Методическая статья

Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование

DOI:

10.3791/58647

⸱

7 января 2019 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Dentistry, Mahidol University, 2Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для удовлетворения потенциального использования тромбоцитов как датчик высокочувствительный оксида азота в крови. Он описывает подготовку первоначальных тромбоцитов и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как оксид азота генераторов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоциты являются крови компонентов, отвечающих за надлежащее крови свертываясь. Их функция высоко регулируется различными путями. Один из самых мощных вазоактивных агентов, оксид азота (NO), также могут служить мощным ингибитором агрегации тромбоцитов. Прямые без обнаружения в крови является весьма сложной задачей из-за его высокую реакционную способность с свободной ячейки гемоглобина, который ограничивает не half-life в ряд миллисекунды. В настоящее время никаких изменений после вмешательства только оцениваются на основе измеренных изменений нитритов и нитратов (члены метаболический путь Нитрат нитрит нет). Однако, эти измерения точны достаточно сложно интерпретировать визави фактической никаких изменений, благодаря естественно высокий базовый нитритов и нитратов уровней, которые являются несколько порядков выше, чем ожидаемые изменения не сама по себе. Таким образом развитие прямых и простые методы, позволяющие определять NO непосредственно назрела давно. Этот протокол рассматриваются возможности использования тромбоцитов как высокочувствительный не датчик в крови. Он описывает первоначальный тромбоцитов богатой плазмы (PRP) и промывают тромбоцитов подготовка и использование нитрита и венозная красные кровяные клетки как нет генераторов. Фосфорилирование VASP на Серин 239 (Ser239P-VASP) используется для обнаружения присутствия № Тот факт, что белок VASP высоко выражается в тромбоцитах и что он быстро фосфорилированных когда NO присутствует приводит к уникальную возможность использовать этот путь непосредственно не обнаружение в крови.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоциты являются фрагменты небольшие дискообразный клеток, производный от megakaryocytes, которые имеют решающее значение для свертывания крови. Каскад свертывания инициируется различных биоактивных молекул (например, коллаген или ADP), выпущенные после повреждения сосудистой стенки. Процесс свертывания крови могут быть изменены, среди различных эффекторов, оксида азота (NO). НЕТ, естественным образом вырабатывается клетками млекопитающих, является одним из самых разносторонних физиологических сигналов. Он действует как мощным сосудорасширяющим, нейромедиаторов и иммунного модулятора, чтобы назвать несколько из его многочисленных функций. В кровь нет также помогает регулировать степень свертывания крови, препятствует агрегации тромбоцитов. Одним из наиболее вероятные источники NO в крови является нитрит, неорганических ионов, что было показано, чтобы служить в качестве прекурсора № Реагирующих с красных кровяных телец (эритроцитов), нитрит сводится к NO и deoxyHb окисляется до метгемоглобина (metHb)1. НЕТ, освобождены от RBCs вазоактивное и вызывает покровов2. Этот путь сокращения нитрит-альтернативный путь не поколения, действуя вместе с и дополнения классической путь не поколения синтаза эндотелиального оксида азота в гипоксических условиях.

