Методы для оценки роли c-Fos и Dusp1 в зависимости от онкогена

Краткое содержание

Здесь мы описываем протоколы для проверки генетические и химические c-Fos и Dusp1 как цель наркотиков в лейкоз, с использованием модели в vitro и in vivo генетических и гуманизированные мыши. Этот метод может применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.

Аннотация

Демонстрация ингибитора киназы тирозина (TKIs) в лечении хронический миелолейкоз (CML) ознаменовало новую эру в терапии рака. Однако имеется небольшая популяция клеток не реагировать тки лечения, что приводит к минимальной остаточной болезни (моб); даже наиболее мощным TKIs не в состоянии искоренить эти клетки. Эти клетки MRD служат водохранилище развивается устойчивость к терапии. Не известно, почему тки лечения неэффективны против MRD клетки. Фактор роста сигнализации подразумевается в поддержке выживания MRD клеток во время лечения тки, но хватает механистического понимания. Недавние исследования показали, что повышенные c-Fos и выражение Dusp1 результате конвергентной онкогенных и фактор роста сигнализации в клетках MRD посредником тки сопротивления. Генетические и химическое ингибирование c-Fos и Dusp1 оказывает CML изысканно чувствительна к TKIs и лечит ХМЛ в обеих моделях генетических и гуманизированные мыши. Мы определили эти целевых генов, используя несколько microarrays тки чувствительных и - устойчивостью клеток. Здесь мы предлагаем методы для целевой проверки с использованием моделей мышей в vitro и in vivo. Эти методы могут легко применяться к любой цели генетической проверки и терапевтические развития.

Введение

Учредительный тирозин киназы активность онкогена сплавливания BCR-ABL1 вызывает CML, который обеспечивает логическое обоснование для целевым активность протеинкиназы ингибиторов малые молекулы. Успех TKIs в лечении больных ХМЛ революцию в концепции таргетная терапия^1,2. Впоследствии, анти киназы терапии как точность медицины был разработан для нескольких других злокачественных опухолей, включая солидных опухолей. Пока более тридцати ингибитора киназы были одобрены Объединенной государства FDA для лечения различных злокачественных опухолей. Хотя тки лечение очень эффективен в подавлении заболевание, это не лечебной. Кроме того, имеется небольшая популяция клеток рака сохраняется во время лечения: MRD^3,4,5. Даже пациенты, которые показали полной ремиссии остались с моб, который в конечном итоге результаты в рецидив, если не постоянно подавляются. Таким образом ликвидация MRD клеток необходима для достижения прочного или лечебных ответ. CML представляет собой ценный парадигмы для определения понятие точности медицины, механизмы онкогенеза, рациональные направлена целевой терапии, прогрессирования заболевания и лекарственной устойчивости. Тем не менее даже сегодня, механизм вождения тки индуцированной клеточной гибели раковых клеток не поняты, ни почему MRD клетки (состоящий из лейкозных стволовых клеток [LSCs]) внутренне устойчивы к TKIs^4,6. Тем не менее феномен «онкогена зависимости «мутант киназы онкопротеин причастны тки эффективность, где острые ингибирование целевых онкогена, TKIs вызывает онкогенных шок, который приводит к массовым проапоптотических ответ или покоя в ячейке контекстно зависимые образом^6,,78,9. Однако хватает механистический основу онкогена зависимость. Недавние исследования замешаны что фактор роста сигнализации аннулирует онкогена зависимость и следовательно наделяет сопротивление ТКИ терапии^10,,1112. Поэтому чтобы разобраться в механизме онкогена зависимости, мы провели всего генома выражение профилирования от BCR-ABL1 зависимым и nonaddicted клетки (выращенных с факторами роста), которые показали, что c-Fos и Dusp1 являются критическим медиаторов онкогена наркомании¹³. Генетических исключение c-Fos и Dusp1 является синтетический смертельны для выражения BCR-ABL1 клетки и мышей, используемые в эксперименте не развиваться лейкемия. Кроме того ингибирование c-Fos и DUSP1 в малых молекул ингибиторов вылечить BCR-ABL1-индуцированной CML мышей. Результаты показывают, что уровни выражения c-Fos и Dusp1 определить порог apoptotic в раковых клетках, таким образом, что более низкие уровни возлагают лекарственной чувствительности при более высоких уровнях вызывают резистентность к терапии¹³.

