Методическая статья

Идентификация мыши и репертуаров человека антитела путем Sequencing следующего поколения

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58804

⸱

15 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE, Hokkaido University, 9Department of Immunology, National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протоколы для анализа и визуализации структуры и Конституции репертуаров всего антитела. Это включает в себя приобретение огромные последовательностей РНК антитела, с помощью следующего поколения последовательности.

Аннотация

Огромную приспособляемость признания антигена антитела является основой приобретенной иммунной системы. Несмотря на наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе производства огромного репертуара антител, приобретенной иммунной системы, он не еще удалось прибыть в глобальное представление о полной антитела репертуар. В частности репертуары клетки B рассматриваются как черный ящик из-за их астрономическое количество антител клонов. Однако секвенирование нового поколения технологии позволяют прорывы увеличить наше понимание клетки B репертуар. В настоящем докладе мы опишем простой и эффективный метод, чтобы визуализировать и анализировать весь отдельных мыши и человеческих антител репертуары. Иммунных органов репрезентивно из селезенки мышей и мононуклеаров периферической крови в организме человека, всего РНК был подготовлен, обратной транскрипции и усиливаются с помощью метода 5'-гонки. Используя универсальный грунт вперед и антисмысловых грунтовки для постоянной доменов класс специфического антитела, антитела mRNAs были равномерно усиливается в пропорциях, отражающие их частоты в популяциях антитела. Ампликонов были упорядочены с помощью следующего поколения последовательности (НГС), давая более 105 антитела последовательности на иммунологические сэмпл. Мы описываем Протоколы антитела последовательности анализов, включая аннотации V (D) J-ген сегмента, птичьего репертуара антител, и наши вычислительные методы.

Введение

Антитело система является одной из основ приобретенной иммунной системы. Это очень мощный против вторжения патогенных микроорганизмов из-за его огромного разнообразия, тонкой антигена признание специфики и клоновых расширения антиген специфические клетки. Репертуар антител продуцирующие клетки B оценивается в более чем 1015 в одном отдельных1. Это огромное разнообразие генерируется с помощью VDJ рекомбинации генов иммуноглобулинов генетических локусов2. Описание всей клетки B репертуаров и их динамические изменения в ответ на антиген иммунизации поэтому является сложной, но существенно важное значение для полного понимания реакции антитела против вторгаясь патогенов.

Из-за их астрономических разнообразия клетки B репертуаров было рассматривать как черный ящик; Однако появление NGS технологий позволило прорывы для углубленного понимания их сложности3,4. Антитела весь репертуар успешно анализируются сначала в zebrafish5, затем мышей6и люди6,7. Хотя NGS теперь стал мощным инструментом в изучении адаптивного иммунного ответа, отсутствуют основные анализ общих черт и различий в репертуар антитела среди отдельных животных.

В мышей было сообщено, что репертуаров IgM почти идентичны между людьми, в то время как те IgG1 и IgG2c существенно отличаются между лицами8. В дополнение к V-ген профиль использования наблюдаемая частота VDJ-профиля в наивной периферийные клетки B очень похож между лицами8. Анализ аминокислотных последовательностей VDJ-региона также показал возникновение же соединительной последовательностей в разных мышей намного чаще, чем ранее мысли8. Эти результаты показывают, что механизмы для формирования репертуара антител может быть детерминированным, а не стохастические5,8,9. Процесс развития репертуара антител у мышей также успешно проанализирован с помощью NGS для дальнейшего подчеркнуть потенциал NGS для выявления антител иммунной системы в деталях10.

В настоящем докладе мы опишем простой и эффективный метод, чтобы визуализировать и анализировать репертуара антител на глобальном уровне.

Протокол

Все эксперименты на животных были выполнены согласно институциональных руководящих принципов и с одобрения Национального института инфекционных болезней животных ухода и использования Комитета. Был получен выборки получения от здоровых взрослых добровольцев, как представитель результат в настоящем докладе, была выполнена с одобрения Комитета по этике Национального института инфекционных болезней, Токио, Япония и письменного информированного согласия от каждого участника с помощью Комитет утвердил форму этики.

