Методическая статья

4D Микроскопия дрожжей

DOI:

10.3791/58618

⸱

28 апреля 2019 г.

 , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает анализ флуоресцентно помеченных внутриклеточных отсеков в подающих надежды дрожжей с помощью многоцветной 4D (промежуток времени 3D) конфокальной микроскопии. Параметры изображения выбираются для захвата адекватных сигналов, ограничивая при этом фотоповреждения. Пользовательские плагины ImageJ позволяют отслеживать и количественно анализировать помеченные структуры.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель юристого протокола – охарактеризовать, как формируются и трансформируются в живые клетки подающих надежды дрожжей. Многие внутриклеточные отсеки в дрожжах динамичны, и полное понимание их свойств требует замедленной визуализации. Многоцветная 4D конфокальная флуоресценционная микроскопия является мощным методом отслеживания поведения и состава внутриклеточного отсека в временной шкале 5-15 мин. Строгий анализ динамики отсека требует захвата тысяч оптических Разделы. Для достижения этой цели фотоотбеление и фототоксичность сводятся к минимуму путем быстрого сканирования при очень низкой мощности лазера, а размеры пикселей и интервалы в шагах устанавливаются на самые большие значения, совместимые с выборкой изображения при полном разрешении. Полученные 4D наборы данных шумные, но могут быть сглажены путем деконволюции. Даже при высоком качестве данных, этап анализа является сложной задачей, поскольку внутриклеточные структуры часто многочисленны, неоднородны и мобильны. Для удовлетворения этой потребности, пользовательские плагины ImageJ были написаны для массива 4D данных на экране компьютера, определить структуры, представляющие интерес, отсеивать данные, чтобы изолировать отдельные структуры, количественно флуоресценции время курсы, и делать фильмы из прогнозируемых стеков. 4D-фильмы особенно полезны для различения стабильных отсеков от переходных отсеков, которые переворачиваются при созревании. Такие фильмы также могут быть использованы для характеристики таких событий, как слияние отсеков, и для проверки влияния конкретных мутаций или других возмущений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сравнения эндомембранной системы находятся в постоянном движении, и их полная характеристика требует визуализации живых клеток. Описано здесь протокол, который использует 4D (замедленное 3D) конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентно помечены отсеков в подающих надежды дрожжей. Метод был разработан для отслеживания динамики секретных отсеков в Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Этот протокол фокусируется на S. cerevisiae, который имеет нестоечный Golgi, вкотором отдельные цистерны оптически разрешимы4 . Необычная организация Golgi в S. cerevisiae позволила демонстрацию 4D микроскопией что цистерна Golgi первоначально маркирует с протеинами резидента предыдущих протеинов Golgi, и после этого теряет те протеины пока приобретающ резидента последние протеины Golgi3 ,5. Этот переход можно визуализировать, создавая штамм, в котором ранний белок Golgi Vrg4 помечен GFP, в то время как поздний белок Golgi Sec7 помечен мономерным красным флуоресцентным белком. Когда отдельные цистерны отслеживаются, созревание наблюдается как зелено-красное преобразование3. Этот тип анализа может предоставить ценную информацию о локализации белка и идентичности отсека. Например, два белка с слегка смещенным временем прибытия и отъезда иногда могут показаться, что они маркируют разные отсеки в статических изображениях, но их можно увидеть в 4D-фильмах, чтобы обозначить один и тот же отсек в разных временных точках6,7 . Таким образом, 4D микроскопия выявляет явления, которые в противном случае не были бы очевидны.