Чтобы определить гены, вождения онкогена зависимость, мы провели несколько выражение всего генома, профилирование эксперименты в присутствии фактор роста и тки (imatinib) с помощью мыши - и CML пациента производные клетки (K562). Эти данные были проанализированы параллельно с CML пациента наборы данных, полученные из CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток до и после лечения иматиниба. Этот анализ выявил три генов (транскрипционный фактор [c ПКС], двойной специфика фосфатазы 1 [Dusp1] и RNA-связывая протеинов [Zfp36]), часто upregulated в тки устойчивостью клеток. Чтобы проверить значение этих генов в присвоении лекарственной устойчивости, мы осуществили поэтапный анализ in vitro и in vivo . Уровни выражения этих генов были подтверждены ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР) и Западный blotting лекарственно-клетках. Кроме того, гиперэкспрессия cDNA и сногсшибательно, индуцируемый заколки c-ПКС, Dusp1, и Zfp36 показали, что повышенные c-Fos и Dusp1 выражения, достаточно и необходимо придать тки сопротивления. Таким образом мы провели в естественных условиях проверки, с помощью мыши модели только с c-Fos и Dusp1. Для генетической проверки c-Fos и Dusp1 мы создали ROSACreERT индуцибильный c-Fos^fl/fl мышей (условное нокаут)¹⁴ и скрещивали их с Dusp1^{- / -} (прямая нокаут)¹⁵ сделать ROSACreERT2-c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} двойной трансгенных мышей. Клетки костного мозга, полученных c комплект⁺ (от c-Fos^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- и c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) выразил BCR-ABL1 были проанализированы в пробирке в колонии формируя assay блок (CFU) и в VIVO трансплантации костного мозга в смертельно облученного мышей, проверить требования c-Fos и Dusp1 отдельно или вместе в развития лейкоза. Аналогичным образом, химическая запреты c-Fos DFC (difluorinated куркумин)¹⁶ и Dusp1, BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ были протестированы в vitro и in vivo, используя BCR-ABL1-выражая, кость клетки костного мозга, полученных c комплект⁺ от дикого типа мыши (WT). Чтобы подтвердить требование c-Fos и Dusp1 в лейкозных стволовых клеток, мы использовали модель мыши CML, где BCR-ABL1 был специально индуцированных в его стволовых клеток доксициклин (тет transactivator выражает под мышиных стволовых клеток лейкемии (SCL) ген 3' усилитель ^18,регулирование)¹⁹. Мы использовали костного Линь^–c комплект Sca⁺⁺ (ЛСК) клетки от этих мышей в assay в естественных условиях пересадки. Кроме того, мы создали phopsho-p38 уровней и выражение ИЛ-6 как Фармако динамические биомаркеров для Dusp1 и c-Fos ингибирование, соответственно, в естественных условиях. Наконец, расширить сферу охвата исследования человека актуальности, пациент производные CD34⁺ клеток (эквивалент в c комплект⁺ клетки от мышей) были подвергается долгосрочный в пробирке инициирование культуры клеток анализов (LTCIC) и в естественных условиях гуманизированные мыши модель CML^20,21. Иммунодефицитных мышей были пересажены с CML CD34 + клеток, следуют медикаментозное лечение и анализ выживаемости лейкозных клеток человека.

В этом проекте мы разрабатываем методы для идентификации цели и проверки с помощью генетических и химических средств, с использованием различных доклинических моделей. Эти методы могут успешно применяться для проверки других целей разработки химических методов терапевтического развития.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены согласно указаниям институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Цинциннати Детская больница медицинского центра (CCHMC). Человеческих особей (нормальный BM и что от CML (p210-BCR-ABL +) лейкемия) были получены через институциональных Наблюдательный Совет одобрил протоколы (институциональных Наблюдательный Совет: Federalwide гарантия #00002988 Цинциннати Детская больница медицинский центр) и доноров обоснованного согласия от CCHMC и Университета Цинциннати.

1. в режиме реального времени ПЦР анализа

1. Изолируйте всего РНК из клеток BaF3, растущих в RPMI, дополненные 10% FBS и 10% WEHI провел питательной среды как источник интерлейкина-3 (IL-3).
2. Урожай клетки на логарифмической фазы (99% живых) из очищенных (IL-3 и imatinib), а также от необработанных образцов и центрифуги их в 435 x g на 3 мин. Здоровье и этапов роста клеток являются критическими, как их профили выражение гена может резко измениться.
3. Изолируйте РНК путем очистки всего РНК²². Количественную оценку всего РНК; Затем при условии его DNase лечения²³. Преобразовать равное количество свободных ДНК РНК (2 мкг) для cDNA с обратной транскриптазы²⁴.
4. Выполняют ценообразующие с ген специфические праймеры (Таблица 1). Осуществляют ГКДЗ в 20 мкл реакциях в 0,2 мл, тонкостенных труб ПЦР с оптическим шапки, с помощью 1 x полимеразы микс (см. Таблицу материалы), 0,5 мкм каждого праймера, 1 мкл ДНК, и воды. Место реакции в Термоциклер с следующим циклом: шаг 1, 95 ° C в течение 10 минут; Шаг 2, 95 ° C 15 s; Шаг 3 на 60 ° C в течение 1 мин; Шаг 4, повторите шаги 2-3 40 раз. Выполнить все ГКДЗ в triplicates и нормализации данных в реальном времени в β-актина выражение перед печатью.

2. западный Blotting

Примечание: Целом клеточных экстрактов были подготовлены путем добавления 250 мкл 1 x литического буфера, как описано в Kesarwani et al.¹³ дополнить с ингибитором протеазы коктейль и АБС битор фосфатазы коктейль 2.

1. Урожай пять миллионов BaF3 клеток на логарифмической фазы (99% живых) от лечение (IL-3 и imatinib), а также от необработанных BaF3 клетки центрифугированием в 435 x g 3 мин при 4 ° C. Лизировать клетки литического буфера (250 мкл), закупорить вверх и вниз, 1 x, затем 5 минут инкубации на 80 ° C. Sonicate lysate сломать все ДНК с 5 – 6 импульсов 5 s в холодной комнате при 4 ° C.
2. Передача lysate 1,5 мл трубки и центрифуги на 16000 x g 5 мин для удаления любых нерастворимый материал. Экстракт может храниться при температуре-80 ° C до использования. Образцы тепла до 80 ° C за 5 мин в блоке тепла перед загрузкой. Загрузите 10 мкл пример с помощью геля загрузки отзыв на 10% геля SDS-PAGE.
3. Разрешить белков в 150 V до тех пор, пока краска ссылка достигает нижней части геля. Передать белка мембраны нитроцеллюлозы электрофоретической переводом на 1 ампер за 1 час. После передачи, блокировать мембраны в 1 x трис амортизированное saline + 0.1% 20 анимации (TBST) с 5% обезжиренное молоко для 1 h и зонд на ночь при 4 ° C с соответствующим антител при разбавлении 1:1,000.
4. Вымойте мембраны 3 x 5 x 10 минут каждый; с TBST Затем зонд с ПХ конъюгированных соответствующие вторичные антитела (1:5, 000 разрежения) при комнатной температуре за 1 час. Количество используемых TBST зависит от размера контейнера. Убедитесь в том потопить мембрану в TBST полностью. Мыть вторичное антитело 3 x 5 минут с TBST.
5. Разработка пятно с помощью Хемилюминесцентный субстрат реагента. Смесь равных объемов субстрат и буфер из двух бутылок, прямо перед использованием. Добавление подложки в верхней части мембраны для покрытия всего мембраны с 1 мл пипетки и инкубировать в течение 1 мин. Помарки должны отражаться в течение 1-10 мин добавления субстрата.
6. Использование тупой щипцы, тщательно место мембраны на платформе системы (см. Таблицу материалы), избегая много жидкости. Выберите представление живой и выберите помарки и chemiluminiscence из меню. С помощью ручной приобретения, приобрести несколько экспозиций в разное время точках. Эти файлы могут быть визуализированы и количественно с помощью визуализации программного обеспечения.

