Method Article

Настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирование (STAgR)

DOI:

10.3791/58556

⸱

December 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1MCN Junior Research Group, Munich Center for Neurosciences, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center, 2Institute of Stem Cell Research, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 3Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum, German Research Center for Environmental Health, 4Physiological Genomics, Ludwig Maximilian Universitat, BioMedical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем строка Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR), метод легко мультиплекс gRNA векторов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подходов. STAgR делает gRNA мультиплексирования простой, эффективной и настраиваемые.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальные ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы значительно увеличил методологические варианты для жизни ученых. Из-за его использования генетический и геномный техники стала применяться для широкого спектра систем. Кроме того многие транскрипционный анализ и epigenomic инженерные подходы в настоящее время в целом целесообразно в первый раз. Одна из причин для широкой применимости ТРИФОСФАТЫ заключается в его двустороннего характера. Небольшие оформления определить genomic цели комплекса, варианты белка Cas9 и местные молекулярной последствия. Однако многие ТРИФОСФАТЫ подходов зависит от одновременной доставки нескольких оформления в отдельные клетки. Здесь мы представляем настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR), метод, который позволяет простым, быстрым и эффективным поколения мультиплексированных gRNA векторы выражения в одном клонирования шаг. STAgR является экономически эффективным, поскольку (в этом протоколе) индивидуальной нацеленности последовательности вводятся короткий свес грунтовки в то время как длинный ДНК шаблоны кассет gRNA выражение может быть повторно использован несколько раз. Кроме того STAgR позволяет один шаг большое количество оформления, а также комбинации различных gRNA вариантов, векторы и промоутеров.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Строка Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR) — это метод, позволяя эффективно ночи поколения векторы выражения, содержащие несколько gRNA выражение кассеты в один единый клонирования шаг. Протокол STAgR не зависит от опыта специалиста или материалов и предлагает несколько вариантов для настройки.

Бактериального белка ТРИФОСФАТЫ Cas9 имеет уникальный потенциал. Это возможность найти и избирательно связывают только те последовательности ДНК закодированы в естественно-происходя crRNAs или инженерных оформления1. Его использование как инструмента молекулярной позволило большое количество подходов, которые было невозможно, неосуществимым или ограничивается только определенных клеточных моделей до недавнего времени. К ним относятся целевые ген мутации2, геном инженерных3, epigenome,4,5,6, transcriptional активации и7,8экспрессию гена редактирования. Насколько мы знаем, что ТРИФОСФАТЫ универсально развертываемого, как сообщает его применения существуют для широкого круга целевых сайтов, типы клеток и видов. Однако многие приложения ТРИФОСФАТЫ зависит прямо или косвенно доставки нескольких оформления, включая серию геномной манипуляции (транслокации9,10, средние11 и больших масштабах геномных изменений 12 , 13), геном инжиниринг (использование Cas9 nickases14), поколения условного аллели11,15 или16последовательных мутаций и трассировки стратегии17. Кроме того для других подходов (транскрипционный анализ инженерных18, epigenome, инженерных19,20) несколько таргетинга сайты не являются строго обязательными, однако они достигают их максимальный эффект часто только по этому состояние.

Были описаны несколько полезных методов для создания gRNA векторов, содержащие более одного gRNA выражение кассеты21,22,23,24,25,26, 27. Здесь мы представляем протокол для STAgR, строка Ассамблеи gRNA клонирования, который является выдающимся в своем сочетании простоты и скорости (клонирования шаг необходим только один на ночь), низкой стоимости (как ДНК шаблоны могут использоваться несколько раз), настраиваемость (для различные gRNA систем и промоутеров) и эффективность (это позволяет генерации векторов, содержащих большое количество кассет gRNA)28.

STAgR могут в принципе использоваться для генерации векторов выражения с несколько (1 – 2 оформления), несколько (3 – 5 оформления) и некоторые из наибольшее количество кассет выражение сообщает пока (6 – 8 оформления)28. Аналогично STAgR применяется для любой последовательности gRNA, позвоночника или промоутера. Поскольку, однако, STAgR главным образом на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Ассамблеи Гибсон, оформления с высоким последовательность сходства должны создаваться с использованием альтернативного метода.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. дизайн STAgR клонирования стратегия

  1. Решение о том, как многие gRNA кассеты будет включен в одно выражение вектора и в каком порядке. Определить, какие промоутеров и gRNA подмостей должны использоваться для каждого из оформления. Дизайн оформления с помощью любого онлайн-инструмент (например, www.benchling.com).

2. дизайн STAgR клонирования грунты с выступами

Примечание: Последовательность protospacer смысл последнего gRNA и antisense первый gRNA соответственно добавляются праймеры PCR, используется для усиления вектор позвоночника (рис. 1). Оставшиеся последовательности усиливаются от строк, тем самым придавая смысл и антисмысловых оформления в желаемом порядке. Первая строка кусок усиливается с вперед грунт, содержащий первый gRNA N20 последовательности как свес и обратный грунт с второй gRNA N20 последовательности (обратный дополнение) как навес. Все следующие фрагменты создаются соответственно.

  1. Добавьте N20 gRNA последовательности вперед усилители Праймеры для строки STAgR ДНК как свесы (Таблица 1). Добавьте чувство gRNA последовательности 5' вперед грунт «СКФ FP» (для обычных леску) или «sam-FP» (для содержащих лески МС2). FP праймеры обжигают в эшафот/MS2 часть строки, соответствующие STAgR (рис. 1).
  2. Добавьте обратный дополнением N20 gRNA последовательность обратного грунтовка последовательностей. Выберите RP грунтовки в зависимости от конкретных промоутеров и строки, используемые (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-РП).

3. поколение STAgR, клонирование фрагментов

  1. Для создания отдельных клонирование фрагментов для Ассамблеи Гибсон, выполнять PCR, создав 10 мкл буфера высокой верности (ВЧ), 1 мкл 10 мм дНТФ, 0,25 мкл навес грунтовка (100 мкм), 10 нг полимеразы дна шаблона (строка или вектор), 0.5 мкл ВЧ , 1,5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и добавьте H2O сделать окончательный объем 50 мкл.
    Примечание: Использовать плазмида «STAgR_Neo» как шаблон для позвоночника ПЦР для включения gRNA эшафот чтобы последний gRNA, если леска Сэм выбран, использовать «STAgR_SAM». Например, для STAgR плазмиду с шестью gRNA кассеты шесть ГКДЗ являются необходимыми, пять с ДНК строки как шаблоны и один с векторной основой как шаблон.
  2. Инкубировать реакции на Термоциклер с использованием следующих условий: 1 цикл 98 ° C за 1 мин 30 сек; 38 циклы 98 ° C 10 s, 59 ° C (для эшафот gRNA) / 68 ° C (для цикла SAM) для 10 s, 72 ° C для 30 s (для вставок) / 1 мин 30 s (для векторов); 1 цикл 72 ° C для 10 мин.
  3. Удаление 5.5 мкл от реакции PCR, добавить краситель загрузки и анализировать усиливается фрагментов на геле агарозы 1%. Нагрузки соответствующие лестница ДНК для калибровки (100 bp лестница/1 kb ДНК трап дна) и запуск гель в соответствующий гель работает буфера (например, TLE буфер) на 120 V за 30 мин.
  4. Пока выполняется гель, 5 мкл буфера с энзима ограничения и 0,5 мкл DpnI (10 единиц) к оставшиеся реакции PCR 44.5 мкл и Инкубируйте 30 мин до 1 часа при 37 ° C.
  5. Выполните Очищение дна с использованием магнитной бусины.
    1. Добавьте 1.8 мкл магнитные шарики в 1 мкл продукта PCR и смешивать, закупорить вверх и вниз. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре (RT).
    2. Отдельными валиками и фрагменты ДНК от остаточной жидкости с магнитом. Вымойте бусины дважды с 70% этанол, промыв гранул без resuspending полностью.
    3. Удалите все этанола с пипеткой и пусть Пелле воздух сухой.
    4. Растворяют гранулы в 15 – 20 мкл H2O, закупорить вверх и вниз и отдельные шарики от жидкости с помощью магнита. Передавать четкое супернатант новой трубки.
      Примечание: в качестве альтернативы, на основе столбцов реакции очистки наборы могут использоваться.
  6. Определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра, как описано в других разделах29.

4. Гибсон Ассамблеи реакции и бактериальных преобразования

Примечание: Следующие шаги адаптированы из Гибсон и др. 30.

  1. Подготовьте домашнее Гибсон реакции смешивать или использовать коммерческие клонирования комплект Гибсон.
    1. Объединить 3 мл 1 М трис (трис (гидроксиметил) aminomethane)-HCl при pH 7.5, 300 мкл 1 M MgCl, 60 мкл dGTP 100 мм (deoxyguanosine трифосфат), 60 мкл dATP 100 мм (аденозинтрифосфат deoxyadenosine), 60 мкл dTTP 100 мм (deoxythymidine трифосфат), 60 мкл (дЦТФ 100 мм Дезоксицитидин трифосфат), 300 мкл 1 м DTT (Дитиотреитол), 1,5 г, ПЭГ-8000 (полиэтиленгликоля), 300 мкл 100 мм NAD (никотинамид аденин динуклеотид) и добавьте H2O для получения 6 мл 5 × изотермической реакция буфера.
      Примечание: Aliquoted буфер может храниться при температуре-20 ° C по меньшей мере 12 месяцев.
    2. Для Ассамблеи мастер Гибсон смешать, объединить 320 мкл 5 x изотермической реакция буфера с 697 мкл H2O и добавить 3 мкл 10 U/мкл T5 при exonuclease, 20 мкл 2 U/мкл ДНК-полимеразы и 160 мкл 40 Лигаза дна Taq U/мкл.
      Примечание: Эта смесь может быть aliquoted и хранятся при температуре-20 ° C по меньшей мере 12 месяцев.
  2. Используйте 7,5 мкл Ассамблея мастер смеси с 2,5 мкл вставки и вектора. 2 x STAgR реакции используют Молярная вектор для вставки соотношение 1:1, но не более 0,2 пмоль ДНК в общей сложности. Для более чем 2 gRNA выражение кассеты использовать вектор для вставки соотношение 1:3, но не превышать сумму ДНК 0.5 пмоль.
    Примечание: Все усиливается gRNA выражение кассеты должны использоваться в эквимолярных количествах. Включите элемент управления плазмида с идентичным количество вектор, но не вставки в элемент управления для векторных непереваренных шаблон (или самолигирование).
  3. Проинкубируйте образцы при 50 ° C для образцов Store 45-60 минут на льду или в-20 ° C для последующего преобразования.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
  4. Напрямую преобразуйте половину смеси в химически компетентным бактерий.
    1. Оттепель химически компетентным TOP10 E. кишечной бактерии на льду.
    2. Добавьте 5 мкл Гибсон смеси 50 мкл компетентных бактерий. Осторожно Смешайте, стряхивая в нижней части трубки. Инкубируйте на льду за 30 мин.
    3. Выполните теплового шока, поставив трубку в ванну воды 42 ° C или блока тепла для 45 s.
    4. Вернуть трубы на льду. 250 мкл SOC среды на бактерии и пусть они восстановить при 37 ° C в тряску инкубатор для 30-45 мин.
  5. После восстановления, тарелка преобразованные бактерий на 1,5% lysogeny бульон (LB) агар пластин содержащий ампициллина (100 мкг / мл) и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.

5. Выбор STAgR клоны, бактериальные колонии PCR

  1. Подготовьте по крайней мере два комплекта трубок реакции PCR 200 мкл (между 3 и 24) для каждой конструкции, которые помечены одинаково.
  2. Заполнить один набор с 100 мкл LB носитель содержит 100 мкг / мл ампициллина.
  3. Используйте стерильные пипетки оконечности скретч биологический материал одной бактериальные колонии и распространение его в нижней части трубки реакции PCR пустой 100 мкл. Немедленно передать кончик второй соответствующей реакции трубка, содержащая средство фунтов.
  4. Вихревой мягко кончик вокруг обеспечить некоторые бактерии передаются LB СМИ и инкубировать при 37 ° C для последующего использования.
  5. Настройка мастер смесь ПЦР (10 мкл в реакции).
    1. 10 реакций объединить 10 мкл буфера Taq , 2 мкл 10 мм дНТФ, 0.5 мкл 0.5 мкл Taq -полимеразы праймера (100 мкм) и добавление H2O тома 100 µL.
    2. Используйте следующие грунты: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
  6. Добавьте 10 мкл мастер смеси ПЦР помечены трубы реакции PCR без LB СМИ.
  7. Инкубировать реакции на Термоциклер с использованием следующих условий: 1 цикл 94 ° C за 5 мин, 38 циклы 94 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин; 1 цикл 72 ° C для 10 мин.
    Примечание: Удлинение времени (72 ° C шаг) должно быть увеличено с количество gRNA выражение кассет. Расчет теоретического размера вставок, используя таблицу 2 и использовать 1 мин на 1 КБ на 72 ° C.
  8. Добавить краситель загрузки и анализировать усиливается фрагментов на геле агарозы 1%. Загрузить соответствующий трап дна для калибровки (1 КБ лестница ДНК) и запустить в соответствующие гель работает буфера (например, TLE буфер) на 120 V за 30 мин.
  9. Вычислить теоретический размер amplicon с помощью таблицы 2 путем сложения отдельных размеров используемых промоутеров, gRNA подмостей и количество последовательностей N20. Из результатов колонии PCR выявления бактериальных клоны, на основе размера правильной группы и того, являются ли они склонны гавани правильные векторов.
  10. Прививать культуру ночь LB 2,5 мл (с 100 мкг/мл ампициллин) с соответствующей культурой 100 мкл, созданный ранее. Инкубируйте при 37 ° C в течение 12 ч.
  11. Извлечь плазмида ДНК с помощью мини-набор коммерческих плазмиды и инструкции изготовителя31.
  12. Последовательность плазмид, с использованием следующих грунтовок: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) и StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG), Сэнгер виртуализации.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколом на руки делает поколения векторов заказной мультиплексирования gRNA осуществимо (рис. 1). Представитель результаты STAgR подходы с использованием шести различных gRNA кассеты изображены на рисунке 2. Рисунок 2 A показывает типичный результат PCRs, используемый для получения STAgR штук (протокол 3.1-3.3). Шесть ампликонов (BB, S1-S5) представляют собой линейные штук ДНК, содержащие отдельные gRNA N20 последовательности на их концах. Плазмиды позвоночника (BB) теперь расширена с определения последовательности gRNA1 и gRNA6 и поэтому обладает требуется дублирование для двух других ДЗП (S1 и S5) для Ассамблеи Гибсон (рис. 2А, Таблица 3). После очистки ДНК доходность по крайней мере 1 мкг для векторов и вставки может быть достигнуто.

После сборки Гибсон бактериальных преобразование должно привести к 100 до 700 бактериальных колоний. Рисунок 2 B показывает представителем анализ 10 бактериальных колоний через колонии PCR, после STAgR протокол с шестью gRNA кассеты. Электрофорез геля указывает, что три клонов показывает размер ожидаемого ампликон для полной сборки (Таблица 2). Другие клоны вероятно получил STAgR векторов, содержащий один к пяти gRNA кассеты, тогда как один клон (рис. 2B, No.18) является пустым.

figure-results-1
Рисунок 1 : Обзор конструкции праймера STAgR. Первый номер gRNA и подмостей являются выбрал, а затем gRNA порядок и промоутер и последний, должен использоваться тип вектора. Для каждого gRNA предназначен конкретных вперед грунт с gRNA ориентации последовательности в смысле ориентация и общей частью «СКФ FP» или «sam-FP». Аналогичным образом для создания индивидуальных обратный грунтовка соответствующей последовательности промоутер (RP) сливается с обратной дополнением N20 последовательность следующего gRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 : Представитель результаты STAgR подходы с использованием шести различных gRNA кассет. (A) представитель пример ПЦР пяти вставок, а также вектор STAgR_Tomato. (B) колонии PCR 6 x STAgR реакции с использованием hU6 и mU6 промоутеров и канонические gRNA, а Сэм подмостей. были проанализированы 22 бактериальных колоний, из которых 7 показан ожидаемый группа указанием полной сборки. Лестница: 1 КБ плюс, числа пар оснований (ВР). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Форвард грунтовка для строки и вектор
scaffold_fwdGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT
SAM_fwdGTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG
Обратный грунтовка для строки и вектор
hU6_revCGGTGTTTCGTCCTTT
mU6_revCAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG
hH1_revCTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA
h7SK_revCCGAGGTACCCAAGCGG

Таблица 1: Грунтовка последовательности для gRNA подмостей и промоутеров.