Информационная 4D микроскопия дрожжевых отсеков может быть достигнута с помощью соответствующих процедур и оборудования2. Когда это возможно, флуоресцентные пометки белка выполняется замена гена8, чтобы избежать переэкспрессии артефактов. Поскольку внутриклеточные структуры часто очень динамичны, 4D-изображение необходимо для обеспечения надежной обработки структуры с течением времени. В описанном здесь протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный детекторами высокой чувствительности. С помощью этого устройства, весь объем клеток S. cerevisiae может быть изображен конфокальной микроскопии примерно каждые 1-3 с, с 2 с интервалами является типичным. Данные могут быть собраны на срок до 5-15 мин в зависимости от плотности маркировки фторофоров и их фотофизических свойств. Основным препятствием является минимизация фотоотбелевания. Для этого интенсивность лазера сохраняется как можно ниже, скорость конфокального сканирования максимизируется, а оптические параметры настроены на изображение на пределе Nyquist, чтобы захватить соответствующую информацию, избегая при этом чрезмерного воздействия света. Эти настройки, как ожидается, также облегчить фототоксичность, фактор, который часто упускается из виду во время изображения живых клеток9,10,11. Полученные шумные данные обрабатываются с помощью алгоритмов коррекции отбеливателя и деконволюции для облегчения количественной оценки интенсивности флуоресценции.

Даже с высоким качеством 4D фильмов, анализ сложно, потому что дрожжевые отсеки, как правило, многочисленные, неоднородные, и мобильные. Из-за внутренних ограничений конфокальной микроскопии и неоптимальных настроек, необходимых для длительной 4D-визуализации, флуоресцентные структуры, которые находятся рядом друг с другом, трудно решить. Эту проблему можно обойти, сосредоточив внимание на небольшом количестве флуоресцентных структур, которые остаются оптически разрешимыми в течение периода маркировки, с предположением, что эти структуры являются репрезентативными для всей популяции маркированных Отделения. Флуоресцентные отсеки, которые можно надежно отслеживать, идентифицируются путем просмотра фильмов о проецируемом стеках и создания серии монтажей, в которых оптические секции для каждой временной точки выстраиваются на экране компьютера. В этом анализе используются пользовательские плагины ImageJ12, которые позволяют отслеживать индивидуальную структуру в изоляции.

Последние методы работы охватывает использование флуоресцентных белков в дрожжах13, а также теории и практики 4D конфокальной визуализации дрожжевых клеток2. Этот протокол фокусируется на ключевых практических аспектах эксперимента по визуализации 4D. Она включает в себя некоторые усовершенствования ранее описанных процедур, а также обновленные версии плагина ImageJ и документации. Показанный пример фокусируется на динамике Golgi, но этот протокол в равной степени подходит для визуализации других дрожжевых отсеков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка

  1. Сделать нефлуоресцентный минимальный NSD средний2. Отсутствие рибофлавина, как ожидается, приведет к снижению фоновой внутриклеточной зеленой флуоресценции и связанной с ней фототоксичности.
  2. Выращивайте дрожжи на ночь при 23 градусах по Цельсию до логарифмической фазы в 5 мл NSD в 50 мл озадачиваемой колбы с хорошей аэрацией. Около 3-4 ч до анализа, разбавить дрожжевой культуры в свежем NSD так, что окончательный OD600 будет 0,5-0,8 на момент изображения.
  3. Подготовка 2 мг/мл раствор конкановалина А (ConA). При желании заморозьте аликвоты этого раствора в жидком азоте и храните при -80 градусов по Цельсию.
  4. Спин ConA решение в течение 5 минут на полной скорости в микроцентрифуге, чтобы удалить твердые частицы, которые могут помешать визуализации. Затем добавьте 250 л супернатанта в чистую 35-мм покрывало нижней микроскопии. После 15 мин, мыть 2-3 раза с 2 мл dH2O и дайте высохнуть.
  5. Добавьте 250 кл культуры дрожжей к блюду с покрытием ConA, подождите 10 минут, чтобы позволить клеткам придерживаться, и аккуратно промыть 2-3 раза с 2 мл NSD. Обложка клетки с 2 мл свежих NSD.

