Методическая статья

qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов

10.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58646

⸱

6 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

В этой статье

Краткое содержание

Количественные клеток-киллеров иммуноглобулина подобный рецептор (KIR) полуавтоматические ввод (qKAT) является простой, высокой пропускной способности и экономически метод, чтобы скопировать номер типа Кир генов для их применения в ассоциации исследований населения и болезней.

Аннотация

Иммуноглобулин подобные рецепторы клеток-киллеров (Кирс) представляют собой набор тормозящее и активация иммунных рецепторов, на природные убийца (НК) и Т-клеток, кодируемых кластер полиморфных генов на хромосоме 19. Их наиболее характерны лигандов являются человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) молекулы, которые кодируются в комплекс (MHC) локуса гистосовместимости на хромосоме 6. Есть существенные доказательства того, что они играют значительную роль в иммунитет, воспроизводства и трансплантации, что делает его крайне важно иметь методы, которые можно точно генотип их. Однако, высокий последовательности гомологии, а также аллельных и копии номер изменения, затрудняют методов проектирования, которые можно точно и эффективно генотип все гены Кир . Традиционные методы обычно ограничены в резолюции полученных данных, пропускная способность, эффективности затрат и времени для настройки и выполнения экспериментов. Мы описываем метод, называемый количественных Кир полуавтоматические ввода (qKAT), который является высок объём Мультиплекс в реальном времени полимеразной цепной реакции метод, который можно определить номера копии гена для всех генов в локусе Кир . qKAT представляет собой простой метод высокой пропускной способности, которая может обеспечить высоким разрешением Кир копирования числовые данные, которые могут в дальнейшем использоваться для выведения вариации в структурно полиморфных гаплотипов, что охватить их. Эта копия номер и гаплотип данные могут быть полезными для исследований на крупномасштабных болезни ассоциаций, популяционной генетики, а также расследований на выражение и функционального взаимодействия между Кир и HLA.

Введение

В организме человека, убийца рецептора иммуноглобулина как(Кир) локус сопоставляется на длинном плече хромосомы 19 в рамках комплекс рецептор лейкоцитов (LRC). Этот локус в длину около 150 КБ и включает в себя 15 Кир гены расположены головы до хвоста. Кир локусов, которые известны в настоящее время являются KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, и два pseudogenes, KIR2DP1 и KIR3DP1. Кир гены кодировать для двумерного (2D) и трехмерных (3D) домен иммуноглобулина подобных рецепторов с короткими (S; активации) или длинным (L; тормозящее) цитоплазматических хвосты, которые выражаются в естественных киллеров (НК) и подмножество T клетки. Номер варианта копирования выставлены в Кир локуса формы различных гаплотипов с переменной ген содержание1. Non аллельные гомологичная рекомбинация (НАХР), способствовало тесное голова хвост гена договоренности и высокой последовательности гомологии, является механизм, предложенный отвечает за haplotypic изменчивости. Более 100 различных гаплотипов были зарегистрированы в населения во всем мире1,2,3,4. Все эти гаплотипов можно разделить на две основные группы: A и B гаплотипов. Гаплотип A содержит 7 Кир генов: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1и KIR3DL2, которые ингибирующее Кир генов и активации Кир гена KIR2DS4. Однако до 70% лиц европейского происхождения, которые гомозиготных для Кир гаплотип А исключительно несут нефункциональные «удаление» форма KIR2DS45,6. Все другие комбинации генов Кир формируют группы B гаплотипов, включая по крайней мере один из конкретных генов Кир , KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, и KIR2DL5и обычно включают в себя два или более Активация Кир генов.

HLA класса I молекулы были названы лигандов для определенных рецепторов ингибирующих (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3и KIR3DL1), активируя рецепторы (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5и KIR3DS1), и для KIR2DL4, который является уникальный Кир , который содержит долго цитоплазматических хвосты, как других рецепторов ингибирующих Кир, но также имеет положительно заряженных остатков вблизи внеклеточного домена, которая является общей особенность других активирующий рецепторы Кир . Сочетание вариантов внутри Кир генов и HLA генов влияет взаимодействия лигандов рецепторов потенциал клеток отзывчивость НК что фигуры на индивидуальный уровень7,-8. Доказательства из исследований генетических ассоциации указал, что Кир играет определенную роль в вирусной устойчивости (например,., вирус иммунодефицита человека [ВИЧ]9 и гепатит C вирус [гепатита с]10), успех трансплантации 11, риск беременности расстройств и репродуктивный успех12,13, защиты от рецидивов после аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (ТГСК)14,15, 16и риск рака17.