3. поколение мышей нокаут

1. Крест c-Fos^fl/fl мышей с ROSACreERT2 мышей для создания ROSACreERT2c-Fos^fl/fl мышей¹³. Чтобы создать двойной нокаут (KO) мышах, породы ROSACreERT2c-Fos^fl/fl мышей с Dusp1^{- / -} мышей для создания ROSACreERT2c-Fos^fl/fl для мышей Dusp1^{- / - 13}. Генотип мышей хвост клипы следуют ПЦР, как описано ниже.
2. Генотипирование:
   1. Для подготовки ДНК, клип лишь крошечная часть хвоста с ножницами и положил его в 1,5 мл трубку. Прижигание хвост с подогревом ножницами. Добавить 200 мкл 50 мм NaOH обрезанный хвост в трубе и Инкубируйте на 95 ° C в блоке тепла за 1 час.
   2. Вихревой трубе хорошо и, затем, нейтрализации, добавляя 50 мкл 1 М трис-HCl рН 6,8 и вихрь снова. Центрифуга трубки на максимальной скорости, за 1 мин.
   3. Осуществляют ГКДЗ в реакциях 20 мкл в 0,2 мл, тонкостенные трубы ПЦР с использованием 1 x Taq полимеразы мастер смесь содержащий краситель, 0,5 мкм каждого праймера, 1 мкл ДНК, и воды. Трубы в Термоциклер и запустить соответствующие циклы, как показано в таблице 2.
   4. Запуск продукта ПЦР на 2% агарозном геле и изображения с помощью гель системы документации.

4. изоляция c комплект⁺ клеток из костного мозга

1. Пожертвуйте мышей согласно институциональных руководящих принципов.
   Примечание: Здесь, мышей были подвержены двуокиси углерода (CO₂) в соответствии с AVMA рекомендуется скорость потока до тех пор, пока смерть определяется прекращение дыхания и пульса, а затем шейки матки дислокации.
2. Урожай ногакости от мыши — два бедра, две tibias, два iliacs. Очистите все ткани от костей соскабливания прочь с помощью скальпеля. Положить кости ноги в холодной ПБС на льду — 5 мл в 15 мл. Залить содержимое трубки в ступке и раздавить его с пестиком.
3. Фильтр суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки колпачок с 10 мл пипеткой, в приложении, с помощью пипетки. Вымойте ступку и пестик несколько раз с холодной ПБС, собирая и добавление Тюбик 50 мл суспензии клеток. Спин вниз костного мозга на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант через вакуум с стеклянной пипетки прилагается. Приостановите Пелле клеток в 5 мл с пипеткой ПБС.
4. С пипеткой, медленно добавить приостановлено костного мозга в верхней части 5 мл комнатной температуры (температура критических) polysucrose, принимая большую осторожность, чтобы не нарушить интерфейс. Спина на 400 x g при комнатной температуре в течение 20 мин с тормоз выключен.
5. Собирать облачно всего моно ядерных клеток (TMNC) интерфейс с пипетки и положил его в новой трубки 15 мл. Довести объем до 10 мл с ПБС для мытья, принимая 20 мкл для подсчета и спина на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и сохранить гранул на льду для шага 4.6.1.
6. Выполнения c комплект⁺ ячейки изоляции.
   1. Следовать microbead комплект протокола для c комплект⁺ ячейки изоляции. Ресуспензируйте Пелле клеток в 80 мкл до 10⁷ клеток ПБС + ЭДТА BSA. Для суспензии клеток 20 мкл CD117 микрошарики/10⁷ всего клеток. Смесь хорошо, vortexing и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C. Довести объем до 10 мл, добавив 1 x PBS + ЭДТА + BSA и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин.
   2. Удалить супернатант через вакуум и приостановить Пелле клеток в 500 мкл/10⁸ всего клеток в однократном ПБС + ЭДТА BSA. С помощью магнита стенд с магнитной колонкой прилагается, добавить 3 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA и позволить ему течь через через гравитации в 15 мл трубку коллекции.
   3. После прохождения через колонку, первое дополнение буфера добавьте суспензию клеток в столбце, позволяя ей течь через через тяжести трубу 15 мл коллекции. Этот проточные является часть нежелательных клеток.
   4. Промойте колонку 3 раза с PBS 1 x 3 мл + ЭДТА BSA каждый раз, позволяя ей течь через через тяжести трубу коллекции. Удалите столбец из магнита и на верхней части трубки 15 мл.
   5. Добавьте 5 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA и немедленно промойте поршень с столбце. Удалите поршень и повторите заподлицо с еще 5 мл 1 x PBS + ЭДТА BSA. Подсчитать ячейки в общем объеме с использованием стандартных методов.
   6. Спин вниз клетки на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в полной IMDM (IMDM + 10% FBS + ИЛ-6 [10 нг/мл] mSCF [50 нг/мл] + FLT3 лигандом [20 нг/мл] + Ил-3 [10 нг/мл]) для культуры. Культура, которую эти клетки на ночь в 2 х 10⁶ клеток/1 мл клеток IMDM полный СМИ, поместив их в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂.