1. грунтовка дизайн

  1. Дизайн универсальный вперед грунтовка для cDNA усилить иммуноглобулин мРНК без отклонений от праймеры PCR, как оно используется в 5'-гонки11,12 и13 методов смарт-PCR.
  2. Для амплификации генов иммуноглобулинов VH дизайн последовательности класс специфического иммуноглобулина в регионе постоянно как обратный грунтовки8,14 (рис. 1A).
    Примечание: Мультиплекс тег последовательности можно добавить к любому из этих Праймеры для пометки библиотеки молекул из источников различных образцов. Последовательности для вложенных PCR также могут быть добавлены, по словам руководства используется комплект15.
Универсальная грунтовка вперед5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
Обратный Праймеры для мыши иммуноглобулины (Ref.8)
IgM_CH1:5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 '
IgG1_CH1:5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 '
IgG2c_CH1:5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 '
IgG3_CH1:5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3'
IgA_CH1:5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'
Igκ_CH1:5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 '
Igλ_CH1:5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 '
Обратный Праймеры для человека иммуноглобулины (Ref.14)
IgM_CH1:5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 '
IgG_CH1:5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 '
IgD_CH1:5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 '
IgA_CH1:5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 '
IgE1_CH1:5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 '
IgE2_CH1:5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 '
Igκ_CH1:5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 '
Igλ_CH1:5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 '

Таблица 1: Грунтовка последовательности для ПЦР амплификация иммуноглобулинов

2. Нуклеиновые кислоты изоляции от иммунных клеток и тканей

Примечание: Процедура ниже предназначен для извлечения нуклеиновые кислоты от Хандра мыши. Однако это применимо к другим иммунной тканей и клеток человека как лимфатических узлов или мононуклеаров периферической крови (получения) (рис. 1B).

  1. Вскрыть ткани, например, хандра мыши C57BL/6 8-недельных и передать его через сетку из нержавеющей стали (200-400 мкм) с 2 мл буфера PBS для получения рассеянных клеток. Передать суспензию клеток пробки microcentrifuge 2.0 мл и центрифуги для 5 мин на 600 × g и 4 градусов. Выбросите супернатант.
  2. 800 мкл ACK лизировать буфер (150 мм NH4Cl, 1 мм KHCO3, 0,1 мм Na2ЭДТА, рН 7,2) Пелле и Инкубируйте на льду за 2 мин до лизируют красных кровяных клеток в тканях.
  3. Вымыть клетки ткани с 2 мл PBS 3 x, затем центрифугированием на 5 мин на 600 × g и 4 градусов.
  4. 800 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола/гуанидина Пелле, вихревой тщательно и инкубировать на уровне около 25 ° c за 5 мин.
  5. Добавить хлороформ (200 мкл), встряхнуть вручную для 15 s и затем проинкубируйте 2 мин на около 25 градусов.
  6. Отдельные этапы центрифугированием 15 мин на 12 000 × g и 25 градусов и передать свежие трубки верхняя водной фазе.
  7. Добавьте один объем 70% этанола, вихревой кратко и применить его к столбце спин кремнезема.
  8. Элюировать РНК с 30 – 100 мкл воды.
  9. Quantitate начальной концентрации РНК с помощью флуориметр (Таблица материалов).
  10. Храните очищенную РНК в-80 градусов.

3. синтез cDNA и амплификации PCR

Примечание: Описанный ниже метод основан на 5'-гонки11,12 и смарт-ПЦР методы13. Детали и оптимизации реакции описаны в руководстве комплект 15. Исходными материалами для иммуноглобулина мыши являются примерами из шага 2.10. Исходными материалами для человеческого иммуноглобулина являются примерами из человеческих тканей, ex. КСДОР, как описано в шагах 2.3 до 2.10.