Сочетание высокой последовательности гомологии и аллельные и haplotypic разнообразие представляет проблемы в задаче точно генотипирования Кир генов. Обычные методы типа Кир генов включают последовательности специфического праймера (SSP) полимеразной цепной реакции (ПЦР)18,19,20, специфичные для последовательности олигонуклеотида зонд PCR (SSOP)21, и Матрица помощь лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS)22. Недостатки этих методов являются, что они только обеспечивают частичное понимание генотип человека, а также трудоемкий для выполнения. Недавно секвенирование нового поколения (НГС) был применен к типу Кир Локус специально. Хотя этот метод является очень мощным, он может быть дорогим для запуска, и это требует много времени для проведения углубленного анализа и данных проверок.

qKAT является методом высок объём количественного PCR. В то время как обычные методы трудоемким и длительным, этот метод позволяет запускать почти 1000 образцов геномной ДНК (геномная ДНК) в течение пяти дней и дает Кир генотипа, а также номер копии гена. qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций, каждая из которых ориентирована на две Кир локусов и один ген ссылки Фиксированная копия числа в геноме (STAT6) используется для относительной квантификация гена Кир скопировать номер23. Этот assay успешно используется в исследованиях с участием большого числа панелей и когорты болезни на инфекционные заболевания, как гепатит с, аутоиммунные заболевания, как диабета типа 1 и беременность расстройств, таких как преэклампсия, а также предоставление генетических основу для исследований, направленных на понимание NK клеток функция1,4,24,25,26.

Протокол

1. Подготовка и обшивка из ДНК

  1. Точно подсчитать концентрация геномная ДНК с помощью спектрофотометрические или флуориметрический инструмента.
  2. Разбавляют ДНК до 4 нг/мкл на плиту 96-луночных глубокой скважины. Включать, по крайней мере один образец управления геномная ДНК с числом известных копии и один элемент управления-шаблон.
  3. Центрифуга 96-луночных пластины на 450 x g на 2 мин.
  4. С помощью инструмента обработки жидких, обойтись каждый образец в составленном на 384-ну ПЦР плиты так, что каждый хорошо имеет 10 нг ДНК (2,5 мкл/хорошо). Подготовка по меньшей мере десять 384-ну пластины, один для каждой qKAT реакции.
  5. Если геномная ДНК отказаться от более чем одной 96-луночных пластины, выполните полный объем промыть 2% отбеливателя и ультрачистая вода для очистки иглы жидкости системы между каждой пластины 96-луночных геномная ДНК образцов обработки.
  6. Просушите ДНК, инкубации и 384-ну пластины в чистой зоне при комнатной температуре в течение 24 часов.

2. Подготовка грунтовки и зонды

Примечание: qKAT состоит из десяти мультиплекс реакций. Каждая реакция включает в себя три пары праймера и три флуоресцировани обозначенного зондами, которые специально усиливают два Кир генов и ссылку на один ген. Датчики, которые были опубликованы в Цзян et al.27 были изменены таким образом, чтобы олигонуклеотиды теперь помечены Атто красителями, так как они предлагают улучшенный светостойкость и длинный сигнал продолжительностей жизни. Pre-aliquoted грунтовка комбинации являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).

  1. Подготовьте грунт комбинации для каждой реакции согласно разведений, приведенные в таблице 1.
  2. Подготовьте зонд комбинации для каждой реакции согласно таблице 1. Каждый индивидуальный пробник до принятия комбинации.

3. Подготовка Мастер микс

Примечание Томов, упомянутых ниже, для выполнения одного qKAT реакция на наборе 10 x 384-ну пластин.

  1. Убедитесь, что геномная ДНК образцов покрытием на тарелках 384-ну абсолютно сухие. Провести все шаги на льду и держать реагентов, распространяется от воздействия света как можно больше, поскольку флуоресцировани обозначенного зонды чувствительны к фото - и термо.
  2. Размораживание буфер ПЦР, грунтовка и зонд аликвоты при 4 ° C.
  3. На льду Подготовьте мастер смесь для 10 x 384-ну пластин, добавив 18,86 мл ультрачистая вода, 20 мл ПЦР буфер, 1000 мкл вкладываемое грунтовка комбинации и 180 мкл вкладываемое зонд комбинации (Таблица 2).
  4. Равномерно распределяет Мастер микс по 96-глубокие хорошо пластину, используя многоканальные пипетки, закупорить 415 мкл в каждой скважине. Держите эту пластину в поле льда распространяется от света.
  5. С помощью инструмента обработки жидких, лунки 9,5 мкл мастер смесь в каждой скважине 384-ну пластины с сушеной геномная ДНК. Печать пластину с фольгой и сразу же поместить его на 4 ° C. Повторите этот процесс для оставшихся пластины, обеспечивая, что иглы жидкости системы обработки промывают водой между каждой плиты.
  6. Центрифуга 384-ну пластины на 450 x g 3 мин и инкубировать их в 4 ° C на ночь или между 6-12 ч до Ресуспензируйте ДНК и рассеивать любые воздушные пузыри.

4. ПЦР анализа

  1. После ночи инкубации центрифуги на 450 x g 3 мин рассеивать любые оставшиеся пузырьков воздуха.
  2. Для целей автоматизации, подключите машину ПЦР (например, LightCycler 480) Гонав обработчик (см. Таблицу материалы). Программа обработчик Гонав размещать пластины в машину ПЦР с охлаждением хранения док, который защищен от света.
    Примечание анализов должны в теории, работать на других машинах ПЦР с совместимых оптических параметров.
  3. Используйте следующие условия Велоспорт: 95 ° C за 5 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 s и 66 ° C 50 сек, сбора данных на 66 ° C.
  4. После завершения выполнения, у робота собрать пластину от машины ПЦР и поместите его в док отменить.

5. После выполнения анализа

  1. После усиления, вычислить количественная оценка цикла (ов) с помощью второй производной максимальная метода или метода определяющих точек с помощью программного обеспечения машины ПЦР (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям ниже.
  2. Откройте программное обеспечение ПЦР, на вкладке " Навигатор ", файл и открыть сохраненный реакции эксперимент для одной пластины.
  3. Для анализа с использованием метода второй производной максимальная выберите вкладку анализ и создать новый анализ с помощью метода Abs Quant/Second производная Макс.
    1. В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Quant/Second производная Макс, подмножества: все образцы, программа: усиление, имя: Rx-ДФО (где x является номером реакции).
    2. Выберите Фильтр расческу и выберите Вик/HEX/Yellow555 (533-580). Это гарантирует, что данные, собранные для STAT6 установлен.
    3. Выберите Цвет компенсации для VIC/HEX/Yellow555(533-580). Нажмите кнопку вычислить. Повторите это действие для Fam (465-510) и Cy5/Cy5.5(618-660). Нажмите кнопку сохранить файл.
  4. Для анализа с использованием метода определяющих точек выберите Abs Квант/Fit точки на вкладке анализ.
    1. В окне Создание нового анализа , выберите тип анализа: метод Abs Квант/определяющих точек, подмножества: все образцы, программа: усилители, имя: RxF-ДФО (где x является номером реакции).
    2. Выберите правильные фильтры и цвет компенсации для STAT6 и каждый из генов Кир (Fam/Cy5). В Noiseband на вкладке установите шума группу, чтобы исключить фоновый шум.
    3. На вкладке анализ равным 3 определяющих точек и выберите Показать определяющих точек. Нажмите кнопку вычислить. Нажмите кнопку сохранить файл.

6. Экспорт результатов

  1. В программном обеспечении ПЦР, откройте Навигатор tab. Выберите Экспорт пакетов результаты.
  2. Откройте папку, в которой эксперимент файлы сохраняются и передачи файлов в правой части окна. Нажмите кнопку Далее. Выберите имя и расположение файла экспорта.
  3. Выберите тип анализа, метода Abs Quant/Second производная Макс или Abs Квант/определяющие точки. Нажмите кнопку Далее. Проверьте, что имя файла, папку экспорта и тип анализа являются правильными и нажмите кнопку следующий чтобы начать процесс экспорта.
  4. Подождите, пока Состояние экспорта ОК. Экран автоматически перейдет к следующему шагу. Проверьте, что все выбранные файлы были успешно экспортированы тем, что количество файлов не = 0. Нажмите кнопку Готово.
  5. Использовать скрипты split_file.pl и roche2sds.pl разделить экспортируемый пластины на индивидуальных реакций для каждой пластины.
    Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.

7. Скопируйте число вычислений

  1. Открываете копию номером анализ программного обеспечения (например, CopyCaller). Выберите файл результатов в реальном времени PCR импорта и загрузить текстовые файлы, созданные roche2sds.pl.
  2. Выберите анализировать и проводить анализ, либо выбрав образец калибратор с числом известных копии или выбрав наиболее частого копирования номер. Смотрите в таблице 5 для наиболее частых копии количество генов Кир , обычно наблюдается в населения европейского происхождения.

8. качество данных проверяет

  1. Используйте сценарий R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R объединить копирования данных из всех плит в электронную таблицу.
    Примечание сценарии предоставляются по запросу/GitHub.
  2. Проверьте исходные данные на копию номером анализ программного обеспечения для образцов, которые не соответствуют известных связей неравновесия (LD) для Кир генов (Таблица 6).

Результаты

Анализ копировать номера может осуществляться путем экспорта файлов для копирования номер анализ программного обеспечения, которое предоставляет номер предсказал и оценкам копирования, основанный на методе ΔΔCq.

Номер копии может быть предсказано, либо на основе известных копии количество контрольных образцов ДНК на плите или путем ввода наиболее часто номер копии гена (Таблица 5). Рисунок 1 показывает результаты пластины для реакции, предназначенный для KIR2DL4 и KIR3DS1, а также ссылка гена STAT6. Наиболее частые копии номер для KIR2DL4, рамки гена в Кир локус, — две копии, тогда как наиболее часто копии номер для KIR3DS1, активируя гена, одна копия. Результаты на рисунке показывают участки амплификации PCR, наблюдается на ПЦР программного обеспечения и копии данных создается из данных ПЦР. Как показано, assay возможность различать 0, 1, 2, 3 и 4 номеров копии гена Кир . Копия числовой анализ программного обеспечения также позволяет Просмотр распределения числа копирования через пластину как круговую диаграмму или гистограмму. Эффективность копирования номер предсказание ниже для образцов с более высоким номером копии.

Качество всех материалов, используемых в реакции, геномная ДНК, буфер, грунтовки и зонды, может повлиять на точность полученных результатов. Однако скорее всего, вызвана из-за различия в концентрации ДНК через тарелку несоответствие в результатах. Чистота извлеченные геномная ДНК, которая может быть измерена с помощью 260/280 и 260/230 коэффициенты, также может иметь влияние на качество. 260/280 отношение коэффициента 1,8-2 и 260/230 2-2,2 желательны. Неравномерным диапазон ДНК концентрации через пластины может привести к высокой изменчивости в круговороте порога (tC) между образцов и отсутствие согласованности в диапазоне сметных копия числа. Результаты на рисунке 2 показывают эффект, что может иметь расхождение между значениямиt C через тарелку на точность прогнозирования числа копирования. Красная линия указывает диапазон оценкам копии номер для образца и, в идеале, должно быть как можно ближе к целое как можно скорее.

Копирование данных, после проанализированы могут быть экспортированы в файл электронной таблицы в формате 96-луночных. Мы использовали сценарий R (доступно по запросу) для объединения копирование данных всех 10 пластин, которые запускаются как набор в одну таблицу. Опубликованные данные о Кирс основном европейского происхождения населения позволяет предсказания LD правил, которые существуют между различными генов в Кир комплекс1. Эти прогнозы используются для проверки ниже по течению на копии число результатов (Таблица 6). Образцы, которые не соответствуют прогнозируемым LD между гены могут содержать необычных полиморфизм или haplotypic структурных изменений. Блок-схемы, описывающие протокол показан на рисунке 3.

Инструмент называется Кир гаплотип идентификатор (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) была разработана для облегчения вменение гаплотипов из набора данных. Вменением работает на основе перечня справочных гаплотипов наблюдается в населения европейского происхождения1. Однако инструмент также позволяет для набора справочных гаплотипов использоваться вместо. Создаются три отдельных файлов; Первый файл содержит список всех комбинаций гаплотип для образца, второй файл предоставляет список обрезается гаплотипов комбинации, которые имеют высокие комбинированные частоты, и третий файл список образцов, которые не могут быть назначены гаплотипов. Non назначение гаплотипов могут использоваться в качестве показателя Роман гаплотипов.

figure-results-1
Рисунок 1: представитель результаты пластины для реакции номер 5. (A) это усиление шоу группа участков. (B) Эта панель показывает скопировать несколько участков. (C) Эта группа показывает номер распределения копий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: представитель результаты плиты с переменной концентрации ДНК для реакции номер 5. (A) это усиление шоу группа участков. (B) Эта панель показывает скопировать несколько участков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: блок-схемы протокола qKAT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ПробаГеныФорвард праймерыКонцентрация (Нм)Обратный праймерыКонцентрация (Нм)ЗондыКонцентрация (Нм)
No 13DP1A4F250A5R250P4a150
2DL 22DL2F4400C3R2600P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL 3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 33DL 3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 43DL1e4B1F250B1R125Expal P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 53DS1B2F250B1R250Expal P4b150
2 ДЛ 4C1F200C1R200P5b - 2DL 4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 62DL 1B3F500B3R125Expal P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 72DS1B4F500B4R250Expal P4b150
2DL 5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 82DS3B5F250B5R250Expal P4b150
3DL2e9D4F250D5R125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
No 102DS5B6F2200B6R3200Expal P4b150
2DS4C5F250C5R250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

Таблица 1: сочетание и концентрации грунтовки и датчики, используемые в каждой реакции qKAT 27 .

РеакцияГрунтовка аликвоты (мкл)Зонд аликвоты (мкл)
R13DP1A4FA5R2DL2F4C3R2ВОДЫSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL 21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RВОДЫSTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL 31601601601601608080806060
Примечание: требуется 20 мкл меньше воды в MasterMix
R33DL 3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2ВОДЫSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100 1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2ВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP5B - 2L 4PSTAT6
2 ДЛ 410010080804408080606060
R62DL 1B3FB3RD3FD3RВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP9PSTAT6
2DL 52001002002001008080606060
R82DS3B5FB5RD4FD5RВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2ВОДЫSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RВОДЫSTAT6FSTAT6REXPAL P4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

Таблица 2: Тома (мкл) 100 мкм праймер/зонд складе решения сделать грунт и зонд аликвоты комбинации.

ИмяНаправлениемодификация 5´модификация 3´Последовательность (5' →3')ДлинаTMGC %ЭксонПозиция
P4aЧувствоFAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044,44425-451
Expal P4bAntisenseFAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5bЧувствоATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5b - 2DL 4ЧувствоATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9ЧувствоATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062,591246-1269
PSTAT6ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

Таблица 3: список датчиков, используемых в qKAT 1, 27. люминесцентные красители, используемые в конце 5' oligo зонды P5b, P5b - 2 DL 4, P9 и PSTAT6 были изменены для Атто красители.

ДжинПраймерыНаправлениеПоследовательность (5´-3´)ДлинаTMGC %ЭксонПозицияАмпликон (bp)Может быть упущена аллели
3DL2e4A1FВпередGCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261.14399-4161793DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1RРеверсCTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352,6559-5773DL 2 * 048
3DP1A4FВпередGTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416112Нет
A5RРеверсGTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255,6492-509Нет
2DS2A2FВпередGTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416111Нет
A6RРеверсTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142,9488-508Нет
3DL 3A8FaВпередGTGAAATCGGGA
GAGACG		185055,64406-423139Нет
A8FbВпередGGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052,6405-4233DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8RРеверсAGTTGACCTGGG
AACCCG		185161.1526-543Нет
3DL1e4B1FВпередCATCGGTCCCAT
GATGCT		185155,64549-566853DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1RРеверсGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL 1 * 00502
3DS1B2FВпередCATCGGTTCCAT
GATGCG		185155,64549-566853DS1 * 047; могут забрать 3DL 1 * 054.
B1RРеверсGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633Нет
2DL 1B3FВпередTTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3RРеверсGTCACTGGGAGC
TGACAC		185061.1622-6392DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1B4FВпередTCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147,44545-563962DS1 * 001
B4RРеверсGGTCACTGGGAG
CTGAC		174964,7624-640Нет
2DS3B5FВпередCTCCATCGGTCG
CATGAG		185361.14546-56396Нет
B5RРеверсGGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161.1624-641Нет
2DS5B6F2ВпередAGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052,64475-493173Нет
B6R3РеверсTCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366,7630-6472DS5 * 003
2 ДЛ 4C1FВпередGCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255,65808-82583Нет
C1RРеверсCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252,6872-8902 ДЛ 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 22DL2F4ВпередGAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257,95778-7961512DL 2 * 009; 782G изменено на а.
C3R2РеверсTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928Нет
2DS4C5FВпередTCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770.65803-819120Нет
C5RРеверсTTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257,9904-9222DS4 * 013
2DS4Del2DS4DelВпередCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457,95750-768203Нет
2DS4R2РеверсTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Нет
2DS4FL2DS4FLВпередCCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357,95744-762209Нет
2DS4R2РеверсTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Нет
2DL 3D1FВпередAGACCCTCAGGA
GGTGA		174858,891180-1196156Нет
D1RРеверсCAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 и 2DL 3 * 01802
2DL 5D2FВпередCACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B * 011 и 2DL5B * 020
D2RРеверсGGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947,41315-1333Нет
2DP1D3FВпередCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121Нет
D3RРеверсTTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304Нет
3DL1e9D4FВпередCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221933DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2РеверсCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343,51273-12953DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9D4FВпередCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221156Нет
D5RРеверсGACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463,21340-1358Нет
STAT6STAT6FВпередCCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129
STAT6RРеверсCCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

Таблица 4: последовательности праймеров, используемые в qKAT 1, 27.

Кир Джин 3DL 32DS22DL 22DL 32DP12DL 13DP12 ДЛ 43DL 1
EX9		3DL 1
EX9		3DS12DL 52DS32DS52DS12DS4
Итого		2DS4
FL		2DS4
DEL		3DL 2
EX4		3DL 2
EX9
Наиболее частое копирование номер21122222221111121122

Таблица 5: Наиболее частое копирование номер для Кир генов, обычно наблюдается в образцах европейского происхождения.

Связь неравновесия правила для qKAT, основанные на европейских популяцийСкопируйте номер проверки
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 и KIR3DL2 являются рамки гены присутствуют на обеих гаплотипов. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 и KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 и KIR2DL2 находятся в LD друг с другом 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 и KIR2DL3 являются аллели гена же 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 и KIR2DL1 находятся в LD друг с другом 2DP1=2 DL 1
5Эксон 4 KIR3DL1 и KIR3DL2 равен Эксон 9 KIR3DL1 и KIR3DL2 соответственно. 3DL1ex4=3DL1ex9 и 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 и KIR3DS1 являются аллели 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 и KIR2DS5 находятся в LD с KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 и KIR2DS1 находятся в LD 3DS1=2DS1
9Наличие KIR2DS1 и KIR2DS4Total является взаимоисключающим на гаплотипа 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL и KIR2DS4del являются варианты KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Таблица 6: взаимосвязь равновесия между Кир гены, обычно наблюдается у населения европейского происхождения может использоваться для проверки копии данных 1,-27.

Обсуждение

Мы описали Роман полуавтоматические высок объём метод, называемый qKAT, который облегчает копирование номер ввода Кир генов. Этот метод является улучшением по сравнению традиционными методами как SSP-PCR, низкой пропускной способностью и может только указать наличие или отсутствие этих весьма полиморфных генов.

Точность копирования число полученных данных зависит от нескольких факторов, включая качество и концентрации единообразие геномная ДНК образцов и качество реагентов. Качество и точность геномная ДНК образцов через тарелку чрезвычайно важны для различия в концентрации через пластины может привести к ошибкам при расчете числа копирования. После анализов были проверены с использованием комплектов образцов европейского происхождения, данные из когорты из других частей мира требуют более тщательной проверки. Это необходимо для того, что экземпляры аллеля отсева или неспецифических праймер/зонд привязки не истолкованы как копирование количество вариантов.

В то время как анализы были разработаны и оптимизированы для работы в качестве высокой пропускной способности, они могут быть изменены для запуска меньшее количество образцов. Метрику уверенность в копии номер анализ программного обеспечения пострадавших при анализе образцов меньше, но это можно улучшить, если управления геномной ДНК образцов с известный номер копии гена Кир включены на плите и реплицирует дополнительные примеры включены.

Для лабораторий без жидкости/плита обработки роботы мастер смесь можно обойтись с помощью многоканальных пипеток и пластины могут загружаться вручную в ПЦР инструмент.

Основная цель за развитие qKAT было создание простой, высокой пропускной способности, с высоким разрешением и экономически метод генотип Кирс болезни ассоциации исследований. Это была успешно достигнута, поскольку qKAT был нанят в расследовании роли Кир в нескольких крупных болезни ассоциации исследований, включая широкий спектр инфекционных заболеваний, аутоиммунные условий и беременность расстройств4, 24 , 25 , 26.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Проект получил финансирование от Совета медицинских исследований (СМИ), Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (Грант соглашение № 695551) и национального института здравоохранения (НИЗ) Кембридж Биомедицинских научно-исследовательский центр и низ исследования крови и трансплантации исследовательское подразделение (NIHR BTRU) в донорства и трансплантации в Кембриджском университете и в партнерстве с NHS крови и трансплантации (NHSBT). Мнения, выраженные являются те из авторов и не обязательно ГСЗ, NIHR, Департамент здравоохранения, или NHSBT.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>РЕАГЕНТЫ
олигонуклеотидыSigmaИндивидуальный заказПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: Перечислены в Таблице 4
Зонды с маркировкой красителями ATTOSigmaИндивидуальный заказПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: Перечислены в Таблице 3
Зонд SensiFAST No-ROX KitBiolineBIO-86020−
MilliQ вода&минус;&минус;&минус;
NameCompanyНомер в каталогеКомментарии
ОБОРУДОВАНИЕ
Центрифуга с качающимся ротором ковшаEppendorf(или аналоги)Eppendorf 5810R или аналогичная система
NanoDropThermo ScientificND-2000
OR
QuBit ФлуориметрLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II Instrument 384-луночный Roche05015243001
Twister II Микропланшетный манипулятор с Mé Термоукладчик для кур (Mé Cour)Caliper Life Sciences204135
Вихревой смесительBiosanBS-010201-AAA
Одноканальные пипетки (диапазон объема: 0,5– 10 & микро; L, 2– 20 &микро; L, 20– 200 &микро; L, 200– 1,000 & микро; L; 1-10 мл)Жильсона (или эквивалентный)F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
наконечники пипеток без РНКазы и ДНКазы отфильтрованные (10 & микро; L, 20 и микро; L, 200 & микро; L, 1,000 &; L, 10 мл)Starlab (или эквивалент)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
Резервуар для реагентов StarTub PS, 55 млSTARLABE2310-1010
50 мл ЦентрифугаSTARLABE1450-0200
96-луночная глубокая пластинаFisher Scientific12194162
LC480 384 многолуночные пластиныRoche04729749001
LightCycler 480 Уплотнительная фольгаRoche04729757001
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Прикладное программное обеспечение Biosystems CopyCaller v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
гаплотипа KIR
идентификатор http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

Ссылки

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

KIRqKATHLANK

Похожие статьи