5. трансдукция

1. Трансфекция ретровирусных плазмиды
   1. Свеже оттепели HEK293 клетки, днем раньше в водяной бане равным 37 ° C. Спина cryotube, содержащие клетки ГЭС на 435 x g при комнатной температуре 3 мин удалить супернатант через вакуум и приостановить Пелле клеток в 1 мл DMEM дополнена 10% FBS, пенициллин, стрептомицин и глутамина.
   2. Подсчитать количество ячеек и добавьте соответствующие тома 10 см лечение блюдо (~ 4 х 10⁶ HEK293T клеток). Добавить 14 мл DMEM 10 СМИ на блюдо и перемешать хорошо, сдвинув вверх и вниз для равномерного распределения воздуха. Поместите блюдо в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора на ночь.
   3. На следующее утро, проверить слияния клеток под микроскопом перевернутый свет (50% или более работает хорошо).
   4. Объединить ДНК (желаемых ретровирусной плазмида), PclEco (упаковка плазмида), 2 M CaCl₂и H₂0 в 1,5 мл (= 500 мкл) с использованием микропипеткой в следующих размерах: 7.5 мкг ДНК (BCR-ABL1-рекламы ЯФП), 7.5 мкг pCLeco, 62 мкл CaCl 2 M₂ и вода в окончательный объем 500 мкл. добавить 500 мкл 2 x HBS к другой 1,5 мл.
   5. Добавление ДНК смесь каплям до 1,5 мл, содержащих 500 мкл 2 x HBS (280 мм NaCl, 100 мм HEPES и 1,5 мм Na₂HPO₄) во время смешивания. Добиться этого путем установки вихрь на низкой скорости и удерживайте HBS трубки на его постоянном перемешивании при добавлении трансфекции микс.
   6. Разрешить смесь трансфекции для инкубации для 20-30 мин при комнатной температуре. Во время инкубации добавить 25 Нм хлорохина к клеткам ГЭС и поместите их обратно в инкубаторе. После инкубации добавьте смесь трансфекции каплям ГЭС клетки и, затем, осторожно вихревой СМИ смешать трансфекции смеси по всей пластине.
   7. Инкубируйте клетки с смесь для ~ 8 ч при 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора. Измените СМИ на эти клетки, очень медленно добавляя 14 мл свежего DMEM 10 средств массовой информации. Дозирование медленно к стене блюдо помогает предотвратить любые зачистки ГЭС клеток. Инкубируйте клетки на ночь в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора.
   8. Собирать вирусный супернатант с 10 мл шприц, рисовать супернатант в шприц и присоединить шприц 0,45 мкм фильтром. Окунитесь вирусный супернатант в новой коллекции трубки. Возьмите первый сборник вирусных супернатанта ~ 16 ч позже.
2. Фибронектин вирусный концентрации и трансдукция
   1. Добавьте 2 мл 0,1 мг рекомбинантного человеческого фибронектин фрагмента в однократном ПБС в необработанной 6-ну культуры пластин. Подготовить столько фибронектин, при необходимости, которая зависит от количества клеток и генотипов. Один хорошо можно достаточно передают 10 миллионов клеток c комплект⁺ . Инкубировать пластину на ночь при 4 ° C.
   2. Следующий день, удалите фибронектин из скважины с дозатор, пипетки 2 мл стерильного 2% BSA в однократном ПБС блокировать пластину, и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре. Удаление BSA через вакуум и стирать тщательно дозирования 2 мл ПБС, а затем удалить его через вакуум.
   3. Немедленно Добавьте свеже собранных и отфильтрованных (на 0,45 мкм) вирусный супернатанта до 5 мл. Центрифуга на 435 x g 32 ° c, 2 ч. удалить супернатант через вакуум и повторить этот шаг с дополнительные свеже собранных вирусный супернатант и спина снова. Удалить супернатант через вакуум и Промыть лунки, добавив 2 мл ПБС; затем удалите его через вакуум.
   4. Добавьте что мышь c комплект⁺ клетки что культивировали ночь (шаг 4.6.6) вирусный покрытием скважины путем смешивания суспензий клеток хорошо и закупорить их в пластину вирусный концентрированной фибронектин теперь. Спина на 1200 x g при 25 ° C для 90 минут поставил клетки в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора.
   5. 48 ч posttransduction, Пелле клетки центрифугированием при 1200 x g на 4 ° C на 5 мин и Ресуспензируйте их в СУИМ буфера #1 (ПБС + 0,5% BSA) / 6 x 10-⁶мл. Определите процент BCR-ABL1 позитивных клеток путем измерения доля рекламы ЯФП положительных с помощью проточной цитометрии.
   6. Приобрести события с стандартной процедурой. Во-первых ворота живых клеток, основанные на передней и боковых разброс. Затем ворота рекламы ЯФП положительный живых клеток, за исключением рекламы ЯФП negativecells определяется отрицательного контроля (рис. 4).

6. колонии формирование UnitAssays

1. Оттепель метилцеллюлоза с цитокинами для мыши при комнатной температуре на 1 – 2 ч. аликвота 3 мл метилцеллюлоза в трубу СУИМ, используя 5 мл шприц без иглы. Сортировать рекламы ЯФП положительных клеток на клетки сортировщика.
2. Спиновые клетки вниз и приостановить гранулы в IMDM полной СМИ. Подсчитать ячейки быть покрытием и ослабить их получить 5000 рекламы ЯФП положительных клеток в 100 мкл IMDM полный средств массовой информации.
3. 100 мкл суспензии клеток, содержащих 5000 рекламы ЯФП положительных клеток и соответствующие ингибиторы до 3 мл метилцеллюлоза (см. Таблицу материалы). Вихрь на высоких смешать его на 10 – 30 с.
4. После большинства из воздуха, которые избежали пузыри используйте 1 мл шприц для пластины 1 мл СМИ в трех реплицировать 3 см пластины извлечения средств массовой информации на одной стороне и медленно наклоняя тарелку в круговое движение, чтобы равномерно.
5. Конечная концентрация ингибиторов для использования являются иматиниба в 3 мкм, DFC на 0,2 мкм и BCI в 0,5 мкм, самостоятельно или в комбинации. Везде, где это уместно, удалите c-Fos покрытие клетки с 4-hydroxytamoxifen (1 мкг/мл) добавляется метилцеллюлоза.
6. После обшивки, поместите пластины в большой Петри с одной открытой блюдо, содержащий 2 мл стерильной воды в середине. Обложка большой Петри блюдо тщательно и инкубировать и при 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора. Запись колонии после одной недели число покрытий путем подсчета общее количество колоний под микроскопом.
7. Анализируйте несколько колоний от соответствующие пластины для удаления c-Fos методом ПЦР. Соберите колоний, высасывая их с наконечником P1000. Выбить клетки в 500 мкл ПБС Стиральная кончик в PBS несколько раз. Спина клеточных суспензий на 6000 x g за 1 мин и извлечь ДНК клетки Пелле, с использованием геномной ДНК изоляции комплекта.
8. Используйте геномной ДНК для ПЦР праймеры МФО FP3 и МФО-RP5, как описано в таблице 2. Анализ продуктов ПЦР на 2% агарозном геле и изображения с помощью гель системы документации.
9. Для графического представления колоний пятно колоний, с помощью Iodonitrotetrazolium хлорид. Растворите 10 мг хлорида Iodonitrotetrazolium в 10 мл воды для получения 1 мг/мл раствора. Фильтр стерилизовать решения с помощью люэровского с 0,2 мкм фильтром прилагается к 10 мл шприц в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном.
10. В культуре ткани капот добавьте 100 мкл окрашивание раствора каплям вокруг CFU плита; Будьте осторожны, чтобы не скользить или беспокоить колонии. Инкубируйте пластины на ночь в 37 ° C, 5% CO₂ клетки культуры инкубатора. Колонии превратит красновато коричневый. Используя белый фон в стерильных культуры ткани капот, принимать фотографии окрашенных CFU пластины.

7. пересадка и смертности Assay

1. Смертельно облучить мышей с Сплит излучения с помощью 137 Cs основе гамма излучения в дозировке 7,0 гр, следуют 4,75 гр (0,5 гр/мин), 3 h друг от друга до пересадки.
2. Пересадка 4 x 10⁴ несортированные рекламы ЯФП позитивные (рассчитывается на основе процентной доли рекламы ЯФП) клетки с 3 x 10⁵ клеток нормального костного как перевозчик в каждой мыши через хвост вен инъекций.
3. После одной недели трансплантации определите приживления, анализируя рекламы ЯФП положительных клеток в периферической крови, использование СУИМ.
4. Выполните хвост Вены кровь и анализ СУИМ.
   1. Теплый клетки мышей под тепла лампы с осторожностью не перегреть или сжечь их.
   2. Сдерживать мышь в мыши фиксатор и Ник хвост вен с стерильные лезвия. Аккуратно молока хвост от впереди кзади, позволяя капли крови накапливается. Сбор крови с гепаринизированным капиллярную трубку до тех пор, пока он наполнен (собирать вокруг 75-100 мкл). Окунуться кровь из заполненных капиллярной трубки в пробирки, содержащие ЭДТА и хорошо перемешать.
   3. Лизируйте RBCs, добавив 30-40 мкл крови 3 мл буфера lysis РБК 1 x (хлорид аммония 150 мм, 10 мм калия бикарбонат и 0,13 мм ЭДТА). Перемешайте, инвертирование трубке несколько раз. Инкубации при комнатной температуре на 10 – 15 мин спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант через вакуум и приостановить гранулы в 2 мл 1 x PBS для мытья.
   4. Спина на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и приостановить его в СУИМ буфер #1. Провести анализ СУИМ, как описано выше в шаге 5.2.5–5.2.66. Трубка краткосрочные магазин оставшихся крови в коллекции, которые могут быть использованы для различных других целей, при 4 ° C.
5. Для эксперимента были использованы пересаженных мышей, которые показали 10 – 40% рекламы ЯФП положительных клеток в периферической крови. Мышей, которые были менее чем 2% рекламы ЯФП положительных клеток были исключены из исследования.
6. Подготовить тамоксифен в 20 мг/мл в кукурузном масле при температуре 60 ° C с прерывистой vortexing до тех пор, пока полностью не растворится и хранить его на 4 ° C в темноте в течение лечения. После одной недели трансплантации, удалить аллеля c-Fos^fl/fl путем инъекций тамоксифен (100 мг/кг в кукурузном масле) внутрибрюшинно (и.п.) в мышей, каждый день в течение трех дней подряд. Важно, что мышей взвешивают определить сколько тамоксифен придать. После лечения тамоксифен (при необходимости), группе мышей для лекарств (n = 5/группа).
7. Контролировать мышей для лейкемии прогрессии и выживания и определить лейкозных бремя (рекламы ЯФП положительных клеток по СУИМ) загрузок вплоть до восьми недель в живых мышей.
8. Анализ крови для удаления c-Fos везде, где это целесообразно, как описано выше в разделе 6. Записать количество живых мышей каждый день и участок кривой выживания в конце эксперимента с использованием графического программного обеспечения.

