Методическая статья

Создание двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG для ВИЧ-ассоциированного патогенеза печени

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58645

⸱

11 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает надежный метод для создания гуманизированных мышей с иммунной системой человека и клетками печени. Двойной восстановленный иммунодефицитных мышей, достигнутых с помощью интраспелинической инъекции человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых клеток восприимчивы к вирусу иммунодефицита человека-1 инфекции и повторение повреждения печени, как наблюдается в ВИЧ-инфицированных пациентов.

Аннотация

Несмотря на увеличение продолжительности жизни пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), заболевание печени стало распространенной причиной их заболеваемости. Иммунопатология печени, вызванная ВИЧ-1, остается неуловимой. Малые модели животных ксенотрансплантата с гепатоцитами человека и иммунной системой человека могут резюмировать биологию человека патогенеза болезни. При этом описывается протокол для создания двойной гуманизированной модели мыши с помощью человеческих гепатоцитов и CD34 гематопоиетических стволовых /клеток-прародителей (HSPCs) трансплантации, для изучения иммунопатологии печени, как наблюдается у ВИЧ-инфицированных пациентов. Для достижения двойной реконституции, мужчины ТЗ-НОГ (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) мышей интраперитоно вводят с ганциклозир (GCV) дозы для устранения мыши трансгенных клеток печени, и с treosulfan для немиелоаблятивного кондиционирования, оба из которых из которых оба из которых облегчить гепатоциты человека (HEP) прививок и иммунной системы человека (HIS) развития. Уровень альбумина человека (ALB) оценивается для прививок печени, а наличие иммунных клеток человека в крови, обнаруженных цитометрией потока, подтверждает установление иммунной системы человека. Модель, разработанная с использованием описанного здесь протокола, напоминает несколько компонентов повреждения печени от ВИЧ-1. Его создание может оказаться необходимым для исследований совместной инфекции вируса гепатита и для оценки противовирусных и антиретровирусных препаратов.

Введение

С момента появления антиретровирусной терапии произошло значительное снижение смертности от моноинфекции ВИЧ-1. Тем не менее, заболевания печени стала распространенной причиной заболеваемости у ВИЧ-инфицированных пациентов1,2. Инфекции вирусов гепатита с ВИЧ-1 встречаются чаще, на долю 10% - 30% ВИЧ-инфицированных в США3,4,5.

Специфика вирусов ВИЧ-1 и гепатита ограничивает полезность малых моделей животных для изучения специфических инфекционных заболеваний человека или для изучения многочисленных аспектов патогенеза печени, связанного с ВИЧ-1. Иммунодефицитные мыши, которые позволяют прививать человеческие клетки и / или ткани (так называют гуманизированных моделей мыши) являются приемлемыми животными модели для доклинических исследований6,7,8. С момента появления гуманизированных мышей в начале 2000-х годов, многочисленные доклинические исследования токсичности холестатической печени человека, специфических для человека патогенов, включая ВИЧ-1 и ВИЧ-ассоциированные нейрокогнитивные расстройства, вирус Эпштейна Барра, гепатит и другие инфекционных заболеваний, были исследованы в этих мышей6,9,10,11. Несколько моделей мыши для CD34и HSPCs и / или трансплантации гепатоцитов человека уже давно разработаны и улучшились с течением времени для изучения болезни патогенеза вируса гепатита В (HBV)-связанных заболеваний печени12, 13 Год , 14. Несколько моделей для трансплантации гепатоцитов и человека (HEP) основаны на штаммах, известных как NOG (NOD). CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- кк-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, и fah-/- NOD rag1-/- il2r null мышь16. Однако каждая модель имеет свои преимущества и ограничения; например, AFC8 двойных гуманизированных мышей для HEPs и стволовых клеток человека (HSCs) на Balb/C-Rag2-/- Кк-/- фон позволяет успешно привить иммунных клеток и HSCs, но есть отсутствие антигена конкретных Т- и В-клеток ответ в этой модели12. Основные проблемы в восстановлении двойной гуманизированных мышей включают субоптимальный прививок, отсутствие подходящих моделей для поддержки различных тканей, несовпадающие условия, иммунный отторженный, или трансплантат -по сравнениюс -хост болезни (GVHD), и технические трудности, такие как рискованные манипуляции с новорожденными и высокие показатели смертности из-за метаболических нарушений13.

