B = 1,008. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.