  1. Синтез cDNA перв стренги от 2 до 10 мкг общего шаблона РНК, используя праймер компакт-дисков 5'-гонка (олиго dT содержащих) и смарт-ПЦР олигонуклеотида (Таблица материалов) согласно инструкциям производителя15.
    1. Для мыши иммуноглобулинов, ПЦР усиливают cDNA с высокой точностью ДНК-полимеразы используя универсальный грунт вперед и иммуноглобулинов класса специфические праймеры обратный (Таблица 1). Установить тепловой Велоспорт условия как: 94 ° c в течение 2 мин, затем 40 циклов 94 ° c за 30 s, 59 ° c за 30 s и 72 градусов за 30 сек, затем окончательное расширение шаг в 72 ° c за 5 мин.
      Примечание: Типичный эксперименты усиливают классов иммуноглобулинов IgM, IgG1, IgG2c, Igk и Igl взглянуть на наивных, зависящих от Th1 и B Th2-зависимых клеток (рис. 3).
    2. Для человеческого иммуноглобулина выполните 1st ПЦР, используя универсальный грунт вперед и иммуноглобулинов класса специфические праймеры обратный (Таблица 1) с последовательностями тег. Включить индекс последовательности для каждого образца, 2nd ПЦР с использованием индекса последовательности грунтовки. Используйте следующие условия PCR и полимеразы Taq: 94 ° c на 2 мин, 21 циклы (1st ПЦР) или 32 циклов (2nd ПЦР) на 94 ° c за 30 s, 59 ° c за 30 s, 72 градусов за 30 s.
      Примечание: Типичный эксперименты усиливают IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (IgA1 и IgA2), МГЭ, Igk и Igl иммуноглобулинов классов взглянуть на все клетки B населения (рис. 4).
  2. Electrophorese продуктов ПЦР на геле агарозы и очистить 600 до 800 bp фрагментов с помощью кремнезема мембраны спин столбца.
    1. Electrophorese образец из 3.2.1 и 3.2.2 на 2% агарозном геле.
    2. Визуализировать ДНК полос на трансиллюминаторе и акцизных гель фрагмент, содержащий широкая полоса между 600 до 800 bp.
    3. Добавьте 10 мл раствора привязки мембраны на 10 мг геля фрагмента. Смешать и Инкубируйте на 50-65 ° C до тех пор, пока гель ломтик полностью не растворится.
    4. Передача решения гелем на кремний мембраны спин столбца. Один раз промойте отмывающего буфера и элюировать ДНК с 50 мл нуклеиназы свободной воды (Таблица материалов).
  3. Количественно очищенный ампликонов с флуориметр и бассейн ампликонов от каждого класса иммуноглобулинов в равных количествах для секвенирования NGS.
    Примечание: Как правило, 2-10 мг ампликон ДНК была восстановлена для каждого класса иммуноглобулинов. Смешайте каждого образца решения одинаково в количестве ДНК, чтобы дать подъем 50 мл раствора содержат 10-20 нг ДНК/мл.
  4. Определите размер и концентрации библиотек с помощью микро капиллярная основе электрофорез с ДНК калибровки чип (Таблица материалов). Хранить библиотек на уровне - 20 ° C.

4. NGS Sequencing библиотек

  1. Создания SampleSheet.cvs для последовательности выполнения задание образца имени, данные индекса и поручить, чтобы получить только .fastq файлы.
  2. Оттепель реагент картриджа (Таблица материалов) и библиотек.
  3. Сделать 0,2 N NaOH и разбавленных библиотек для получения желаемой молярной концентрации.
  4. Сполосните и высушите в ячейку потока. Добавьте 600 мл разбавленной и денатурированные библиотека раствора в скважину реагент картриджа.
  5. Начало последовательности выполнения.