Хотя гуманизированные мыши были использованы для исследования ВИЧ в течение многих лет17,18,19, использование гуманизированных мышей для изучения повреждения печени, вызванные ВИЧ-1 была ограничена20. Ранее мы сообщали о создании двойной гуманизированной модели мыши TK-NOG и ее применении при ВИЧ-ассоциированном заболевании печени8. Эта модель показывает надежное прививочение печени и иммунных клеток и резюмирует патогенез ВИЧ-инфекции. В ходе этой дискуссии представлен подробный протокол, включав в себя наиболее важные шаги в области трансплантации гепатоцитов человека. Представлено также описание HSPCs, необходимых для успешного прививки От hePs и создания функциональной иммунной системы у мышей ТК-NOG. Использование этих мышей для изучения ВИЧ-ассоциированного иммунопатогенеза печени подробно. TK-NOG мышей, перевозящих печени конкретных вирус простого герпеса типа 1 тимидин киназы (HSV-TK) трансгениспользуютиспользуются. Клетки печени мыши выражая этот transgene можно легко ablated после краткого подвержения к nontoxic дозе GCV. Пересаженные клетки печени человека устойчиво поддерживаются в печени мыши без экзогенных препаратов21. Мышей также предусловные с nonmyeloablative дозы треосульфана для создания ниши в костном мозге мыши для человеческих клеток8. Иммунодефицитные мыши ТК-НОГ интраспленически вводятся с помощью HePs и многопотентных HSPCs. Затем мышей регулярно контролируют на наличие в крови и печени восстановления с помощью иммунофенотипирования крови и измерений уровня сыворотки человека и альбумина, соответственно. Мыши с успешной реконституцией более 15% как для иммунных клеток человека, так и для HEPs интраперитоно вводят ВИЧ-1. Влияние ВИЧ на печень можно оценить уже через 4 - 5 недель после инфицирования. Важно отметить, что, поскольку ВИЧ-1 используется, все необходимые меры предосторожности должны быть приняты при обработке вируса и инъекционных его на мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Медицинском центре Университета штата Небраска.

ПРИМЕЧАНИЕ: Получить одобрение от местного IACUC перед проведением экспериментов на животных.

1. Обработка пуповинной крови и изоляция Человеческих ГСпК

  1. Выполните все этапы протокола в стерильных условиях в ламинарных шкафах потока.
  2. Возьмите пуповинной крови (CB), собранные в гепаринизализированных труб и сделать объем до 35 мл, добавив фосфат-буферный солен (PBS). Слой образца на верхней части лимфоцитов разделения среды (LSM), как показано на рисунке 1 и центрифуга LSM с слоистых CB на 400 х г в течение 35 минут при 4 КК без тормозов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить кровь тщательно и осторожно, чтобы избежать смешивания на интерфейсе.
  3. Удалите верхний слой LSM и плазмы тщательно и передать белый баффи пальто интерфейс в новую трубку с помощью передачи пипетки.
  4. Отрежь буйный слой в 30 - 40 мл ледяного буфера (PBS - 0,5% бытового сывороточных альбомов (BSA) 2 мМ этиленедиаминететацетическая кислота «ЭДТА»). Используя пипетку, объедините 20 злиц яточной подвески с 20 qL 0,4% трипан синий и пипетка 10 зл и 10 л смеси во внешнее отверстие любой из двух камер подсчета слайда и вставьте слайд в автоматизированный счетчик ячейки для подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ледяной буфер во всех шагах, так как он помогает сохранить жизнеспособные клетки.
  5. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 10 минут при 4 кв и аспирации супернатант тщательно. Затем добавьте 300 л ледяного буфера.
  6. Добавьте 100 зЛ рецепторов человека Fc, блокирующих реагент, и 100 л моноклональных мышей против человеческих антител-конъюгированных микробусов на сумму до 1 х 108 клеток (см. Таблицу Материалов). Инкубировать в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, добавить 10 мл ледяного буфера для мытья клеток и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте это в соответствии с номером ячейки, если более 1 х 108 ячеек присутствуют.
  7. Тщательно удалите супернатант, resuspend гранулы в 500 л буфера, и приступить к магнитному шагу разделения, чтобы обогатить HSPCs.
  8. Поместите положительный отбор LS колонки (см. Таблица материалов) в магнитно-активированной ячейки сортировки поле и передать его через с 3 мл буфера.
  9. Загрузите образец в колонку LS, которая может заманить микробусы, привязанные к человеческому CD34, в образцах и позволить ему течь под воздействием силы тяжести в трубку коллекции.
  10. Вымойте столбец 3x с буфером и соберите elute в той же трубке коллекции CD34- фракция клеток.
  11. Окунитесь в столбец с 5 мл буфера, чтобы удлинить клетки CD34в новую трубку сбора. Повторите процедуру, чтобы достичь чистоты в размере 90%.
  12. Подсчитайте eluted CD34- клетки, используя трипан синий краситель в гемоцитометре. После подсчета, центрифуга CD34и клетки на 300 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
  13. Приостанавливаете действие CD34- клеток в 25 Л PBS для инъекции, которая будет немедленно использована при трансплантации или криоконсервации клеток в концентрации 1-2 млн/мл в замораживании среды (Roswell Park Мемориальный институт среднего (RPMI 1640 средних) сыворотка крупного рогатого скота (FBS) - 10% диметилсульфодоксид (DMSO) для дальнейшего использования в трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда пересчитывайте жизнеспособные клетки перед их использованием при трансплантации.
  14. Чтобы проверить чистоту CD34и элиты, возьмите 50 qL подвески и инкубировать его с 10 Зл PE-конъюгированных анти-человеческих антител CD34 в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия. После инкубации антител, мыть окрашенные клетки с PBS, resuspend их в 100 зл. Добавьте дополнительную трубку клеток без антител для проектирования ворот в цитометрпотока потока.
  15. После приобретения, анализировать данные, выбирая область интереса на переднем рассеянии (FSC) и боковой рассеяния (SSC) участок, а затем gating для одиночных ячеек на FSC-области и FSC-высота участков. Ворота CD34-положительные ячейки на одиночных ячейках в канале PE и участке SSC-области.