8. трансгенных мышей модель BCR-ABL1 лейкемии

1. Изоляция LSK
   1. Поддерживать Scl-tTA трансгенных мышей на Чоу доксициклин для предотвращения выражение BCR-ABL1. За четыре недели до трансплантации, взять мышь от доксициклин Чоу для BCR-ABL1 выражения.
   2. Изолируйте от трансгенных мышей Scl-tTA TMNCs, как описано выше в разделе 4. Приостановите TMNCs в СУИМ буфера #2 (ПБС + 0,5% BSA + 2 мм ЭДТА), для получения 10⁶ клеток/мл.
   3. Разрушающим TMNCs для линии положительных клеток путем добавления 10 мкл линии клеток обнаружения коктейль биотин (биотина конъюгированных моноклональных антител против CD5 [крыса IgG2a], CD11b [крыса IgG2a], CD45R [B220] [крыса IgG2a], анти-7-4 [крыса IgG2a], анти-Gr-1 [Ly-6G/C, крыса IgG2a] и анти-Тер-119 [крыса IgG2b]) за 1 х 10⁶ клеток. Инкубируйте клетки на 4 ° C, за 10 мин в темноте, следуют мыть с 5 мл СУИМ буфера #2 и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин аспирата супернатант полностью и приостановить клетки в 400 мкл СУИМ буфера #2.
   4. Добавьте 5 мкл концентрированного препарата конъюгата антитела анти биотин-FITC, 1.2 мкл Ly-6A/E (Sca1) PECy7 и 2.4 мкл антител CD117 (c комплект) APC для до 10⁸ миллионов клеток. Инкубировать в темноте при комнатной температуре на 10 мин мыть путем привлечения объем до 5 мл с СУИМ буфера #2; затем центрифуги на 1200 x g при 4 ° C для 5 минут удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл СУИМ буфера #2.
   5. Фильтр суспензию клеток в трубку СУИМ синий фильтр Кап.
   6. Ворота живых клеток с помощью передней и боковых разброс. Затем выберите Линь^– клетки, которые показали МФО (означают интенсивности флуоресценции менее 10²) чтобы получить LSK клеток c комплект⁺ и Sca1⁺ на biexponential участок от родителя Линь^– и отсортировать их (рис. 7 C).
   7. Собирать сортировки клеток и центрифуги их на 1200 x g при 4 ° C за 5 мин.
2. Трансплантация
   1. Смертельно облучить BoyJ мышей с доза облучения Сплит 7,0 гр, следуют 4,75 гр через 3 ч, до пересадки.
   2. Придать 3 x 10³ до 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK клетки с 0,3 x 10⁶ клеток костного помощник от WT BoyJ мышей через хвост вен (и.в.) облученного BoyJ мышей.
   3. Четыре недели posttransplantation, анализировать получателя мышей для CD45.1 и CD45.2. Получите TMNC из периферической крови, хвост вен кровотечение, как описано в шаге 7.4. Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера СУИМ. Инкубируйте клетки с 1 мкл антител CD45.1-FITC и CD45.2-PE при комнатной температуре в течение 1 ч.
   4. Вымыть клетки, поднимая тома 3 мл с буфером СУИМ и спина на 1200 x g при 4 ° C за 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте в 200 мкл ПБС.
   5. Анализировать процент на CD45.1 и CD45.2, первые стробирования живых клеток, основанные на передней и боковых разброс, следуют стробирования FITC - и PE-положительных клеток, основанный на образце неокрашенных.
   6. Группа мышей на четыре группы (n = 6 для каждой группы). Начать лечение с imatinib (75 мг/кг 2 x в день) самостоятельно и в сочетании с DFC + BCI (обоих наркотиков были даны в дозе 10 мг/кг 2 x в день).
   7. Аналогичным образом, рассматривать другие группы с различными комбинациями imatinib (75 мг/кг) + куркумин (150 мг/кг), imatinib (75 мг/кг) + NDGA (100 мг/кг) + BCI (10 мг/кг) и BCI (10 мг/кг) за три месяца, 2 раза в день, по вводят и.п.
   8. Анализ мышей 1 x в месяц в течение шести месяцев для лейкозных химеризма путем определения процент CD45.2 позитивных клеток в периферической крови хвост вен кровотечение, как описано в шаге 7.4.

9. в оценке Vivo BCI и деятельности DFC

1. Анализ фосфо p38
   1. Возьмите три лейкозных мышей (8-12 недель), которые были пересажены с BCR-ABL1-выражая c комплект⁺ клетки, как описано в разделе 7. Придать мышей с BCI (10 мг/кг) путем инъекций posttransplant и.п. четыре недели.
   2. Измерения уровней фосфо p38 периферической крови TMNC с помощью комплекта цитометрии потока фосфорилирование согласно инструкциям поставщика. Сбор крови от каждой мыши до и 6 ч после инъекции наркотиков. Изолировать TMNCs, РБК истощения и исправить их следующим образом.
   3. Добавьте 4 мл раствора лизис РБК в 100 мкл периферической крови. Смешать и инкубировать на льду на 5 минут, чтобы лизировать RBCs. спин вниз клетки на 1200 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Повторите lysis 1 x больше.
   4. После второго шага лизиса Вымойте клетки окатышей с 1 мл 2% BSA в PBS. Исправьте клетки путем добавления 100 мкл фиксации и permeabilization решений и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в темноте. Пелле клетки центрифугированием при 1200 x g 5 мин при 4 ° C.
   5. Вымойте окатышей с 1 мл раствора 1 x permeabilization мыть. Заблокировать ячейки, добавив 300 мкл 2% BSA в буфере мыть permeabilization при комнатной температуре за 20 мин разделить ячейки на три равных аликвоты 100 мкл (~ 1 x10⁶).
   6. Для каждого Алиготе фиксированной клеток мкл 1 всего p-38 антитела, 1 мкл антител фосфо p38 или 1 мкл изотипа IgG управления, соответственно и инкубировать на ночь при 4 ° C.
   7. Вымыть клетки 1 x с 5 мл 2% BSA в PBS и проинкубируйте с вторичное антитело (1 мкл Alexa Fluor-488 конъюгированных) за 1 ч при комнатной температуре. Вымыть клетки 1 x снова и приостановить их в 200 мкл ПБС.
   8. Приобретение данных СУИМ и анализировать их, поток cytometry анализ программного обеспечения.
   9. Вычесть МФО IgG управления от МФО экспериментальных образцов. Затем значения МФО фосфо p38 нормализуются со всего p-38, чтобы определить уровни фосфо p38 после инъекции BCI.
2. Анализ количественный ген выражение генов-мишеней c Фос
   1. Возьмите три лейкозных мышей (8-12 недель), которые были пересажены с BCR-ABL1-выражая c комплект⁺ клетки как описано в разделе 7. Собирать периферической крови от каждой мыши и затем вставляют мышей с 10 мг/кг каждый DFC + BCI.
   2. Соберите периферической крови 6 ч после инъекции наркотиков. Изолируйте TMNCs, РБК истощения, как описано выше. Пелле TMNCs и приостановить их на основе фенола литического буфера (см. Таблицу материалы).
   3. Провести анализ RT-ПЦР (как описано в разделе 1) для Bcl2l11, Lif и IL-6 с использованием гена специфические праймеры (показано в таблице 1).