5. контроль качества данных NGS

  1. Выполните контроль качества FASTQ данных с использованием «FASTX-инструментарий»16.
    Примечание: Базовый пример настройки параметров используется является следующим:
    fastq_quality_trimmer - v -т 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
    fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
    fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
  2. Формат выходных файлов для «fasta нуклеиновой кислоты (.fna)» следующую команду:
    fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]

6. Извлечение и анализ последовательностей иммуноглобулин из .fna данных

Примечание: Пример программы были реализованы в среде UNIX. Пожалуйста, используйте их как пример ссылки потому, что производительность может зависеть от операционной системы и аппаратной среды. Авторы не несет никакой ответственности за ошибки или упущения. Языки программирования, Perl17, R18и необходимые модули должны быть установлены согласно инструкции на указанных сайтах. IgBLAST программы должны быть установлены согласно инструкции на соответствующий веб-сайт19,20.

  1. Скачайте следующие примеры собственных программ для анализа репертуар от https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
    03_PipeLine_Mouse.zip; Набор примеров программ для анализа последовательностей антитела мыши.
    05_PipeLine_Human.zip; Набор примеров программ для анализа последовательностей человеческих антител.
  2. Экстракт, антитело читает в последовательности данных: Извлеките иммуноглобулина (Ig) последовательностей каждого класса Ig из данных (.fna), Perl-программа, которая ищет подпись последовательностей в каждом постоянном регионе иммуноглобулина (Таблица 2).
    1. Для мыши генов иммуноглобулинов тяжелой цепи (IgH) экстракт читает следующую команду:
      $ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [ввода имя файла] [имя выходного файла (суффикс)]
    2. Легкие цепи иммуноглобулинов мыши (IgL) гены экстракт читает следующую команду:
      $ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [ввода имя файла] [имя выходного файла (суффикс)]
    3. Иммуноглобулин человека генов тяжелой цепи (IgH) экстракт читает следующую команду:
      $ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [ввода имя файла] [имя выходного файла (суффикс)]
    4. Иммуноглобулин человека лёгкие цепи (IgL) генов экстракт читает следующую команду:
      $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [ввода имя файла] [имя выходного файла (суффикс)]
  3. Аннотации и проверьте производительность V (D) J рекомбинации генов:
    Примечание: Описанный ниже метод использует автономный IgBLAST19 для аннотации сегментов гена V (D) J в последовательности. Установите базу данных для V (D) J гены и настройки параметров для IgBLAST как описано20.
    1. Аннотируйте тяжелой цепи (IgH) генов иммуноглобулинов мыши следующую команду:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-организм мышь - domain_system imgt-запросов. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
    2. Аннотируйте лёгкие цепи (IgL) генов иммуноглобулинов мыши следующую команду:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-организм мышь - domain_system imgt-запросов. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
    3. Аннотируйте генов человеческого иммуноглобулина тяжелой цепи (IgH) следующую команду:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-организм человека - domain_system imgt-запросов. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
    4. Аннотируйте генов человеческого иммуноглобулина лёгкие цепи (IgL) следующую команду:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-организм человека - domain_system imgt-запросов. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
  4. Визуализируйте глобальные особенность репертуара антител.
    1. Визуализируйте репертуар IgH мыши следующую команду:
      $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
      Примечание: Входной файл является filename.fna (последовательность данных), предпочтительно выходной файл из 6.2.1. Этот файл необходимо поместить в нижний директорию (папку) под названием «filename». В линии 50 сценарий оболочки назначьте «filename» для Para_4.
    2. Визуализация человека репертуар IgH следующую команду:
      $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
      Примечание: Входной файл является filename.fna последовательности данных, предпочтительно выходного файла раздела 6.2.3. Этот файл должен быть помещен в нижнем директорию (папку) это имя — «filename». В линии 46 сценарий оболочки назначьте «filename» для Para_4.
    3. Визуализируйте репертуар IgL мыши следующую команду:
      $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
      Примечание: С этой трубопровода, Igk Igl обрабатываются и сопутствующе обстоятельств. Входной файл является filename.fna (последовательность данных), предпочтительно выходной файл из 6.2.2. Этот файл должен находиться в нижней директорию (папку) под названием «filename». В строке 53 сценарий оболочки назначьте «filename» для Para_4. Имя выходного файла, заканчивая «_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt» дает координаты для двумерной диаграммы (рис. 3, IgL).
    4. Визуализация человека репертуар IgL следующую команду:
      $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
      Примечание: С этой трубопровода, Igk Igl обрабатываются и сопутствующе обстоятельств. Входной файл является filename.fna последовательности данных, предпочтительно выходного файла 6.2.4. Этот файл необходимо поместить в нижний директорию (папку) под названием «filename». В строке 53 сценарий оболочки назначьте «filename» для Para_4. Имя выходного файла, заканчивается с «_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt» дает координаты для двумерной диаграммы (Рисунок 4, IgL).