Тромбоциты, сами не способны уменьшить нитритов в NO, но очень чувствительны к ее присутствию. В нетронутыми тромбоцитов, не в наномолярных диапазона увеличивает cGMP (EC50 = 10 Нм) и фосфорилирование VASP (EC50 = 0,5 Нм)3. Таким образом тромбоцитов может служить отличным датчик нитрита сокращения эритроцитов и не выброса в кровь. Существует несколько методов, которые могут непосредственно измерить степень активации тромбоцитов - как aggregometry и тромбоэластография (ГТЭ)4,5. Однако эти методы требуют дорогих специализированных приборов и довольно большое количество материала. Это также возможно для мониторинга событий вниз по течению, после не освобождается от RBCs, используя изменения экспрессии белка поверхности тромбоцитов – например P селектина6. НЕТ также известен для увеличения количества cGMP в тромбоцитов7. Ранее мы использовали cGMP для мониторинга без выброса в кровь после сокращения нитрита венозная РБК8. Это оказалось очень чувствительным методом; Однако цГМФ является молекула недолго и его обнаружение включает в себя обширные труда. Другая возможность, описано в протоколе представленных использует фосфорилирование сосудорасширяющим стимулирует фосфористой (VASP)-белок для обнаружения присутствия No в крови. VASP является субстрат протеин киназы протеина G активации, который фосфорилированных после взаимодействия с NO через sGC/cGMP путь9. Обнаружению VASP фосфорилирования происходит без каких-либо очень низкой концентрации, которые могут сделать очень чувствительной детектор не присутствие тромбоцитов в крови. VASP высоко выражается в тромбоцитах, но не в других клеток крови, который позволяет выборочно следить за событиями, с участием тромбоциты10.

Основная цель настоящего Протокола заключается в описания метод детально для обнаружения не выпуска в цельной крови, с помощью его взаимодействия с тромбоцитов, мониторинг VASP фосфорилирование11,12. Описан метод позволяет раннего обнаружения низкого не концентрации - теоретически в наномолярных диапазоне, что делает настоящий протокол более чувствительны, чем определение цГМФ за счет использования стандартной западной помарки методы достижимыми в большинстве лаборатории Параметры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Образцы крови были получены из низ крови банка (СИБ утвердил протокол: 99-CC-0168).

1. кровь пробоподготовки

Примечание: Чтобы избежать активации тромбоцитов, нарисовать кровь медленно и осторожно перемешать с цитрат, инвертирование трубке несколько раз.

  1. Подготовка тромбоцитов богатые плазмы (PRP)
    1. Нарисуйте 30 – 50 мл крови с помощью 20 G или большего диаметра иглы и добавить в пробирку, содержащую цитрат натрия (3,8%) в соотношении 1:9 или кислоты цитрат декстрозы (ДСА) (85 мм тринатрия цитрат, 66,6 мм лимонной кислоты, 111 мм глюкозы, pH 4.5) в соотношении 1:6.
    2. Аликвота 5 мл свеже собранных цельной крови в пустой 15 мл конические трубы. Центрифуга цельной крови на 120 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Тщательно Соберите супернатанта, содержащий тромбоцитов (тромбоцитов богатые плазмы, ОТР) от верхней части пипетки пластиковые передачи.
      Примечание: PRP от шага 1.1.3 готова к использованию в экспериментах или для дальнейшей обработки подготовить промывают тромбоцитов. Мягкие лепешки, полученные после центрифугирования (шаг 1.1.2) содержит красные кровяные клетки и лейкоциты и может быть далее очищенный для получения отмытых эритроцитов (РБК) — см. шаг 1.3. Эксперимент должен быть завершена в течение 2 ч после нанесения крови. При сборе ОТР (супернатант), Избегайте коллекции Баффи пальто содержащих лейкоцитов, накопленных на интерфейсе ОТР/РБК.
  2. Подготовка промывают тромбоцитов (опционально)
    1. Центрифуга собранные PRP на 400 x g 10 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и держать гранулы тромбоцитов.
    2. Осторожно промойте гранулы, добавив 5 мл CGS буфера (120 мм NaCl, 12,9 мм тринатрия цитрат и 30 мм глюкозы, рН 6,5) и центрифуги на 400 x g 10 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспензируйте гранулы тромбоцитов с 3 мл модифицированных Tyrode буфера (134 мм NaCl, 0,34 мм NaH2PO4, 2.9 KCl, 12 мм NaHCO3, 20 HEPES, 2 мм CaCl2, 10 мм глюкозы рН 7,4 мм MgCl2, 1).
    4. Разбавить тромбоцитов (1: 100 — как пример, 10 мкл тромбоцитов в 990 мкл раствора Риз-Экер) с раствором Rees Экер и подсчета Горяева.
    5. Отрегулируйте плотность тромбоцитов до 3 x 108 кл/мл, добавив Tyrode буфера.
    6. Инкубируйте подвеска тромбоцитов при 37 ° C за 1 ч до начала эксперимента.
      Примечание: Промывают тромбоцитов стабильны для 5 – 8 ч при 37 ° C.
  3. Подготовка отмытых эритроцитов (РБК)
    1. После сбора центрифуга мягкие лепешки, полученного на шаге 1.1.3 в 2500 x g 10 мин при комнатной температуре.
    2. Отменить супернатант и помыть лепешка РБК с 5 мл PBS центрифугированием на 2500 x g 10 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг для 3 раза.
    3. Отменить PBS и использовать отмытых эритроцитов для дальнейших экспериментов.