10. долгосрочные культуры инициирование Assay клетки

Примечание: LTCIC assay была выполнена, как описано ранее²⁵.

1. Расти мыши линии клетки фибробластов MS-5 в MEMα confluency в T175 колбу культуры ткани. Trypsinize клетки, как описано выше для HEK293T. Приостановите клетки в MEMα на 2 х 10⁶ клеток/мл. Взять 10 х 10⁶ клеток в 50 мл Конические трубки и излучают в 80 гр. Разбавьте клетки 0,5 х 10⁶ клеток/мл в MEMα с 10% FBS (M10) средства массовой информации. Пластина 2 мл на хорошо в пластине 12-Ну и инкубировать в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора на ночь.
2. На следующий день Подготовьте гидрокортизона натрия hemisuccinate, растворяя 2,5 мг в 5 мл MEMα (1 М раствора). Фильтр стерилизуйте гидрокортизон решения с помощью 0,2 мкм фильтром шприц в биобезопасности Худ. Разбавьте гидрокортизон путем последовательного разрежения в MEM для получения решения 100 мкм. Добавьте это 250 мкл 25 мл человека долгосрочных питательной среды (HLTM) (см. Таблицу материалы) только до использования, для достижения конечной концентрации 1 мкм.
3. Спин вниз CML-CD34⁺ и UCP3 TMNCs и приостановить их в HLTM, кратко vortexing и определить отсчеты Горяева.
4. Вакуумные покинуть M10 СМИ от 12-ну пластины семенами с клетками стромы и заменить его 1 мл пациента ячейки (CML-CD34⁺ [10000] и UCP3 TMNCs [1 x 10-⁶]) подвеска в HLTM. Используйте три скважины на комбинации препарата каждого типа клеток.
5. Разбавляют препараты запасов до 2 x требуемой концентрации в HLTM. Добавьте 1 mL СМИ с наркотиками в вышеупомянутых ячейки для получения 1 x концентрации наркотиков. Замените половину СМИ свежеприготовленный HLTM каждую неделю в течение пяти недель.
6. В конце 6 недельного периода пробирного LTC-IC Соберите nonadherent клетки в трубку от культур. Trypsinize адэрентных клеток и объединить их с соответствующими nonadherent клеток.
7. Вымыть клетки и assay для CFUs в метилцеллюлоза средних содержащие плода теленка 30% сыворотки крови, эритропоэтин (3 единиц/мл), SF (50 нг/мл) и Ил 3(20 ng/mL), Ил-6 (20 нг/мл), Г-КСФ (20 нг/мл) и гранулоцитов/макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (20 нг / mL). определить отсчеты Горяева.
8. Клемная 5 x 10⁴ клетки в три реплицирует. Заморозить вниз оставшиеся ячейки в 20% FBS и 10% ДМСО. Организуйте и пластины в большой Петри с одной открытой блюдо, содержащих воду в середине. Тщательно покрыть большие Петри и инкубировать в 37 ° C, 5% CO₂ инкубатора на две недели.
9. Оценка колоний спустя две недели. В некоторых случаях только часть урожая является assayed для CFUs). Рассчитайте общее количество LTCIC в суспензии первоначальных клеток путем экстраполяции на основе CFUs, полученные от части урожая ячейки. Средний выход кое за LTC-IC — 8.
   Примечание: Например если первоначально 1 х 10⁶ клеток были покрытием в колодец, после пяти недель, 0,5 х 10⁶ клеток были собраны, для ГРУ, 5 x 10⁴ клетки были покрытием и 50 CFUs были получены. Это равняется 500 CFUs/1 миллион клеток покрытием. Разделите это число на 8, чтобы получить LTCIC, который является 62,5.

11. гуманизированные модель мыши, с помощью CML CD34 клетки⁺

1. Sublethally облучить 8 week-old NOD scid гамма мышей, выражая человеческого уровня IL3, ГМ-КСФ и ФСД (NSGS), с одной дозы 7,0 гр (700 заявках) с 50 заявках/мин.
2. Придать 3 х 10⁶ CD34⁺ выбираются ячейки от CML BCR-ABL1-положительных больных хронической фазы в облученных мышей внутривенные инъекции.
3. После двух недель после трансплантации определите лейкозных приживления в костном мозге, с помощью мыши и человека-антитела против CD45 СУИМ.
4. Выполните анализ СУИМ.
   1. Возьмите аспирата костного мозга от бедра пересаженных мышей. Лизировать RBCs, с использованием буфера lysis РБК, как описано выше и собирать TMNCs центрифугированием. Помыть лепешка 1 x с холодной ПБС.
   2. Заблокировать ячейки с человека FcR блока и мыши FcR следуют окрашивание с антинародным CD45 FITC и анти мыши CD45 APC^Cy7 на ночь при 4 ° C. Выполнить анализ СУИМ на LSRII и анализа данных, используя поток cytometry анализ программного обеспечения.
5. Группа мышей в четырех различных когорт (n = 6/группа) для лечения с транспортного средства, imatinib (75 мг/кг), DFC + BCI (как на 10 мг/кг), или imatinib (75 мг/кг) + DFC BCI (как на 10 мг/кг). Разбавить запасов лекарств в однократном ПБС (автомобиль) и управлять ими путем инъекций их и.п. 2 x в день.
6. Лечить мышей в течение шести недель и определить лейкозных бремя каждые две недели, до 8 недели после трансплантации, как описано выше в 11,4.