Результаты

Репертуар антитела мыши

Перспектива мышиных антител репертуар в целом можно получить от клеток или тканей, таких как селезенки, костного мозга, лимфатических узлов или крови. Рисунок 3 показывает представитель результаты IgM, IgG1, IgG2c и иммуноглобулина лёгкие цепи (IgL) репертуар от Хандра мыши наивными. В таблице 3приводится краткая сводка чтения чисел. Например 166,175/475,144 считывает содержащиеся IgM конкретных подписей последовательности (Таблица 2) и 133,371/166,175 чтений были VDJ-продуктивной выведен на IgBLAST19.

Рисунок 3 показывает репертуар профиль VDJ-перестановка по 3D-VDJ-сюжет, в котором размер каждого мяча представляет относительное количество операций чтения; Иными словами количество антител mRNAs в целом B клеток. 3-D Сетка состоит из 110 IGHV, 12 IGHD и 4 IGHJ, которые выровнены на отражает их порядок в хромосоме. Кроме того гены, неоднозначно присвоенный IgBLAST были собраны отдельно в последней позиции для каждой IGHV, IGHD и IGHJ линии, что привело к 7,215 узлам в кубовидной.

Кроме того показано на рисунке 3 2D-VJ-сюжет показывает профиль VJ-перестановка в репертуаре IgL. Длина каждого бара на этом участке представляет относительное количество считываний. Ось x представляет 101 IGLVκ и 3 IGLVλ генов, а ось y 4 IGLJκ и 3 IGLJλ генов. Unannotated V-J-генов и представлены на правой границе.

Взаимодополняемость определение региона 3 (CDR3) последовательности этих продуктивных чтений, которые дают основания для большинства антиген связывая специфичности, даны в IgBLAST мероприятий. CDR3, которые могут быть статистически проанализированы последовательностей, включая биологические или технических реплицирует, как описано ранее8,10.

Репертуар человека антитела

С точки зрения человеческих антител репертуар в целом могут быть проанализированы из различных тканей, включая мононуклеаров периферической крови (получения) или патологических тканей. Рисунок 4 показывает представительных результатов IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) всего, всего IgA (IgA1 и IgA2), IgD, IgE и IgL репертуар от обычных репликацию. Резюме чтения чисел это показано в таблице 3. Например 90,238/1,582,754 считывает содержащиеся IgM конкретных подписи последовательности и 67,896/90,238 читает были VDJ-продуктивной.

Репертуар профиль VDJ перегруппировки показан на 3D-VDJ-сюжет, в котором размер каждого мяча представляет относительное количество операций чтения; Иными словами количество мРНК антитела от всей репликацию (рис. 4). 3-D Сетка состоит из 56 IGHV, 27 IGHD и 6 IGHJ, выравниваются в порядке, в котором они появляются на хромосоме. Кроме того гены, неоднозначно присвоенный IgBLAST представлены отдельно в последней позиции для каждой IGHV, IGHD и IGHJ линии, что привело к 11,172 узлам в кубовидной.

Профиль VJ-перестановка в репертуаре IgL изображен в 2D-VJ-сюжет, в котором длина каждого бара представляет относительное количество операций чтения (рис. 4). Ось x представляет 41 IGLVκ и 32 IGLVλ генов, а ось y представляет 5 IGLJκ и 5 IGLJλ генов. Удаления заметки V-J-генов и представлены на правой границе.

Человека последовательности CDR3 даны в IgBLAST выходы и могут быть проанализированы статистически, как описано ранее,8,10.

Иммуноглобулинов классаЧувствоAntisense
Тяжелые цепи иммуноглобулинов мыши (C57BL/6)
IgMAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCGACATTTGGGAAGGACTGACT
IgG1AAAACGACACCCCCATCTGTCGACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(IgG1 вариант)AAAACAACACCCCCATCAGTCGACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2cAAAACAACAGCCCCATCGGTCGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgG3GTGATCCCGTGATAATCGGCTAGCCGATTATCACGGGATCAC
IgATCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
Легкие цепи иммуноглобина мыши (C57BL/6)
IgκCTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGCTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ2TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGCTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ3TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGCTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA
Igλ4TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGCTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA
Иммуноглобулин человека тяжелые цепи
IgMGGGAGTGCATCCGCCCCAACGTTGGGGCGGATGCACTCCC
IgGGCTTCCACCAAGGGCCCATCGATGGGCCCTTGGTGGAAGC
IgAGCATCCCCGACCAGCCCCAAGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgDGCACCCACCAAGGCTCCGGATCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
МГЭGCCTCCACACAGAGCCCATCGATGGGCTCTGTGTGGAGGC
Легкие цепи иммуноглобина человека
IgκACTGTGGCTGCACCATCTGCGCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1, 2, 6GTCACTCTGTTCCCGCCCTCGAGGGCGGGAACAGAGTGAC
Igλ3, 7GTCACTCTGTTCCCACCCTCGAGGGTGGGAACAGAGTGAC

Таблица 2: Краткое изложение иммуноглобулина подпись последовательностей

Мышь IgHВсего читаетIgMIgG1IgG2c
Вход475,144
МКГР содержащих166,175229,67136,628
VDJ-производственного133,371196,58331.446
Мышь IgLВсего читаетIgKappaIgLambda
Вход527,668
МКГР содержащих178,94821,446
VJ-производственного160,92416,988
Человека IgHВсего читаетIgMIgGIgAIgDМГЭ
Вход1,582,754
МКГР содержащих90,2385,29894,06175,5492932
VDJ-производственного67,896277578,20356,4953
Человека IgLВсего читаетIgKappaIgLambda
Вход1,582,754
МКГР содержащих120,31664,148
VJ-производственного97,16952,324

Таблица 3: Сводка чтения чисел в экспериментах

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое представление sequencing стратегии для анализа антител репертуаров отдельных мышей. (A) Общая РНК от иммунных клеток или тканей была обратной транскрипции и ПЦР усиливается с помощью универсальной вперед грунт и класс специфического иммуноглобулина вспять грунтовки. Ампликонов от каждого класса иммуноглобулинов были объединены и отображается для следующего поколения последовательности. (B) биологического реплицирует такие как селезенки от мышей C57BL/6 относились следующие: Общая RNAs были очищенного от образцов селезёнки, и cDNAs были усилены 5'-гонки, используя универсальный грунт и антитела класса специфического праймера. Затем они были вынесены для виртуализации нового поколения с маркировки Праймеры для отдельных мышей. Части рисунка заимствована из8 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: схема блок обработки данных для анализа антител репертуаров отдельных мышей. Ампликон читает, полученные после виртуализации нового поколения были обработаны следующим образом: (1) чтения последовательности были проверены на наличие антител подпись класс специфических последовательностей; (2) последовательностей были изучены для V, D, и J гена фрагменты с помощью IMGT/HighV-Quest и/или IgBLAST; (3 последовательностей, содержащих продуктивной VDJ Джанкшен были собраны; и (4) эти последовательности были использованы для анализа общего справочника функций, CDR3, и т.д. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: глобальные данные визуализации для репертуаров антитела мыши. Общий репертуар профили каждого антитела класса были визуализировать 3D-VDJ-участок. Ось x представляет 110 IGHV гены на хромосоме. Y - и z - оси представляет собой 12 IGHD и 4 IGHJ генов, соответственно. Объем сфер на каждом узле представляет количество считываний. Красные сферы: удаления заметки V, D и J гены. IgL читать дистрибутивы приведены на 2D-VJ-сюжет, в котором длина каждого бара представляет относительное количество считываний. Ось x представляет 101 x 3 генов x IGLVλ и IGLVκ, а ось y представляет 4 x 3 генов x IGLJλ и IGLJκ. Удаления заметки V и J гены представлены на правой границе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Визуализация глобальных данных для человека антитела репертуаров. Общий репертуар профили каждого антитела класса были визуализировать 3D-VDJ-участок. Ось x представляет 56 IGHV гены на хромосоме. Y - и z - оси представляет 27 IGHD и 6 IGHJ генов, соответственно. Объем сфер на каждом узле представляет количество считываний. Красные сферы: удаления заметки V, D и J гены. Читает IgL выстроились на 2D-VJ-сюжет, в котором длина каждого бара представляет относительное количество считываний. Ось x представляет 41 x 32 генов x IGLVλ и IGLVκ, а ось y представляет 5 x 5 генов x IGLJλ и IGLJκ. Удаления заметки V-J-генов и представлены на правой границе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Метод, описанный здесь NGS использует для антитела РНК, усиливаются с помощью метода 5'-гонки. В отличие от методов, использующих вырожденный 5'-VH гена грунты мРНК каждого антитела класса усиливаются, равномерно с помощью универсальной вперед грунтовки. Кроме того использование антисмысловых грунтовки конкретных для региона константа 1 (CH1) ген антител позволяет репертуар профилирование конкретного иммуноглобулинов классов. Это очень полезно для рассечения класс специфических антител ответ, а также для сравнения наивными и прививки репертуаров8,9.

Наиболее вероятным ловушкой метода является нехватка усиливается иммуноглобулина сообщений. Глубина репертуара антител, полученные этим протоколом существенно зависит от амплификации PCR, описанных в пунктах 3.1 и 3.2. Если глубина репертуар не получается правильно, изменив коэффициенты шаблон cDNA и грунтовки в шагах 3.2.1 и 3.2.2 настоятельно рекомендуется.

Как правило около 20% читает антитела, производимые NGS являются неоднозначной последовательности21. Даже с создана «методы коррекции», остаются неоднозначными35-10%. Мы, таким образом, анализ последовательности и фильтруют сырье читает, содержащий подпись последовательности, соответствующей постоянной регионов иммуноглобулина (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1 и т.д.). Поэтому анализ соматических гипер мутации потребностей тщательное обследование.

Один из недостатков этого метода является что иммуноглобулин тяжелые и легкие цепи пара может быть выведен. Отсюда представление репертуар, полученные этим методом не является целостный. Однако это возможно для приближенного топ рейтинге пар путем статистического анализа данных10. Кроме того Роман метод последовательности пар иммуноглобулина было недавно сообщено3,4.

Иммуноглобулин последовательностей в выходных данных .fna были извлечены на основании наличия иммуноглобулина геном подписи последовательностей. V, D и J гена, которую сегменты были затем Аннотированная и производительности V (D) J перестановок были оценены. Область определения взаимодополняемости 3 (CDR3) были также аннотированных последовательностях. Эти систематические экзамены иммуноглобулина последовательностей в данных .fna пользой были предоставлены23,22,IMGT/HighV-квест сервера24. Однако строительство трубопровода автоматизированной обработки имеет заслуги для анализа крупных экспериментальных данных. Конвейер, настроенные для каждой цели можно настроить с помощью отдельного протокола IgBLAST19. Этот подход требует программирования грамоте, но очень полезно для подробного анализа системы иммуноглобулин. Трубопроводов, в описанный являются примерами настраиваемого протокола (рис. 2).

Количество антител читает, дается пропорциональна количество антител РНК в образце, отражающие антитела составляющие антитело системы на время точки5,8,25. Метод, описанный здесь дает птичьего полета V (D) J Конституции репертуара антител, с использованием R-программы-8,-18,-26.

Глобальное представление IgM антител репертуаров отдельных наивно мышей показало высоко сохранены VDJ профиля по сравнению с теми IgG1 или IgG2c8. Было сообщено, что VDJ комбинации незрелых данио рерио, весьма стереотипные9. В отличие от человека VDJ комбинации сообщается чрезвычайно неравномерное6. Весьма сохранены детерминированной VDJ-профили в наивный B клетки являются вероятно либо порожденных перекос VDJ-перестановки или отрицательный отбор с авто антигены, представленные в организме. Например IGHV11-2 выражается преференциально в плода IgM репертуар27 и это преобладание приписывается autoreactivity IGHV11-2 против стареющей эритроцитов27. Интересно, что IGHV11-2 было также наиболее распространенных основных репертуар в нашем анализе опубликованных ранее наивных IgM8.

Метод, описанный здесь полезен для расшифровки репертуаров антиген отзывчивым антитела включительно анализируя антитела репертуар пространства, созданного в отдельных органах, избегая непреднамеренное упущение ключевых антитела репертуаров8, 10. Этот метод также позволяет изучение подробных антитела сети динамизм, который облегчит ускорить открытие защитных антител против новых патогенных организмов.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от АМЕДА под Грант номер JP18fk0108011 (KO и SI) и JP18fm0208002 (TS, KO и YO) и субсидий от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии (15K 15159) для KO. Мы благодарим Саюри Ямагучи и Satoko Сасаки за ценную техническую помощь. Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) для английского языка редактирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл Полоски ПробиркиThermo Fisher ScientificAB0452120 полосок
100.н. Лестницадля ДНК TOYOBODNA-0350,5 мл
2100 Биоанализаторные системыAgilent TechnologiesG2939BA /2100
Уксусная кислотаWako017-00256500 мл
Агароза, NuSieve GTGLonza50084
Аммоний ХлоридWako017-02995500 г
ХлороформWako038-02606500 мл
PBS Дульбекко (-)" Ниссуи»НИССУИ 08192
Этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота дигидрат соли динатрия (2NA)Wako345-01865500 г
Falcon 40 &микро; m Сетчатый фильтрFalcon35234050/Case
ling lock tube 1,7 мл bmequipmentbm-15
ling lock tube 2,0 млbm equipmentbm-20
MiSeq Reagent Kit v2illuminaMS-102-2003500 циклов
MiSeq SystemilluminaSY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Гидрокарбонат
калияWako166-03275500 г
PureLink RNA Mini Kitlife technologies12183018A
Qubit 3.0 ФлуориметрThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS Набор для анализаThermo Fisher ScientificQ32854500 анализов
УМНАЯ ГОНКА 5'/3' Комплект Clontech 
TaKaRa Ex Taq Версия для горячего старта Такара Био Инк. RR006A 
Тризма базаSigmaT60661 кг
реагента ТРИзолAmbionThermo Fisher Scientific15596026100 мл
Ультра прозрачные капсулы для количественной ПЦРThermo Fisher ScientificAB0866120 полосок
Ультрачистый бромид этидияThermo Fisher Scientific15585011
Wizard SV Гель и система очистки ПЦР Promega А9282
634858

Ссылки

  1. Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
  2. Tonegawa, S. Somatic generation of antibody diversity. Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).
  3. Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
  4. Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
  5. Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
  6. Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365(2011).
  7. Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
  8. Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
  9. Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
  10. Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
  11. Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
  12. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
  14. Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
  15. SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
  16. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
  17. Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
  18. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  19. Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
  20. IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
  21. Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404(2011).
  22. Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
  23. Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
  24. IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
  25. Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
  26. rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
  27. Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

V D J5 RACE

Похожие статьи