2. обескислороживания

  1. Добавить 1 мл смеси ОТР (подготовлен на шаге 1.1.4. или 1.2.4.) и эритроцитов (подготовлен в шаге 1.3.) в желаемой гематокрит в бутылку полипропилен, закрыт с резиновой пробкой. Например на 20% уровень гематокрита, добавьте 200 мкл RBCs 800 мкл ОТР.
    Примечание: Предлагаемые hematocrits от 0% до 40%. Не использовать стеклянные бутылки или настой как тромбоциты придерживаться поверхности стекла.
  2. Вставьте иглу, подключенных к бак газа гелия в закрытой бутылке и сделать выход газа, вставляя иглу 26 G (рис. 1).
  3. Медленно вихрем бутылку при комнатной температуре.
    Примечание: Не позволяют он газа пузырь через кровь подготовки. Медленно газового потока является предпочтительным для выполнения этой процедуры, и чрезмерно быстрый поток газа он приводит к увеличению гемолиза. Наиболее эффективный поток газа необходимо быть определены судом, как это сильно зависит от геометрии экспериментальной установки.
  4. Периодически следить за процессом обескислороживания, измеряя парциальное давление кислорода (по2) с помощью со-оксиметра.
    Примечание: В наших руках 10 мин обескислороживания уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, который необходим для сокращения нитрита RBCs. Продолжая обескислороживания дальнейшему сокращению Ро2 в 10 мм ртутного столба; Однако это привело к увеличению гемолиза и увеличение клеток свободный гемоглобин (рис. 2).

3. красных кровяных клеток нитрита сокращение

  1. Добавьте 1 mL PBS (рН 7,4) в 0.0345 g NaNO2 сделать 500 мм раствор нитрита. Разбавьте 500 мм NaNO2 250 мкм NaNO2 (25 x) путем последовательного растворения в PBS (рН 7,4).
  2. С помощью microsyringe, inject нитритов (40 мкл) через перегородки в образце венозная PRP и БС для достижения окончательного концентрации 10 мкм в целом 1 мл образца.
    Примечание: В этом эксперименте окончательный концентрации нитрита используется — 10 мкм.
  3. Инкубируйте образца при 37 ° C в течение 10 минут или дольше.
    Примечание: Отрегулируйте точную продолжительность РБК инкубации с нитрит, необходимых для сокращения максимальной нитриты для различных типов экспериментов.
  4. Удалите пробку и Пипетка 1 мл образца в пробки microcentrifuge.
  5. Центрифуга на 200 x g 3 мин при комнатной температуре.
  6. Пипетка 300 мкл тромбоцитов подвески от верхней части супернатант и смешать с ACD (рН 6,5) в соотношении 1:9. Отказаться от РБК Пелле.
  7. Центрифуга тромбоцитов подвеска на 500 x g 4 мин при комнатной температуре.
  8. 80 мкл буфера lysis ледяной (150 мм NaCl, 50 мм трис, 0,5% NP-40, рН 7,4) содержащий ингибитор протеазы гранулы коктейль III (1: 500) тромбоцитов.