2. Подготовка гепатоцитов человека для трансплантации

  1. Удалить криоконсервированные гепатоциты из жидкого азота, быстро погрузить флакон в водяную баню и оттаивать примерно 90 - 120 с.
  2. Снимите крышку флакона и залейте оттаяваемые гепатоциты в коническую трубку 50 мл теплой оттаивательной среды.
  3. Приостановить клетки, качая 50 мл трубки вручную в течение нескольких секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вихрь трубки.
  4. Пеллет клетки при температуре 100 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Вымойте гранулированные клетки в PBS с 0,1% BSA и объединить их с свежими или оттаять HSPCs (коэффициент 10:1) в PBS в окончательном объеме 80 Л / мышь.

3. Обработка животных, скрининг, генотипирование и лечение hSPC человека и трансплантации гепатоцитов

  1. Обработка животных
    1. В результате тяжелого иммунодефицита, породы, дома, и обрабатывать TK-NOG мышей в асептических условиях.
    2. Всегда носите лабораторное пальто, перчатки, бахилы и маску для лица, чтобы предотвратить заражение потенциально патогенными микроорганизмами.
    3. Используйте стерильные перчатки и инструменты для хирургии и обрабатывать животных асептически на протяжении всей операции.
  2. Выбор мышей ТК-НОГ для эксперимента
    1. Поддерживайте колонию штамма ТК-NOG путем разведения самок мышей ТК-НОГ с мужскими пометами, не являющихся ТЗ-NOG, и отбирайте трансгенное потомство генотипированием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните генотипирование (см. шаг 3.3), чтобы определить наличие или отсутствие трансгена у новорожденных мышей мужского и женского пола во время отлятки.
    2. Выберите мужчин в возрасте от 6 до 8 недель для трансплантации из-за их высокой чувствительности к GCV-опосредованного истощения HSV-TK трансген-выражения гепатоцитов21.
    3. Ухо-тег мышей во время отлужели или хирургии, чтобы облегчить идентификацию. Обратите внимание на вес и состояние здоровья животных.
  3. Генотипирование для присутствия трансгена HSV-TK с использованием количественной реакции полимеразы в реальном времени
    1. Выполните генотипирование во время отлужели (обычно в возрасте от 3 до 4 недель). Для генотипирования, вырезать кусок мыши ухо в ламинарный поток биологической безопасности кабинета для поддержания бесплодия и экстракт геномной ДНК с помощью геномного комплекта изоляции ДНК.
    2. Усиливать геномную ДНК, извлеченную из ушной части в 20-ю реакционную смесь на экран для трансгена HSV-TK под контролем промотора альбумина, добавляя 1 зл и л форварда 5'-CCATGCACCTCTTTATCCTGG-3', 1 Л обратной грунтовой части 5'-TAGTTGCAGGGГГГКККК-3', 0.5 L FAM зонд 5'-FAM-AATCGCCCGGGGCTGC-MGB-3', и 10 зл мастер смеси на в режиме реального времени полимеразы цепной реакции (PCR) инструмент22.
    3. Установите настройки ПЦР в реальном времени следующим образом: 60 градусов по Цельсию на 30 с (предредевая стадия), 95 градусов по Цельсию на 10 мин (удержание), 40 циклов 95 градусов по Цельсию на 15 с и 60 градусов по Цельсию в течение 1 мин (стадия ПЦР) и 60 градусов по Цельсию на 30 с (постред).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цикл порога (Ct) ниже 22 считается положительным для трансгена HSV-TK.
  4. Лечение с использованием ганцикловира и треосульфана
    1. Используя 27 G иглу, вводить TK-NOG мышей с интраперитонеальной Инъекции ГКВ (6 мг/кг) 2x в день на 7 день и в день 5 в 100 Л солей перед операцией, чтобы истощать трансгенные паранхимальные клетки мышей (как показано в экспериментальной стратегии на рисунке 2)23 .
    2. В дни 3, 2 и 1 до операции, предпосылки мышей с немиелоаблятивной интраперитонеальной дозы треосульфан (1,5 г/кг/день) в 100 Л соля, используя 27 G иглы.
    3. За день до операции нарисуйте от двух до трех капель крови из субмандибулярной вены, колоя ее 5-мм ланцетом, и изолировать сыворотку путем центрифуга (1500 х г на 10 мин при температуре 4 градуса Цельсия) для анализа аланина аминотрансферазы (ALT) для оценки дегр ee повреждения печени.
  5. Подготовка к операции
    1. Используйте ножницы для бритья меха мыши, окружающего место разреза (слева от стенки перитонеальной) перед операцией.
    2. Отрегулируйте поток кислорода до 1 л/мин, а изофлуран поток до 3% - 5% в индукционной камере с помощью мышиной анестезии. Поместите одну мышь за один раз в индукционной камере для анестезии.
    3. Прикрепите один конец стерильной удлинительной трубки (с удерживающей емкостью 550 л подвески; см. таблицу материалов для спецификаций) к игле 30 G, а другой конец шприцу 1 мл.
    4. Заполните шприц с подвеской (80 л/мышь) объединенных HEPs и HSPCs (см. раздел 2), приспосабливайте шприц в зазубре повторяющейся распределительной трубе, и отрегулируйте дозатор, чтобы распределить 10 ЗЛ в каждом прессе.
    5. После того, как мыши обезболивают (обычно после 3 - 4 мин), переключите изофлуранный поток на носовой конус и уменьшите скорость изофлуана до 2% - 3%.
  6. Интраспенетическая трансплантация ГСПК и гепатоцитов у мышей
    1. Выполните все этапы операции в ламинарном шкафу в стерильных условиях.
    2. Поместите чистую стерильную драпировку над рабочей поверхностью и скраб левой стороне тела каждой мыши с 10% повидон-йод следуют 70% изопропиловый спирт, прежде чем сделать разрез.
    3. Сделайте небольшой разрез (1 - 1,5 см в длину и 5 мм в глубину) в коже, мышцах и перитенеума слева от стенки перитонеальной стенки с ножницами типа Ванны, чтобы войти в полость перитонеальной полосты примерно на 5 мм ниже нижнего края грудной клетки.
    4. Найдите селезенку, слегка потяните ее щипками в операционную зону для легкого доступа и вставьте иглу 30 G в нижний полюс селезенки.
    5. Разблокируйте поршень от распределительный пипетка и распределите 10 л объема за один раз, с ограничением 60 - 80 л на селезенку. Уречись иглы медленно и клип селезенки с ligating клипы с помощью перевязки applier.
    6. Нажмите селезенки обратно в полости тела с хлопчатобумажными аппликаторами смачивают стерильной PBS.
    7. Закрыть мышечный слой брюшной стенки с помощью усваиваемой швы прерванный шовный рисунок (не непрерывный). Выполните закрытие кожи с прерванным рисунком шва с использованием неабсорбируемых швов.
    8. Используйте теплую воду циркулирующих прокладок для защиты мышей от переохлаждения после операции.
    9. Удалить неабсорбируемые швы через 10-14 дней после операции.
  7. Послеоперационный уход
    1. Когда пересаженные животные просыпаются, вводят обезболивающим бупренорфином (0,1 мг/кг) интраперитонеально, 2 раза в день в течение 3 дней подряд.
    2. Наблюдайте за животными по крайней мере 1 раз в день, пока они не вернутся к нормальным физическим условиям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте вес тела каждого животного, так как некоторые мыши могут похудеть послеоперации. Мыши обычно восстанавливают свой первоначальный вес в течение 1 до 2 недель.

4. Привляние валидации печени человека eLISA и иммунной системы человека с помощью цитометрии потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените восстановление печени человека и иммунной системы ежемесячно, начиная 1 месяц после трансплантации фермент-связанных иммуносорбента анализа (ELISA) и потока цитометрии, соответственно.

  1. Собирайте образцы крови из подчелюстной вены с помощью ланцетов в трубках ЭДТА и центрифуги при 1500 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Изолировать сыворотку для проверки уровня альбумина человека для оценки эффективности прививок печени мыши для пересаженных человеческих гепатоцитов, используя человеческий альбумин ELISA квантитационный набор (см. Таблица материалов) следуя производителя Инструкции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте гранулы и используйте гранулированные клетки для анализа цитометрии потока для оценки восстановления иммунной системы человека.
  2. Приостановите действие клеточной гранулы без сыворотки в 35 qL буфера FACS (PBS 2% FBS) и окрашенных 5 qL мыши конкретных CD45 (концентрация 0,5 мг/мл), 5 qL каждый из человека конкретных антител CD45 (0,1 мг/мл), CD3 (0,2 мг/мл), CD8 (0,1 мг/мл9 , и 20 кЛ CD4 (0,25 мг/мл) и CD14 (0,25 мг/мл) каждый в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию, чтобы проверить развитие функциональной иммунной системы от CD34и HSPCs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность добавления еще одной трубки неокрашенных клеток для определения запятнанных клеток.
  3. После инкубации, передача окрашенных подвески (100 л) в полистирол круглого дна потока цитометрии трубки и использовать 2 мл 1x лисис буфера (см. таблицу материалов) путем разбавления 1 часть 10x лисис буфера с 9 частями дистиллированной воды и инкубации 10 - 15 мин для лиза красных кровяных телец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за мутностью, чтобы оценить лиза красных кровяных телец. Как только образец становится ясным, лисис завершен.
  4. После лисиса добавьте 3 мл буфера FACS в трубку и центрифугу при 300 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут, чтобы получить гранулы. Повторите стирку, добавив 3 мл буфера FACS в гранулы и центрифугу при 300 х г при 4 кв. м в течение 5 мин.
  5. Исправить клетки в свежесделанном 1% параформальдегида (PFA) и приобрести окрашенные клетки на поток цитометра, проанализированы с потоком программного обеспечения.
  6. Для анализа выберите лимфоциты gating на участке FSC/SSC, а затем одноклеточные gating на FSC-области / FSC-высота.
  7. Кроме того, ворота для человека конкретных CD45 (hCD45) на одноклеточной популяции и включают мыши конкретных CD45 (mCD45) для исключения клеток муринового происхождения. Стратегия gating окрашенных населения на основе gating неокрашенных клеток.
  8. Ворота hCD45- клетки для определения частоты CD3и Т-клеток и CD19и В-клеток. Клетки gate T для определения подмножества CD4 и CD8. Для оценки моноцитов, ворота на hCD45 для определения CD14и моноцитов.

5. ВИЧ-инфекция мышей ТЗ-НОГ и ее влияние на печень и иммунную систему человека

  1. Обработка вируса ВИЧ-1 и всех инфицированных мышей в специально отведенном месте для биобезопасности 2 уровня.
    ПРЕДЕКТО: Автоклав и отбросить все ВИЧ-инфицированные отходы в двойных биоопасных мешках. В целях безопасности носите резистойкие перчатки при передаче ВИЧ-инфицированных мышей.
  2. Носите личное защитное оборудование (PPE), включая одноразовое платье комбинера, бахилы, маску для лица и двойные перчатки во время работы с вирусом.
  3. Выберите мышей с воссозданием более 15% клеток CD45человека (проверено в шаге 4.7) и с присутствием человеческого альбумина в сыворотке крови для ВИЧ-1 инфекции (проверено в шаге 4.1).
  4. Вводят мышам 1 х10 х 1х 1х10 4 ткани культуры инфекционных доз 50 (TCID50) ВИЧ-1ADA в объеме 100 - 200 Л л на мышь, интраперитоне.
  5. Эвтаназии ВИЧ-инфицированных мышей 5 недель после инфицирования с помощью изофлурана (с изофлурановой концентрации пара в размере йgt;5%).
  6. После эвтаназии мышей, собирать кровь в трубках ЭДТА путем прокола сердца для изоляции сыворотки, чтобы увидеть влияние ВИЧ-1 на печень, оценивая человека конкретных уровней альбумина eLISA (см. шаг 4.1) и клетки крови, чтобы проверить изменения в иммунной жизни человека клетки, использующие цитометрию потока (см. шаги 4.2 - 4.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените периферической вирусной нагрузки 5 недель послеинфекции на биоанализаторе, чтобы подтвердить, инфицированы ли мыши.
  7. После рисования крови, акциз печени из эвтаназии мышей.
  8. Для иссечения печени, подвергать брюшной полости, сделав разрез 1,5 - 2 см в длину и 0,5 см глубоко в коже, мышцах и брюшной полости, от ксифоида. Сделайте разрез перпендикулярно позвоночнику между печенью и диафрагмой. Поднимите печень и разорвать любые мембраны, прикрепляя ее к желудку и кишечнику.
  9. Сбор и исправить печень в 4% параформальдегида в одночасье и следовать стандартному иммуногистохимическому протоколу для оценки влияния ВИЧ на CK18и гепатоцитов с помощью человека конкретных CK18 антитела8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Создание двойной гуманизированной мыши модели с человеческой печени и иммунных клеток можно легко контролировать на каждом шагу с очень простой ELISA и поток цитометрии, соответственно. Цитометрия потока регулярно выполняется для оценки развития функциональной иммунной системы и для просмотра влияния ВИЧ-инфекции на иммунные клетки. У двойных гуманизированных мышей, развитие функциональных иммунных клеток может варьироваться от 15% до 90% от лимфоцитов ворот. Репрезентативные подмножества...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Печень скомпрометирована и повреждена у ВИЧ-инфицированных пациентов24. Экспериментальные модели малых животных для изучения заболеваний печени человека в присутствии ВИЧ-1 крайне ограничены, несмотря на наличие нескольких скотрансажированных моделей животных с CD34и HSPCs и гепатоцитами7,12, 25. В экспериментах in vitro, гепатоциты показаны, что имеют низкую инфекцию HIV-126...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант R24OD018546 (в L.Y.P. и S.G.). Авторы хотели бы поблагодарить Вайчжэ Ли, доктор философии, за помощь в хирургических процедурах, Аманда Бранч Вудс, B.S., Ян Ченг для иммуногистологии, UNMC потока цитометрии членов научно-исследовательского центра директор Филипп Хексли, доктор философии, Виктория Б. Смит, B.S., и Саманта Уолл, B.S., UNMC передовые микроскопии основных членов объекта Дженис А. Тейлор, B.S., и Джеймс Р. Таласка, B.S., для технической поддержки. Авторы признают д-ра Мамору Ито и Хироси Суамидзу из CIEA за предоставление мышей ТК-НОГ и д-ра Иоахима Баумгарта за предоставление треосульфана. Авторы благодарят д-ра Адриана Кестерса, UNMC, за ее редакционный вклад в рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
27 игл G1/2BD biosciences305109
30 игл G1/2"BD biosciences305106
5 мл полистирол  трубка с круглым дном 12 мм x 75 мм стильCorning352054
BD 1 мл туберкулиновый шприц без иглыBD biosciences309659
BD FACS array биоанализатор BD BiosciencesДля проверки чистоты элюированных CD34+ клеток 
Программное обеспечение для матрицы BD FACSПрограммное обеспечение для анализа полученных CD34+ клеток на матрице
BD FACS лизирующий растворBD Biosciences349202для лизиса эритроцитов
BD LSR IIBD BiosciencesПрибор для приобретения образцов проточной цитометрии
BD  Vacutainer Пластиковая пробирка для сбора кровиBD biosciencesBD 367874Для сбора
альбумина пуповинной крови бычьей сыворотки Sigma-aldrichA9576
БупренорфинКонтролируемое вещество и болеутоляющее
CD14-PEBD Biosciences555398специфичным для человека
CD19-BV605BD Biosciences562653специфичным для человека
CD34 MicroBead Kit, человекMiltenyi Biotec130-046-702Для изоации    CD34+ HSPC
CD34-PE, humanMiltenyi Biotec130-081-002Антитело, используемое для проверки чистоты элюированных CD34+ клеток 
CD3-AF700BD Biosciences557943специфичный для человека
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105специфичный для
человека CD4-APCBD Biosciences555349специфичный для человека
CD8-BV421BD Biosciences562428специфичный для человека
Слайды для подсчета клетокBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher научныйCS11204для экстракции геномной ДНК из ушного вкладыша
Cobas Amplicor system v1.5 Биоанализатор Roche Molecular Diagnosticsдля измерения вирусной нагрузки
Ватные аппликаторы   McKesson24-106-2S
Цитокератин-18 (CK18)DAKOM7010Специфичный для человека
ДМСО (диметилсульфоксид)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Набор удлинителей Микроотверстие Скользящий зажим(ы) Фиксированный замок Люэра с наружной резьбой. L: 60 in L: 152 см PV: 0,55 мл Fluid Path SterileBD biosciences30914Прикреплен к дозирующему пиппету и для загрузки с HSPC и HEP suspesion
FACS Diva version 6Программное обеспечение проточного цитометра BD Biosciencesтребуется для  получения образца
фетальной сыворотки бычьего вина (FBS)Gibco10438026
программное обеспечение для анализа FLOWJO
v10.2		FLOWJO, Программное обеспечение дляанализа проточной цитометрии
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Предписание препарата
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
среды для размораживания гепатоцитов Исследовательские лаборатории «Треугольник» MCHT50
Horizon Открытые лигирующие клипсы АппликерыTeleflex537061Для удержания лигирующих клипс
Hospira Sterile Water для инъекцийACE surgical supply co. Inc.001-1187Для разведения бупренорфина (болеутоляющего)
Набор для количественного определения альбумина человека ИФА БетиллабораторииE80-129Для оценки уровня альбумина человека в сыворотке крови
мышей Исследовательские лаборатории гепатоцитов человекаTriangle HUCP1  Криоконсервированные гепатоциты человека, квалифицированные для индукции 
Iris Scissors, StraightTed Pella, Inc.13295
ЛанцетMEDIpointGoldenrod 5 мм
LS колонны Miltenyi Biotec130-042-401Используется для захвата CD34+ микрогранул (положительный отбор)
Среда для разделения лимфоцитов (LSM)MP Biomedicals50494Для изоации    лимфоциты из периферической крови
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303удерживает сепаратор Qudro MACS и LS колонки
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Используется для выполнения разреза на коже для обнажения селезенки
Микрорассекающие щипцыRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 удерживать и вытягивать селезенку из брюшинной полости
мышь CD45-FITCBD Biosciences553080специфичный для мыши
PBS (фосфатно-солевой буфер)HydroneSH30256.02
Сепаратор Qudro MACS Miltenyi Biotec130-090-976вмещает четыре колонки LS
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Применяемые биосистемыИспользуемый инструмент  для  генотип
Степпер серия Повторяющаяся дозирующая пипетка 1 млDYMAX CORPT15469Используется для  дозирования  HSPC и HEP supension контролируемым образом
Suturevet PGA синтетический абсорбционный шовный материалHenry Schein Animal Health41178Наложение швов на кожу и брюшину
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher научный4369016
TC20 автоматизированный счетчик клетокBio-rad1450102
мышей TK-NOG Предоставлено Центральным институтом экспериментальных животных (CIEA, Япония; д-р Мамору Ито и Хироши Суэмидзу)
TreosulfanMedac GmbHПредоставлено  Д-р Йоахим Баумгарт (medac GmbH) 
Трипан СинийБио-Рад1450022
Микроножницы типа Vannas, прямые, 80 мм L TedPella, Inc.1346Используется для выполнения разреза на коже с целью обнажения селезенки
Weck hemoclip традиционными титановыми лигирующими клипсамиEsutures523700Для перевязки селезенки после инъекции
" ООО

Ссылки

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820(2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817(2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD341

Похожие статьи