Результаты

Терапевтическая эффективность TKIs были причастны онкогена наркомании. Однако механизмы, вождение онкогена зависимость не понятны. Мы провели несколько беспристрастной ген выражение анализа для идентификации генетический компонент, участвующих в оркеструя наркомании. Эти анализы показали upregulation трех генов, c Фос, Dusp1 и Zfp36, в раковых клетках, которые не зависят от онкогенные сигнальные для выживания и, таким образом, не чувствительны к лечению тки. Даунрегуляция c-Fos и Dusp1, и...

Обсуждение

Для подавляющего большинства раковых клеток терапевтический ответ тки опосредовано блокаду тирозин киназы онкопротеин сигналов, к которым пристрастилась опухоли. Однако относительно мало известно о как меньшинство раковых клеток, способствуя MRD избежать онкогена зависимость и терапии⁴. Недавние исследования показали, что фактор роста сигнализации опосредует лекарственной устойчивости в лейкоз и твердых органа опухоли. Это свидетельствует о том, что различные молекулярные механизмы могут лежат в о...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment Takara		T100B
MethoCult GF M3434 (Метилцеллюлоза для КОЕ мыши)	Стволовые клетки	3434
MethoCult H4434 Classic (Метилцеллюлоза для КОЕ человека)	Стволовые клетки	4434
4-гидрокситамоксифен	Sigma	H6278
Рекомбинантный мышиный SCF	Prospec	CYT-275
Рекомбинантный мышиный Flt3-лиганд	Prospec	CYT-340
Рекомбинантный Мышиный ИЛ-6	Prospec	CYT-350
Рекомбинантный Мышиный ИЛ-7	Пепротех	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	i-5508
Куркумин	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Трипсин ЭДТА 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-глутамин	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 мг/мл запаса в воде
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO47H2O	Sigma	S9390
Сульфат протамина	Sigma	P3369	5 мг/мл запас в воде
Trypan Blue раствор (0,4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0,45 μ M acro дисковый фильтр	PALL	2016-10
70 μ m нейлоновая клетка stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (полизукроза)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Колонки	Miltenyi	130-042-401
Коктейль ингибиторов протеазы	Roche	CO-RO
Ингибитор фосфатазы 2	Sigma	P5762
Мембрана из нитрокуллулозы	Bio-Rad	1620115
субстрат SuperSignal West Dura увеличенного срока действия (субстрат хемилюминесценции)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
антибиотин-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-GR-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD
CD117 APC	BD
BD Pharm Lyse	BD
BD Cytofix/Cytoperm (Раствор для фиксации и пермеабилизации)	BD
BD Пермь  (раствор для пермеабилизации и промывки для потока фосфоса)	BD
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Мышиный контроль IgG	BD
Alexa Flour 488 конъюгированный	Invitrogen	A-11034
Кальция хлорид	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
ЭДТА	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Капиллярные пробирки для крови	Fisher	22-260-950
Пробирка для сбора крови	Giene Bio-One	450480
Сыворотка для новорожденных теленка	Atlanta biological	S11295
Эритропоэтин	Amgen	5513-267-10
человек SCF	Prospec	CYT-255
Человек IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (среда для анализа LTCIC)	Технологии стволовых клеток	5100
Гидрокортизон Гемисукцинат натрия	Технологии стволовых клеток	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 инсулиновый шприц 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
пестик Mortor	Coor tek	60316 и 60317
Изофлоран (Изотезия TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ампициллин	Sigma	A0166	100 мг/мл бульон в воде
Бакто агар (агар)	Difco	214050
Потрясающий бульон	Бектон Дикинсон	243820
Агароза	Геномат	Е-3119-500
Доксициклин	TestDiet.com	52662	модифицированный RMH1500, автоклавируемый 5LK8  с 0,0625% доксициклина
Тамоксифен	Сигма	Т5648
Йодонитротетразолия хлорид	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq-полимераза с зеленым красителем)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (Набор для выделения РНК)	Qiagen	217084
набор ДНК без ДНК (лечение ДНК для ПЦР ОТ)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (обратная транскриптаза для синтеза кДНК)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (смесь так-полимеразы с зеленым интерчалирующим красителем для количественной ПЦР)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Долгосрочный анализ клеток, инициирующих культуру человека	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 инкубатор	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 автоматический счетчик клеток	Bio-RAD
C-1000 Thermal Cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (система визуализации гелей и вестерн-блотов)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (счетчик boold)	Drew-Scientific
LSR II (FACS анализатор)	BD
Fortessa I (анализатор FACS)	BD
FACSAriaII (сортировщик FACS)	BD
Магнитная подставка	Miltenyi
	J.L. Shepherd and Associates, Сан-Фернандо, Калифорния	Mark I Model 68A	, источник Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Доктор Клаудия Хюттнер s lab
BoyJ	центр мышиного ядра в CCHMC
C57Bl/6	Ядро
NSGS	в CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Сделано на дому
Cells
BaF3	Подарок от Джорджа Дейли, Гарвардская медицинская школа, Бостон
WEHI	Подарок от Джорджа Дейли, Гарвардская медицинская школа, Бостон
CML-CD34+ и нормальные CD34+ клетки	Университетская больница, Университет Цинциннати