Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подготовка 68Ga меченых аргинин глицин аспартат (РГД)-пептид по ангиогенез

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58218

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Интегрин3 βvα — это тип сцепления белка, что высоко выражается на активированных эндотелиальные клетки проходят ангиогенеза. Таким образом оценки целостности Интегрин представляет большой интерес в онкологии. Здесь мы представляем метод подготовить 68Ga меченых radiopeptides и метода для оценки его биологической эффективности.

Аннотация

Интегрин3 β αvявляется гетеродимерная молекулы адгезии, участвующие в миграции опухолевых клеток и ангиогенеза. Интегрин оверэкспрессировали в эндотелиальных клетках ангиогенных опухоли, где она обычно имеет низкой концентрации. Это конкретное выражение αvβ3 делает его допустимым biomarker для антиангиогенных и изображений наркотиков. Как функционального механизма визуализации позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) предоставляет информацию о биохимических и физиологических изменений в естественных условиях, благодаря своей уникальной высокой чувствительности в наномолярных масштабе. Следовательно на основе radiometal PET радиофармпрепаратов получили большое внимание для неинвазивной квантификации по ангиогенез опухоли. Этот документ содержит системный протокол подготовить новый radiometal меченых пептид для оценки по ангиогенез. Этот протокол содержит информацию о радиохимической надежности, липофильностью, клеток поглощения, сыворотка стабильности и фармакокинетические свойства. 68Ga-РГД пептида является одним из представитель PET лигандов сторону α βv3 Интегрин. Здесь мы представляем протокол подготовить 68Ga-РГД пептида и оценки биологической эффективности.

Введение

Ангиогенез-это биологический процесс, который характеризуется развитием новых кровеносных сосудов. Среди многих факторов angiogenetic, α βv3 Интегрин ассоциируется с инвазивность, потому что Интегрин высоко выражается в ангиогенных опухоль сосудов, но отсутствует в нормальной ткани1.

Radiolabeled рецептор привязки пептиды с аргинина глицин аспартат (РГД) домена, который имеет высокое сродство к α βv3 Интегрин рецепторов, считаются перспективных ангиогенеза изображений агентов2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. были созданы несколько препаратов для Питомца и его биологические свойства были проверены в различных животных моделей8,9,10,11. С точки зрения радионуклида, 68Ga имеет ряд преимуществ перед другими радиоизотопов. Во-первых он имеет высокую доступность для пользователей и экономически выгодно, потому что циклотрон не требуется. Во-вторых 68Ga основе радиофармпрепаратов производят высокое пространственное разрешение, по сравнению с Однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), позволяя более точную количественную оценку. И наконец период полураспада 67.71 минут 68га может быть достаточно для подготовки мелких пептидов и белков.

Для получения стабильного комплекса с 68Ga, были разработаны многие энтеросорбенты. Представитель энтеросорбенты являются 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanetetraacetic кислота (тета), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic кислота (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic кислота (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic кислота (DTPA) и N, N'-di(2-hydroxybenzyl) Этилендиамин N, N'-diacetic кислота (HBED). Сообщается, что нота высокостабильных комплекс с 68Ga (стабильность постоянной 30.98 журнала)12,,1314.

Целью настоящего исследования является предоставить краткий протокол для развития новой radiopeptide (рис. 1). В качестве примера мы готовим 68Ga меченых РГД пептиды и нынешние методы биологической оценки этих аналогов в гранулы ксенотрансплантата модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования исследований животных протоколы, утвержденных Кореи Института радиологической и медицинских наук животных исследования Комитета. Все реагенты и растворители были приобретены и использованы без дальнейшей очистки. НОТА-РГД пептиды были подготовлены согласно литературе методы15.

Предупреждение: 68Ga испускает Позитрон и гамма-лучей. Все экспериментов, в том числе прямых или косвенных контактов с радиоактивными веществами, должна проводиться на подготовку и разрешается только персоналом. При обработке радиоактивных материалов, следует использовать надлежащего защитного оборудования, защитных, знак дозиметр радиации и кольца и дозиметр.

1. radiolabeling РГД пептиды с 68GaCl3

Примечание: 68Ga (t1/2 = 68 мин, β+ = 89% и EC = 11%) был получен из 68Ga /68Ge генератор.