Размеры промоутеров и подмости.
hU6265 bp
Нн1225 bp
mU6316 bp
h7SK245 bp
gRNA эшафот83 bp
SAMloop + gRNA эшафот143 bp

Таблица 2: Теоретические размеры кассеты каждого выражения для вычисления результатов колонии PCR.

hU6Нн1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA СКФ400 bp360 bp451 bp380 bp3722 bp4487 bp
СЭМ460 bp420 bp511 bp440 bp--

Таблица 3: Размеры промоутеров и подмости.

hU6Нн1mU6h7SKSTAgR_NeoSTAgR_tdTomato
gRNA СКФ368 bp328 bp419 bp348 bp+ 74 bp+ 67 bp
СЭМ428 bp388 bp479 bp408 bp

Таблица 4: Вычисляемые размеры кусков STAgR после ПЦР.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем подробный протокол для STAgR позволяет быстро и просто поколения gRNA выражение плазмид различных размеров. Этот протокол может использоваться для поколения Одношаговая gRNA плазмид с 2-8 gRNA выражение кассеты (с или без двух аптамеры MS2 РНК) в gRNA выражение вектор STAgR_Neo и использование человеческого U6, мыши U6, человеческого 7sK и человека H1 промоутеров28 ,32,33. Если более чем четыре кассеты, рекомендуется использовать по крайней мере два различных промоутера/леска типов для повышения эффективности. Другие векторные, промоутеров и промоутер комбинаций, а также более чем 8 gRNA кассет возможно также; Однако это не тестировалась. Хотя наш опыт метод работает надежно и можно воспроизвести, мы определили важнейшие шаги и стратегии устранения неполадок следует ожидаемый результат не сразу возникают. В нашем опыте некоторые шаги являются ключевыми для успешного подхода: во-первых, важно использовать правильную Молярная соотношения вставок к магистрали вектор на шаг Ассамблеи Гибсон (3:1). Однако мы заметили, что для некоторых наборов gRNA соотношении 1:1 вставок в векторный выгодно, даже когда gRNA кассету более двух. Во-вторых, должен быть достаточно продолжительным период реакции Ассамблеи Гибсон (по крайней мере 45 минут рекомендуется).

STAgR могут быть использованы с большое количество модификаций. Ориентация последовательностей, gRNA чисел и подмости, промоутеров и вектор магистралей могут быть настроены и свободно комбинировать. Однако каждая комбинация может иметь немного разные требования. По нашему опыту, если средний или высокий число gRNA кассеты (> 4) желаемого, но не получили сразу, обычно самый быстрый способ для преодоления этой проблемы является чтобы изменить порядок отдельных gRNA кассет в векторе. Аналогичным образом, сочетая различные gRNA промоутеров и подмости повышает эффективность (и таким образом снижает требуемое количество PCRs колонии, которые должны быть забил) когда клонируются Многие gRNA кассеты. Мы обнаружили, что неправильный клоны обычно создаются спонтанное совместно повторяющихся последовательностей при Гибсон Ассамблеи. Хотя это может снизить эффективность метода, это также приводит к одновременной поколения векторов с функциональной gRNA подмножеств28.

Поколение мультиплексирования gRNA векторов, содержащих более одной кассеты выражение gRNA поступили с целого ряда различных методов21,,2223,24,25, 26,27. В то время как некоторые используют одновременное или последовательное клонирование gRNA пар22,34, другие зависят от Ассамблеи Золотые ворота и несколько последовательных клонирования шаги25,35. Xie et al., применяя эндогенного сотовой системы обработки tRNA сократить несколько оформления из одного прародителя Стенограмма36использовалось особый подход. Advangetage этого метода является требование только один промоутер; недостатком является необходимость заново синтезированные фрагментов ДНК для каждой комбинации gRNA. Каждый gRNA мультиплексирования метод имеет преимущества и недостатки; STAgR сочетает в себе простоту и эффективность, высокое количество возможных gRNA кассет с низкой стоимостью.