2. Визуализация

  1. Используйте 63x или 100x масляный объектив погружения. Числовой диафрагмы (NA) 1,40 достаточно, но более высокий объектив NA также может быть использован.
  2. Формат размер кадра до 256 х 128 (ширина х высота). Если требуется больший размер кадра, увеличение ширины не уменьшит скорость сканирования до тех пор, пока конфокальный микроскоп оснащен резонансным сканером.
  3. Отрегулируйте коэффициент масштабирования, чтобы размер пикселя — 80 нм.
  4. Используйте максимальную скорость сканирования, которая обычно составляет порядка 8 кГц. Включите двунаправленное x сканирование, если оно доступно, и если контрольные эксперименты подтверждают, что сканирование с двух направлений находится в регистре.
  5. Установите накопление линии до 4 или 6. Не забудьте использовать накопление (суммирование) вместо усреднения.
  6. Установите пинхол до 1,2 Airy единиц. Эмпирически, при визуализации живых дрожжевых клеток, эта настройка захватывает больше фотонов, чем стандартный выбор 1.0 Airy единицы, не вызывая заметной потери разрешения.
  7. Для каждого канала флуоресценции установите длину волн возбуждения, назначайте детектор высокой чувствительности, установите диапазон длины эмиссии и включите режим подсчета фотонов, если это возможно. Выбор длины волны будет зависеть от фторфоров. В качестве примера, возбуждают флуоресценцию GFP при 485 нм и собирают от 495-550 нм, и возбуждают мскарм флуоресценцию при 555 нм и собирают с 562-625 нм.
  8. Установите интенсивность каждого лазера, чтобы быть как можно ниже. Эта настройка должна быть определена эмпирически. Соответствующая интенсивность приведет к захвату шумной, но интерпретируемой последовательности изображений, с отбеливанием сигнала флуоресценции не более чем на 50% к концу 5-минутного фильма. На конфокальном микроскопе, используемом здесь (см. ТаблицаМатериалов), эта интенсивность соответствует лазерной настройке мощности порядка 5%.
  9. Используйте фильтры выемки или время gating, чтобы избежать захвата отраженного света от coverslip. Если доступно время gating, установите окно gating до 0.6-10.0 ns.
  10. Включите яркое поле изображения и использовать детектор низкой чувствительности для сбора данных. Установите прибыль до уровня, который делает ячейки хорошо видны. Не используйте дифференциальный интерференционный контраст (DIC), поскольку призма будет мешать захвату надежных данных флуоресценции.
  11. Установите интервал с шагом до 0,25-0,35 мкм. Изображение всего объема дрожжевых клеток, собирая около 20-25 оптических секций на стек. Укажите направленность изображения таким образом, что "вниз" движется к coverslip.
  12. Для типичного фильма установите временной интервал между стеками до 2 с и установите продолжительность фильма до 5-10 мин. В зависимости от исследуемого отсека, уменьшите интервал, чтобы сделать более короткие фильмы относительно быстрой динамики, или увеличьте интервал, чтобы сделать более длинные фильмы относительно медленной динамики.
  13. Сохранить фильм в виде файла LIF с яркими изображениями поля на последнем канале. На данном этапе более высокие глубины бита не нужны, и конвейер обработки настроен на прием 8-битных данных TIFF.