  1. Элюировать 68GaCl3 от генератора с 4 мл 0,05 М HCl.
  2. Продувки азотом при 80 ° C за 30 мин до сухого 68GaCl3 (333 КБК, 1 мл) в 5 мл флаконе реакции.
  3. Добавить решение РГД-пептида (100 мкг) в ацетат натрия 1 М (100 мкл, pH 5-6) в реакции флакон, содержащий 68GaCl3 с шагом 1,2.
  4. Нагрейте смесь реакции при 80 ° C за 5 мин. Затем остудить до комнатной температуры.
  5. Очистки сырой продукт с высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Используйте следующие системы: столбец C-18, скорость потока 0,5 мл/мин, градиента склоне Ацетонитрил 1.17%/min (5% - 40% в 30 мин.), и элюции компонентов: A = 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в ацетонитриле, B = 0,1% TFA в воде.
    Примечание: ВЭЖХ оснащен массив фотодиод детектор и Детектор радиоактивности. На 68Ga-РГД пептид была собрана во время удержания 12,5 минут (рис. 2).
  6. Очищайте результирующий 68Ga-РГД пептид с помощью системы извлечения твердой фазы.
    1. Передайте решение через картридж реверс фаза C18 и мыть с 2 мл физраствора.
    2. Элюировать 68Ga-РГД пептид с 0,7 мл этанола 95%. Удаление растворителя при 80 ° C под газ азот для 20 мин и воссоздания с фосфат амортизированное saline (PBS) перед использованием.
    3. Фильтр radiolabeled продукт через фильтр 0,22 мкм стерильным и сформулировать в 1 мл стерильного физиологического раствора.
  7. Проверьте радиохимической доходность по радио тонкослойной хроматографии (ТСХ).
    1. Пятно 1 мкл на пластину хроматографии мгновенно тонким слоем (налогам, 10 см в длину). Разработка пластины в камере, содержащей элюента (водного раствора лимонной кислоты 0,1 М, pH 5,0) до 9 см от пятно.
      Примечание: Коэффициент удержания для 68Ga-РГД пептид 0 и коэффициента удержания для непрореагировавшего 68Ga3 + 1.
  8. Вычислите окончательного удельной активности от соотношения радиоактивности, соответствующий не радиоактивности как MBq/нмоль.
    Примечание: После инъекции 100 мкл сформулировал 68Ga-РГД пептид для ВЭЖХ, количество нерадиоактивные компонента была рассчитана из стандартного калибровочной кривой с помощью нерадиоактивных Ga-РГД пептида.

2. в Vitro клеточного поглощения

Примечание: Уппсала 87 Злокачественная Глиома (U87MG) человеческий глиобластома клетки были выращены в Дульбекко изменение орел СМИ (DMEM), дополнены 10% плода bovine сыворотки и 1% пенициллин стрептомицина. Клетки были выращены в 150 мм блюд при 37 ° C в атмосфере увлажненные 5% CO2. Клетки были собраны или разделить trypsinization: 0,25% (w/v) трипсина и 0,02% (w/v) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS при 37 ° C для 3-5 мин.

  1. Семя U87MG клетки в 6-ну пластины на плотности 1 х 106 клеток/хорошо.
  2. Инкубировать клетки с 68Ga-РГД пептида (111 КБК) при 37 ° C на 30, 60, 90 и 120 мин подготовка образцов в трех экземплярах.
  3. Вымыть клетки 2 x с 2 мл PBS и урожай на trypsinization. Использование трипсин 0.25% (w/v) и 0,02% (w/v) Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS при 37 ° C для 3-5 мин.
  4. Собирайте суспензию клеток (500 мкл) и меру в γ-счетчик.
  5. Рассчитайте процент поглощение соединения клеток, % (засчитывается в клетки/общее число).

3. стабильность в Vitro сыворотки

  1. Добавьте 500 мкл свежеприготовленные мыши сыворотки, 500 мкл человеческой сыворотки и 500 мкл PBS. Инкубируйте смесь при 37 ° C на 2 ч.
  2. Оценивать по налогам в определенные промежутки времени (30, 60, 90 и 120 мин). Месте 1-2 мкл Алиготе смеси к налогам пластине (мобильный фаза: лимонная кислота 0,1 М). Разработка пластину как в шаге 1.7.
    Примечание: 68Ga3 + ожидается двигаться с растворителя Фронт, тогда как Приклеенные этикетку соединение будет оставаться в начале координат.

4. Определение липофильностью

  1. Добавить к системе октанол PBS 68Ga-РГД пептида (3,7 MBq, 3.7 мкл) (1:1, v/v, всего 1 мл).
  2. Смешайте флаконы энергично за 5 мин при комнатной температуре и центрифуги на 10000 x g 5 мин при комнатной температуре.
  3. Взять 100 µL пробы с каждого слоя и измерения радиоактивности с γ-счетчик. Значения log P значение основано на среднем трех образцов.

5. опухоль модель

Примечание: Обнаженная мышей BALB/c (6-8 недель старый, девушки, n = 23) были использованы для этого исследования. Мышей были впоследствии использованы для PET исследований (n = 3) и накопление (n = 20) когда томов опухоль достигла 200-300 мм3 (1-2 недель после имплантации).

  1. Загрузите опухолевых клеток в 28 G, 1/2 дюйма инсулиновые шприцы.
  2. Inject U87MG клетки (5 x 10-6) в 100 мкл PBS в регионе левую руку.
  3. Анестезировать мыши с 2% изофлюрановая в газообразного кислорода во время инъекции клеток.
    1. Убедитесь, что мышь был под наркозом потерей педали вывода рефлекс следующем щипать пинцетом между пальцами правой задних ног. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.

6. в естественных условиях количественная оценка αvβ3 Интегрин с помощью ПЭТ

  1. Анестезировать мышей с изофлюрановая 2% кислорода.
    1. Убедитесь, что мышь был под наркозом потерей педали вывода рефлекс следующем щипать пинцетом между пальцами правой задних ног. Не оставляйте животное без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
  2. Установите головку в центре PET козловой.
  3. Внутривенно применять 68Ga-РГД пептид решение (7.4 MBq, 200 мкл) гранулы ксенотрансплантата мыши модель через Вену хвост за 1 мин.
  4. В то же время выполняют ПЭТ-сканирование в режиме списка (динамическое сканирование) для 150 мин.
    Примечание: Необработанные данные Питомца были реконструированы, определяемые пользователем сроки (то есть, каждые 30 мин). После ПЭТ-сканирование, сканирование Микро Компьютерная томография (КТ) (50 kVp рентгеновского, 0,16 мА) был проведен для ослабления коррекции.

7. накопление Ex Vivo

  1. Inject 68Ga-РГД пептида (0.37 MBq, 200 мкл) в Вену хвост ксенотрансплантата мышиной модели. Анестезировать мыши с 2% изофлюрановая в газообразного кислорода во время инъекции.
    Примечание: Обнаженная мышей BALB/c, как описано в разделе 5, были разделены на четыре группы и жертву в разное время точках (n = 5 для каждой группы).
  2. Просыпайтесь мышей сразу после отправления 68Ga-РГД пептида и пожертвовать их на 30, 60, 90 и 120 мин postinjection с двуокиси углерода эвтаназии.
    Примечание: В тканях интерес были извлечены. Выбранные задачи были кровь, мышц, сердца, легких, печени, селезенки, желудка, кишечника, почек, костей и опухоли.
  3. Вес ткани и измерения радиоактивности с γ-счетчик.
    Примечание: Результаты были выражены в процентах вводят дозу в грамм ткани (% ID/g).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Хелаты 68GaCl3 с NOTA-РГД пептид была простой, и radiolabeling урожайность составила 99%. Реакция примесей были успешно удалены, как показано на рисунке 2. Радиохимический чистоту 68Ga-РГД пептид был больше чем 99%, и удельной активности в конце синтеза был 90-130 MBq/нмоль (рис. 3).

Поглощение ячейку значения для 68Ga-РГД пеп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании, мы ввели протокол подготовить radiopeptide, α βv3 Интегрин и его биологической оценки. Разработка традиционных лекарств включает в себя сложную процедуру. Это требует большое количество справочных материалов и оценки относительно длительного времени. Хотя предлагаемая методика не может заменить процесс деликатный оценки, эта система может использоваться для целей проверки. Эта предлагаемая система будет значительно сократить время и стоимость.