STAgR (и другие системы мультиплексирования) скорее всего будет важную роль в обеспечении эффективной (и одновременно) нарушение нескольких генов в естественных условиях, как впервые в zebrafish мозги28. Другое будущее применение gRNA мультиплексирования векторов является обещанием для манипуляции полных транскрипционный анализ программ в отличие от индукционного или подавление единичных генов. Вероятно эти подходы позволят трансформации клеток и органов в будет в гораздо большей степени, чем это возможно сегодня.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Стефана Бек и профессор доктор Йовица Нинкович за их вклад, помощь и поддержку в разработке метода STAgR. Тобиас Klötzer, Анна Köferle и Валентин Бауманн за полезные замечания. Работа была поддержана DFG (STR 1385/1-1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Высокоточная ДНК-полимераза PhusionNEBM0530LПолимераза для Gibson Master Mix, а также для всех ПЦР
dNTPs LifeTechnologyR0191dNTPs для всех ПЦР
dATPLife TechnologyR0141dNTPs для Gibson Master Mix
dCTPLife TechnologyR0151dNTPs для Gibson Master Mix
dGTPLife TechnologyR0161dNTPs для Gibson Master Mix
dTTPLife TechnologyR0171dNTPs для Gibson Master Mix
AgaroseVWR443666A
dpnINEBR0176S
AMPure XPBeads Beckman CoulterA63881для очистки ДНК
Tris HCLRoth9090.2для Gibson Master Mix
DTTLife TechnologyR0861для Gibson Master Mix PEG
8000VWRRC-077для Gibson Master Mix
NADCayman Chemicals Company16077для Gibson Master Mix
T5 ExonucleaseNEBM0363Sдля Gibson Master Mix
Taq DNA LigaseNEBM0208Sдля Gibson Master Mix
AmpicilinSigmaAldrichPHR1393-1G
DNA Ladder 1 kb PlusThermo ScientificSM0311
Plasmid Mini KitThermo ScientificK0503
Последовательности плазмид и праймеровВсе последовательности доступны на Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).
EDTAPanReacAppliChem6381-92-6для TLE Buffer
MgCl2SigmaAldrichM8266для Gibson Master
Mix Top10 химически компетентных бактерийThermo ScientificC404003
S.O.C. MediumThermo Scientific15544034
дрожжевой экстрактSigmaAldrichY1625для лизогенный бульон (LB Media)
NaClSigmaAldrichS7653для лизогенного бульона (LB Media)
PeptoneSigmaAldrich91249для лизогенного бульона (LB Media)
Агар-АгарSigmaAldrich5040для лизогенного бульона (LB Media)
Taq DNA PolymeraseQuiagen201203

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barrangou, R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 16, 247(2015).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).
  5. Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering. Genome Med. 7 (1), 59(2015).
  6. Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. From profiles to function in epigenomics. Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  9. Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology. BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).
  10. Jiang, J., et al. Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 6, 21918(2016).
  11. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  12. Wang, L., et al. Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos. Scientific Reports. 5, 17517(2015).
  13. Zhang, L., et al. Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9. PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).
  14. Shen, B., et al. Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects. Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).
  15. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  16. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  17. Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
  18. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  19. Bultmann, S., Stricker, S. H. Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics. Open Biology. 8 (3), (2018).
  20. Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators. FEBS Journal. , (2016).
  21. Maddalo, D., et al. In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).
  22. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  23. Wrighton, K. H., et al. Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes. Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).
  24. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  25. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).
  26. Cress, B. F., et al. CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).
  27. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  28. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).
  29. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, (2007).
  30. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  31. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).
  32. Koferle, A., et al. CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening. BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).
  33. Koferle, A., Stricker, S. H. A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source. Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).
  34. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  35. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4, 5400(2014).
  36. Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

String Assembly gRNA CloningMultiplex gRNA ExpressionGibson AssemblyCRISPR Cas9 SystemGuide RNA CloningDNA Template ReuseOverhang PrimersColony PCRPlasmid TransformationAgarose Gel Electrophoresis

Related Articles