3. Деконволюция

  1. Запуск деконволюционного программного обеспечения (см. Таблицаматериалов), используя алгоритм оценки классической максимальной вероятности.
  2. Откройте набор данных, созданный в шаге 2.13. Выберите "Деконволюция мастера". Проинспектировать значения, отображаемые в "Параметр мастер". Параметры изображения должны быть обнаружены и правильно отображены. В соответствии с "Рефракционными индексами" измените значение "Embedding med" на 1,40, чтобы приблизить дрожжевой цитоплазмы. Под "coverslip", выберите "Запуск редактор" и "Оценка позиции" и "OK", чтобы установить позицию coverslip. Выберите "Установить все проверенные" и "Принять".
  3. Пройдите через "Деконволюция мастера" для каждого канала флуоресценции. Выберите "Руководство" в качестве режима для фоновой оценки. Осмотрите профиль интенсивности флуоресценции необработанных данных, чтобы определить оценочное фоновое значение, которое обычно составляет около 0,1.
  4. В меню установки деконволюции введите значение "Максимальные итерации" 40 и выключите коррекцию отбеливателя. Введите оценочное значение SNR, которое обычно составляет около 5,0. Нажмите кнопку "Деконволв".
  5. При необходимости вернитесь к исходной файлу данных, отрегулируйте фон и значения SNR и повторите деконволюцию до тех пор, пока шум не будет достаточно удален, не исключив подлинную флуоресценцию из тусклых структур.
  6. Слияние ярко-поляных и деконволвных каналов флуоресценции. Для последующих шагов по редактированию фильмов в ImageJ, организовать каналы таким образом, что красный является первым, зеленый (если присутствует) является следующим, синий (если присутствует) является следующим, и яркое поле является последним. Сохранить последовательность изображений в виде 8-битного файла TIFF.

4. Отбеливатель коррекции и кино поколения

  1. Импорт deconvolved последовательности изображений в ImageJ и преобразовать его в гиперстек, выбрав изображение Выберите "xyzct" из выпадающего меню и заполните количество каналов, срезсов и временных рамок (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Выберите изображение
  3. Исправьте каналы флуоресценции для фотоотбеления с помощью плагина ImageJ, доступного из http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. После того, как плагин был загружен и установлен, выберите Плагины Выберите "Экспоненциальный Fit".
  4. Чтобы объединить яркое поле и отбеливатель исправлены каналы флуоресценции в гиперстек, выбрать изображение Сохранить полученный гиперстек в виде 8-битного файла TIFF.
  5. Установите пользовательские плагины ImageJ, предоставленные с этим протоколом. Следуйте инструкциям в сопроводительном документе для просмотра, отработки и количественной оценки последовательности изображений, а также для создания заключительного фильма о проецируемом стеках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приведенный здесь пример документов и количественно созревания двух дрожжей Golgi цистерны, как визуализированы двойной цвет 4D конфокальной микроскопии3. Дрожжевой клетки содержит на заказ 10-15 Golgi cisternae, каждый из которых созревает в течение времени курс примерно 2-4 мин. Созревание может быть визуализировано путем пометки раннего Golgi маркер Vrg4 с GFP и пометки конце Golgi маркер Sec7 с красным флуоресцентным белок, такой как mCherry или mScarlet. Индив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

4D конфокальная визуализация дрожжевых органелл требует тщательной настройки нескольких параметров. Основной проблемой является фотоотбеление и фототоксичность. Типичный 4D фильм включает в себя сбор тысяч оптических секций, так что лазерное освещение должно быть как можно ниже. Тандем флуоресцентные теги белка могут быть использованы для повышения сигнала без увеличения экспрессии помечены белка16,17. Максимальное увеличение скорости сканирования помогает ограни...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM104010. Спасибо за помощь с флуоресценцией микроскопии Витас Bindokas и Кристин Лабно на комплексной микроскопии Основной фонд, который поддерживается NIH финансируемых онкологический центр Поддержка Грант P30 CA014599.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Посуда со стеклянным дном 35 мм No1.5MatTekP35G-0.170-14-CПосуда для визуализации
Concanavalin A порошокSigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Leica SP8 конфокальный микроскопLeica Microsystems
Leica Application Suite X Программное обеспечение для микроскопаLeica Microsystems
Huygens Essential программное обеспечение Huygens Essential, версия 17.04Программное обеспечение для деконволюциинаучных объемных изображений
ImageJNIHПрограммное обеспечение для обработки и анализа изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232(2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787(2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

4DImageJZ

Похожие статьи