За...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана ядерных исследований и развития программы национального фонда исследований Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (№ 2017M2A2A6A02019904).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
68Ga/68Ge генераторITGCompany-10mCi 
Раствор хлористого водородаSigma-aldrich84429
Ацетат натрияSigma-aldrichS2889
C18 картридж с обратной фазойWatersWAT020515
0,22-μ m стерильный фильтрMillliporeSLGV033RS
Радио-TLC сканерBioscanAR2000
ITLC paperAgilentSGI001
Лимонная кислотаSigma-aldrich251275
система ВЭЖХWaters-Waters1525, содержащая бинарный насос, фотодиодную матрицу (Waters 2998), детектор радиоактивности (Raytest, Gabi)
АцетонитрилJ.T. Baker14-650-359
Трифторуксусная кислотаСигма-альдрич302031
модифицированная среда Dulbecco Thermo fisher scientific11965092
фетальная бычья сывороткаThermo fisher scientific16000044
T175 flasks CorningCLS431080
Трипсин-ЭДТА (0.25%)Thermo fisher научный25200072
пенициллин-стрептомицинThermo fisher научный15240112
γ-counterPerkin Elmer-1480Wizard 3
Insunlin шприцBecton Dickinson326105
насос SynringeHarvard Аппарат70-4500
микро-ПЭТ/КТSiemens Inveon-

Ссылки

  1. Friedlander, M., et al. Definition of Two Angiogenic Pathways by Distinct alpha v integrins. Science. 270 (5241), 1500-1502 (1995).
  2. Janssen, M. L., et al. Tumor Targeting with Radiolabeled alpha v beta 3 Integrin Binding Peptides in a Nude Mouse Model. Cancer Research. 62, 6146-6151 (2002).
  3. Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as αvβ3 integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (1), 128-135 (2002).
  4. Garanger, E., et al. New multifunctional molecular conjugate vector for targeting, imaging, and therapy of tumors. Molecular Therapy. 12 (6), 1168-1175 (2005).
  5. Dijkgraaf, I., et al. PET imaging of αvβ3 integrin expression in tumours with 68Ga-labelled mono-, di- and tetrameric RGD peptides. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 38 (1), 128-137 (2011).
  6. Liu, Z., et al. 68Ga-labeled cyclic RGD dimers with Gly3and PEG4linkers: Promising agents for tumor integrin αvβ3 PET imaging. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (6), 947-957 (2009).
  7. Li, Z. B., Chen, K., Chen, X. 68Ga-labeled multimeric RGD peptides for microPET imaging of integrin αvβ3expression. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35 (6), 1100-1108 (2008).
  8. Liu, S., et al. Isomerism and solution dynamics of 90Y-labeled DTPA-biomolecule conjugates. Bioconjugate Chemistry. 12 (1), 84-91 (2001).
  9. Haubner, R., et al. Glycosylated RGD-containing peptides: tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics. Journal of Nuclear Medicine. 42 (2), 326-336 (2001).
  10. Sivolapenko, G. B., et al. Imaging of metastatic melanoma utilising a technetium-99m labelled RGD-containing synthetic peptide. Euroean Journal of Nuclear Medicine. 25 (10), 1383-1389 (1998).
  11. Haubner, R., et al. Noninvasive Imaging of αvβ3 Integrin Expression Using 18 F-labeled RGD-containing Glycopeptide and Positron Emission Tomography. Cancer Research. 61, 1781-1785 (2001).
  12. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of trivalent metal ion complexes of the tetraacetate derivatives of 12-, 13- and 14-membered tetraazamacrocycles. Inorganica Chimica Acta. 190 (1), 37-46 (1991).
  13. Clarke, E. T., Martell, A. E. Stabilities of the Fe(III), Ga(III) and In(III) chelates of N,N′,N″-triazacyclononanetriacetic acid. Inorganica Chimica Acta. 181 (2), 273-280 (1991).
  14. Shetty, D., Lee, Y. S., Jeong, J. M. 68Ga-labeled radiopharmaceuticals for positron emission tomography. Nuclear Medicine Molecular Imaging. 44 (4), 233-240 (2010).
  15. Shin, U. C., et al. Synthesis and Preliminary Evaluation of 68Ga-NOTA-Biphenyl-c(RGDyK) for the Quantification of Integrin αvβ3. Bulletin of the Korean Chemical Society. 38 (12), 1415-1418 (2017).
  16. Cai, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. Journal of Nuclear Medicine. 49, suppl2 113-128 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Маркировка галлием-68Синтез RGD-пептидаВизуализация ангиогенезаПЭТ-радиофармпрепаратыВысокоэффективная жидкостная хроматографияАнализ поглощения клеткамиТест на стабильность в сывороткеИзмерение липофильностиБиораспределение в опухолиРадиохимический выход
Подготовка 68Ga меченых аргинин глицин аспартат (РГД)-пептид по ангиогенез
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.