4. западный Blotting VASP

  1. Загрузите 15 мкг белка из каждого образца 2 отдельных гелях SDS-PAGE 10%.
    Примечание: Суровые зачистки буфер, который содержит b меркаптоэтанол, нельзя удалить P-VASPSer239 и VASP антитела от мембраны; Таким образом P-VASP Ser239 и VASP следует запускать отдельно.
  2. Запустите гели на 120 V 1.30 ч и передачи на нитроцеллюлозную мембрану.
  3. Блок-неспецифический привязка с 5% обезжиренное сухое молоко.
  4. Проинкубируйте мембрану с P-VASPSer239 (1: 500), VASP (1:1, 000) и GAPDH (1:1, 000) на ночь при 4 ° C.
  5. Инкубируйте хрен пероксидазы (ПХ) вторичные антитела с мембраной для 45 мин при комнатной температуре.
  6. Разоблачить мембраны с машиной тепловизор и количественно определить плотность группы с помощью ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пробы венозной крови имеют Ро2 значения между 50-80 мм рт.ст.. Обескислороживания, гелий быстро уменьшается Ро2 в 25 мм рт.ст, в течение 10 мин увеличение обескислороживания время чуть дальше уменьшается по2. Однако, увеличение времени обескислороживания также приводит к значительно повысить уровень свободных клеток гемоглобина (определяется оксиметрического, визуально видно на рисунке 2 как все чаще красную окраску плазмы) (<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Так как тромбоциты активируются легко, щадящая обработка тромбоцитов, содержащего образцы не требуется. Следует избегать быстро закупорить и энергичные встряхивания. Тромбоцитов ингибиторы, такие как простациклин (PGI2) может использоваться для предотвращения активации тромбоцитов; Однако это может повлиять на некоторые сигнальные пути внутри тромбоцитов. Для подготовки гранулы тромбоцитов мы добавить ACD тромбоцитов суспензий и использовать низкая скорость центрифугирования.

Свежеп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Д-р Алан Schechter указан как соизобретателем на несколько патентов, выданных в национальных институтов здравоохранения для использования Нитриты соли для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Он получает роялти, основанные на низ лицензирования этих патентов для развития клинической, но не другие компенсации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась интрамуральных гранта NIH д-р Алан н. Шехтер.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тритри-цитратнатрия Поставка банком
Лимонная кислотаПоставка банком
ГлюкозаSigmaG7528-250G
NaCl; хлорид натрияSigmaS-7653 1кг
<суб>2PO<суб>4; фосфат натрия моноосновный, моногидратMallinckrodt Chemical7892-04
KCl; хлорид калияMallinckrodt Chemical6858
NaHCO3; бикарбонат натрияMallinckrodt Chemical7412-12
HEPES; N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[-этансульфоновая кислота]SigmaH3375-500g
MgCl2 (1 M); хлорид магнияQuality Biology351-033-721
CaCl2; хлорид кальцияSigmaC5080-500G
Nalgene Узкое горлышко HDPE Экономичные бутылкиNalgene2089-0001
Red septum стопор NO29FisherbrandFB57877
NaNO2-; нитрит натрияSigmaS2252-500G
TRIZMA Base; Трис[гидроксиметил]аминометанSigmaT8524-250G
NP-40; 4-нонилфенил-полиэтиленгликольSigma74385-1L
Набор ингибиторов протеазы IIICalbiochem539134
Phospho-VASP (Ser239) антителоТехнология клеточной сигнализации3114
GAPDH (14C10) Rabbit mAbКлеточная сигнальная технология2118
2-меркаптоэтанолSigmaM-6250-10ml
Пероксидаза AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Laboratories111-035-003
Clarity Western ECL SubstrateBIO-RAD1705060-200мл
CO-оксиметр (ABL 90 flex)Радиометр
крови NIHкрови NIH VASP антитело Технология клеточной сигнализации 3112

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
  2. Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
  3. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
  4. Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
  5. Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
  6. Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435(2014).
  7. Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
  8. Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380(2012).
  9. Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
  10. Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
  11. Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
  12. Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747(2018).
  13. Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
  14. Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи